图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：（1）EcoRV酶切位点-组卷网

题型：非选择题-解答题难度：0.4 引用次数：207 题号：10005257

图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tet^r)和氨苄青霉素抗性基因（amp^r）。请回答下列问题：

（1）EcoRV酶切位点为

，EcoR V酶切出来的线性载体P1为___________末端。
（2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷酸。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。
（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_______________。

更新时间：2020-04-07 13:39:00 |

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【知识点】 DNA重组技术的基本工具解读目的基因的获取解读基因表达载体的构建解读

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解题方法

基因工程的基本操作程序分析 PCR技术的基本操作和应用分析

【推荐1】糖化酶是将淀粉转化为葡萄糖的酶，大部分野生酵母菌因缺乏糖化酶基因而不能直接利用淀粉。研究人员将经诱变处理后获取的黑曲霉菌高产糖化酶基因导入毕赤酵母GS115（对氨苄青霉素不敏感）中，构建能直接利用淀粉的工程菌，该过程所用质粒（仅示部分结构）如图1所示。三种限制酶的识别序列及切割位点见表，请回答下列问题。

限制酶	BamHI	PstI	XbaI
识别序列和切割位点（5’→3’）	G^↓GATCC	C^↓TGCAG	T^↓CTAGA

(1)为获得糖化酶高产菌株，研究人员将经诱变处理后的黑曲霉菌接种到_______含量高的培养基上，恒温培养适宜时间后滴加碘液，挑选出透明圈（不产生蓝色）直径________（填“较大”或“较小”）的菌株。再进行复筛以及稳定性遗传实验。
(2)构建高产糖化酶基因表达载体时，用限制酶切割质粒pPIC9K，图2是高产糖化酶基因示意图（仅示部分碱基），为使其能定向插入表达载体并成功表达，应在引物的__________（5'或3'）端添加__________酶识别序列，则PCR扩增时引物的碱基序列应为下列①-⑥中的_________。若扩增4次，不同时含两种引物的DNA分子有_______个。

(3)将筛选出的菌株接种至发酵罐内进行扩增，在接种环节要对培养基和发酵设备进行严格灭菌以防止杂菌污染的原因是_________（答出一点即可）。培养过程中可定期取样并常用_______（仪器名称）对菌体进行直接计数，以评估增殖情况。如发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束后采用_______（答出1项即可）等方法获得所需的发酵产品。

2024-04-27更新 | 359次组卷

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真题

【推荐2】斑马鱼的酶D由17号染色体上的D基因编码。具有纯合突变基因(dd)的斑马鱼胚胎会发出红色荧光。利用转基因技术将绿色荧光蛋白(G)基因整合到斑马鱼17号染色体上，带有G基因的胚胎能够发出绿色荧光。未整合G基因的染色体的对应位点表示为g。用个体M和N进行如下杂交实验

（1）在上述转基因实验中，将G基因与质粒重组，需要的两类酶是______和______。将重组质粒显微注射到斑马鱼__________中，整合到染色体上的G基因_____后，使胚胎发出绿色荧光。
（2）根据上述杂交实验推测
①亲代M的基因型是___________(选填选项前的符号)。
a. DDgg b. Ddgg
②子代中只发绿色荧光的胚胎基因型包括___________(选填选项前的符号)。
a. DDGG b. DDGg c. DdGG d. DdGg
（3）杂交后，出现·绿荧光(既有红色又有绿色荧光)胚胎的原因是亲代__________(填
“M”或“N”)的初级精(卵)母细胞在减数分裂过程中，同源染色体的__________发生。
了交换，导致染色体上的基因重组。通过记录子代中红绿荧光胚胎数量与胚胎总数，可计算得到该亲本产生的重组配子占其全部配子的比例，算式为____________

2019-01-30更新 | 1808次组卷

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非选择题-解答题 | 较难 (0.4)

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【推荐3】1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。人胰岛素基因表达的最初产物是一条肽链构成的前胰岛素原，经下图1所示的过程形成具生物活性的胰岛素。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，表达出胰岛素原后再用特定酶切掉C肽段。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请据下图分析并回答下列问题：

(1)由于密码子具有_________ ，AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。____（填“AB”、“BCA”或“AB和BCA”）法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
(2)图2是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶__________的识别序列。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为-CCTTTCAGCTCA-，则其中一种引物设计的序列是5’____________3’。
(3)β-半乳糖苷酶可以分解无色的X-gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。经____________（处理方法），大肠杆菌与重组质粒混合培养一段时间后，将大肠杆菌接种到添加了氨苄青霉素和X－gal的培养基上筛选出__________色的菌落即为工程菌种。
(4)科学家利用蛋白质工程技术，研制出了赖脯胰岛素，与天然胰岛素相比，其皮下注射后易吸收、起效快。获得赖脯胰岛素基因的途径是：从预期的蛋白质功能出发→__________→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列。

2022-11-24更新 | 863次组卷

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非选择题-解答题 | 较难 (0.4)

【推荐1】苹果等果实的果肉细胞液泡中有丰富的无色的多酚类营养物质，其他一些囊泡结构中含有多酚氧化酶（PPO），催化多酚氧化成褐色物质，此过程称为果实褐变。科学家利用基因沉默技术培育了一种不褐变的转基因苹果。回答下列问题：
（1）将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是________________，该方法中需将目的基因插入到农杆菌的__________上。
（2）培育不褐变的苹果采用的是第二代基因工程技术，导入的是苹果细胞原本就有的多酚氧化酶基因（PPO基因），当细胞内有许多份PPO基因时，PPO基因________________形成的mRNA之间容易形成双链区而失去__________机会，从而导致多酚氧化酶含量大大减少。基因沉默分为转录水平的沉默（TGS）和转录后水平的沉默（PTGS），则培育不褐变苹果的转基因沉默属于__________（填“TGS”或“PTGS”）。
（3）可用__________酶从苹果基因组中切取PPO基因，也可用PCR技术从苹果基因组中克隆出PPO基因，则要实现PCR定点克隆DNA片段，最关键的是设计__________。

2018-02-20更新 | 164次组卷

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名校

【推荐2】甜玉米与普通玉米相比，甜玉米中可溶性糖向淀粉的转化较慢含可溶性糖量高，汁多质脆，富含多种维生素。为了使甜玉米更富有生产应用价值，科研人员通过转基因技术培育出了超量表达P蛋白转基因甜玉米。在超量表达P基因载体的构建中，所用DNA片段和Ti质粒的酶切位点如图1所示，P蛋白在玉米株系的表达量如图2所示。回答下列问题：

(1)组成强启动子的基本单位是______________，它驱动基因的持续转录。为使P基因在玉米植株中超量表达，应优先选用______________酶组合，将片段和Ti质粒切开后构建重组表达载体。
(2)外植体经______________形成的玉米愈伤组织放入农杆菌液浸泡后进行植物组织培养，培养基中需加入______________进行筛选，最终获得多个玉米株系a₁、a₂、a₃、a₄。通过对a₁、a₂、a₃、a₄，四株甜玉米株系的蛋白质表达量进行测定结果如图2，______________（填“能”或“不能”）说明a₄株系未导入重组质粒，原因是______________。
(3)真核基因的编码区含有内含子和外显子，下图3为淀粉酶合成基因片段，其转录后形成的前体RNA需通过剪接（切去内含子对应序列）和加工后方能用于翻译。

科研人员通过降低调控淀粉酶合成基因的表达实现提高甜玉米中可溶性糖的含量，吗啉反义寡核苷是RNA剪接抑制剂，注入植物细胞内会使基因表达受阻。为验证吗啉反义寡核苷能阻止前体RNA上内含子1的对应序列被剪切，科研人员将吗啉反义寡核苷酸导入玉米的受精卵作为实验组，设计相关实验，请完成下列表格：

操作流程	操作方法或操作要点
获取cDNA	从受精卵发育后3天的实验组和对照组胚细胞中提取总RNA，①______________形成cDNA。
扩增cDNA	以获得的cDNA为模板进行PCR时需加入引物②______________。
产物鉴定	用琼脂糖凝胶电泳技术鉴定PCR扩增后获得的产物
分析结果，得出结论	实验组有目的条带，对照组无目的条带，说明③______________。

(4)某次实验结果电泳发现：实验组和对照组都没有任何条带，从PCR操作过程角度解释可能的原因有______________（至少答出两点）。

2022-11-09更新 | 921次组卷

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【推荐3】我国科学家张道远先生通过从耐旱灌木白花柽柳中克隆得到TSOD基因，利用转基因技术转化到棉花中，获得了具备更强抗旱性的T₄代转基因棉花株系，如图为转基因抗旱棉花的培育过程示意图，请据图回答下列问题：

（1）①过程表示用PCR技术扩增目的基因的方法。②过程用到的工具酶有_________，步骤③一般用______________处理农杆菌，使其易吸收周围环境中的DNA分子。
（2）组成基因表达载体的单体是_____________，基因表达载体中的启动子是_________识别和结合的部位，这种结合完成后才能驱动目的基因合成mRNA。
（3）用两种限制酶XbaⅠ和SacⅠ(两种酶切出的黏性末端不同)切割某DNA，获得含目的基因的片段，若利用该片段构建基因表达载体，应选用的Ti质粒是下图中的__________（填序号）。

（4）将重组质粒导入棉花细胞除步骤③所示的方法外，还可采用______________（写出2种给满分）。
（5）外植体培养成为试管苗的过程采用了植物组织培养技术，利用____________________的原理，步骤⑤⑥分别表示______________________。
（6）为了确定抗旱转基因棉花是否培育成功，可先用放射性同位素标记的_____________作探针进行分子水平鉴定，再_______________________进行个体水平鉴定棉花植株的抗旱性。

2019-05-06更新 | 89次组卷

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【推荐1】2014年在西非多国爆发了埃博拉疫情。该病的病原体是埃博拉病毒（EBOV），是一种单链RNA病毒，特异寄生于人和灵长类细胞。
(1)若EBOV的一条RNA链中碱基A占31%，则G的含量为________。
(2)世界各国至今无针对该病毒的特效药，治疗患者主要采用支持治疗，即通过提高患者的_______________来对抗病毒，为防止病毒传染还需对患者进行______________。
(3)该病早期诊断可从患者血液标本提取RNA，再通过___合成DNA，再用___进行体外扩增，也可用___进行病毒的培养与分离，从免疫学角度看，这两种诊断方法检测对象都是____________。
(4)若要通过基因工程制备抗EBOV的疫苗，可获取EBOV外壳蛋白基因后，构建__________________，再导入受体细胞表达出疫苗的有效成分。当EBOV再次侵入已经免疫的机体后，__________会迅速增殖、分化，并产生大量抗体，这些抗体与游离的EBOV结合，阻止EBOV________________，进而被______________消化处理。

2016-11-26更新 | 172次组卷

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名校

【推荐2】如图为构建某重组质粒的过程示意图．lacZ 基因可使细菌利用加入培养基的物质 X﹣gal，从而使菌落显现出蓝色，若无该基因，菌落则成白色．图中甲﹣﹣戊 DNA 片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其它碱基的种类未作注明．

（1）若酶 M 特异性识别的 DNA 碱基序列是

，则酶 N 特异性识别的 DNA 碱基序列是______________________。
（2）过程②是将所有片段混合在一起，用___________酶拼接可得到不同的重组 DNA．
（3）如果只考虑 2 个片段的组合，那么甲、乙、丁三个片段中能够形成环状 DNA 的片段组合是_____。
A．甲和乙 B．甲和甲 C．甲和丁 D．乙和乙 E．乙和丁 F．丁和丁
（4）为了筛选含重组质粒的受体菌，应在培养基中额外加入______________培养一段时间，挑选出___________色的菌落进一步培养．原来质粒中，限制酶 M 和 N 的酶切位点应该位于___________。
A．M 位于青霉素抗性基因中，N 位于 lacZ 基因中
B．N 位于青霉素抗性基因中，M 位于 lacZ 基因中
C．M 和 N 都位于青霉素抗性基因中
D．M 和 N 都位于 lacZ 基因中
（5）上述目的基因能够在受体细菌中表达，其原因是不同生物______________________。

2019-01-17更新 | 130次组卷

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【推荐3】糖尿病已经成为危害人类健康的严重疾病之一，注射胰岛素是目前治疗糖尿病最为有效的途径和手段，如何生产优质而不昂贵的人胰岛素，是当下医疗界和制药界急需攻克的科学难题。如图为利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请回答：

（1）在基因表达载体中，____的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位，并驱动基因转录出mRNA。
（2）图中细胞1是____细胞。过程②必需的酶是____。过程③④⑤为____技术扩增目的基因，此过程必需的酶是________。过程③断开的化学键名称为____，在体外进行PCR操作时，实现该过程的处理方法是____。能否利用人的皮肤细胞来完成过程①为什么？___________________。
（3）图中B的基本组成单位有____种；为便于重组DNA的鉴定和选择，图中C的组成必须有____；将体外重组DNA导入大肠杆菌体内，并使其在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。为使过程⑧更易进行，可用____处理大肠杆菌，目的是使大肠杆菌细胞处于能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态（或使大肠杆菌处于感受态细胞状态）。由于重组DNA分子成功导入受体细胞的频率低，所以在转化后通常需要进行____操作。
（4）若过程⑨发生了变异，则此变异为____。过程⑩得到的人胰岛素需要体外加工才具有生物活性，原因是大肠杆菌___________________。
（5）目的基因在受体细胞中是否能转录出mRNA，可用____技术来检测。

2018-01-13更新 | 303次组卷

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