Science 铜死亡 | 铜离子通过靶向三羧酸循环途径中的脂酰化蛋白诱导细胞死亡
Hello，各位小伙伴们，今天老熊来讲讲这篇——美国Broad研究所Todd R. Golub研究组与Peter Tsvetkov合作于2022年3月在《Science》上发表题为Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins
这篇文章涉及到的知识点有点多，且听老熊细细道来
熊言熊语：聊聊背景
从细菌到人类细胞，对于整个动物界铜都是是必需酶的辅助因子，因此发挥重要作用。细胞内具有平衡机制，能够把铜浓度维持在比较低的水平，防止胞内游离铜的有害积累。铁死亡这杯羹好多人已经尝到了，那铜死亡又是什么鬼？
在这篇文章里，他们用了一个小分子工具——铜离子载体。顾名思义，能结合铜、将铜离子运到细胞里的小分子。所以第一步他们通过PRISM(profiling relative inhibition simultaneously in mixtures)去筛选这样的小分子，就筛到了Elesclomol，这个小分子能结合铜离子，带到胞内（图1A）。根据过去报道的文献来说，铜诱导的毒性机制还没有一个清晰的脉络，这些文献的关注点要么在细胞凋亡，要么就是诱导活性氧(ROS)产生等等，众说纷纭。
这篇文章，作者首先要明确的一个问题就是：铜离子载体的细胞毒性是否依靠的是铜本身？所以他们分析了载着不同金属离子的Elesclomol对细胞存活率的影响，可以看到，铜离子被Elesclomol带入细胞后，细胞活性明显下降，而其他的金属离子就没能引起细胞死亡(图1B)。这就说明铜离子载体诱导的细胞死亡靠的是细胞内铜积累，跟Elesclomol关系不大。
准备工作结束，下面就进入主线任务：
1、铜离子载体诱导一种独特形式的调节细胞死亡
接着他们想知道铜离子载体介导的细胞死亡是否受到调节，作者尤其关注短时间处理后造成的细胞毒性是否是不可逆的。所以他们用40 nM 的Cu-elesclomol 处理2 小时，然后换成新鲜培液，发现后面24 小时细胞就死了（图 1C）。说明铜介导的细胞死亡确实受到调节的一种死亡，也就是说存在信号级联的效应机制。那这种信号级联是通过什么呢？他们第一个就看了一下凋亡，检测了凋亡的marker caspase 3/7的激活情况，结果elesclomol诱导的细胞死亡不涉及 Caspase 3 /7激活或Caspase3剪切（图 1 D 和 E）。同样，敲掉凋亡通路中关键基因BAX和BAK1 (图1F)，或用Caspase抑制剂(Z-VAD-FMK和Boc-D-FMK)共处理时(图1G)，elesclomol的杀伤能力不变，说明铜死亡跟凋亡是两码事。在这个地方，作者也用了其他细胞死亡的抑制剂处理——包括铁死亡（Fer-1）、坏死（Nec-1）和氧化应激（N-乙酰半胱氨酸），热图中活细胞为红色，死细胞为蓝色。结果这些死亡形式统统被排除掉了，唯独用铜离子螯合剂（TTM）能抑制铜死亡，恢复细胞活性（图 1G），说明铜死亡是独立于已知细胞死亡途径的不同机制（图1H）。
2、线粒体呼吸调节铜离子载体诱导的细胞死亡
接下来，作者观察到了一个关键的线索：他们分别用含葡萄糖（参与糖酵解）和半乳糖（抑制了糖酵解，促进线粒体呼吸）的培液培养细胞，结果发现靠线粒体呼吸的细胞对Cu-elesclomol的敏感性是糖酵解细胞的近 1000 倍（图 2A）。这是啥意思？学过生化的都知道，无氧糖酵解和有氧线粒体呼吸是细胞中提供能量的两大主要方式，有氧情况下NADH与丙酮酸进入线粒体，然后走三羧酸循环产生能量；而当氧气不足时消耗NADH，常见的就是丙酮酸还原成乳酸和乙醇。
老熊查了一下文献，当细胞暴露在半乳糖环境下，会迫使细胞进行更多的氧化代谢，也就是线粒体呼吸，而不是糖酵解。
后面他们用线粒体电子传递链 (ETC) 复合物 I 和 II 的抑制剂以及线粒体丙酮酸摄取的抑制剂预处理，确实减弱了细胞死亡，而对铁死亡抑制剂ML162处理没有影响（图 2B）。然后他们又用线粒体电子传递链里复合物的抑制剂：鱼藤酮、抗霉素A、寡霉素和FCCP去处理细胞。结果只有线粒体解偶联剂 FCCP 对铜死亡没有影响，FCCP 在寡霉素后加入，是一种解偶联剂，加入后会破坏质子梯度和线粒体膜电位，破坏ATP的产生，所以这就说明说铜死亡依靠线粒体呼吸，但是跟ATP的产生没啥关系（图 2C）。
既然需要有氧呼吸，下面作者又分析了缺氧条件（1% O2）下细胞的活性，结果缺氧条件减弱了铜死亡，那这个跟HIF通路有没有关系呢？他们就在常氧条件下用 HIF 脯氨酰羟化酶抑制剂 FG-4592 强行稳定缺氧诱导因子（HIF）途径（21 % O2），但是并不能减轻细胞死亡（图 2D），说明铜死亡靠的是线粒体呼吸，跟HIF通路也没啥关系。那到底是啥影响了线粒体呼吸呢？作者测了OCR分析了线粒体氧化磷酸化功能，这个图老熊已经讲过了，想必我们也见过很多次了。
检测时一般先测定正常状态下的基础呼吸（basal respiration），然后加入寡霉素（oligomycin）抑制ATP合酶，这时OCR显著下降，仅余下质子渗漏（proton leak）造成的耗氧率。降低部分即为氧化磷酸化的耗氧率（ATP production）。加入解偶联剂FCCP后，电子传递失去质子梯度的约束，就会以最大速率进行。所以OCR急剧升高，达到最大耗氧量（maximal respiration）。此值与基础呼吸之差，称为呼吸潜力（spare respiratory capacity）。最后加入电子传递抑制剂，如抗霉素A（antimycin A），完全抑制电子传递，耗氧率降至最低。
我们可以看到图2E，用Cu-elesclomol处理并没有显著降低basal respiration基础呼吸或与 ATP-linked respiration （ATP 相关的呼吸），但确实显著降低了spare capacity of respiration（图 2E），这就说明铜离子不直接靶向电子传递链，而是 TCA 循环的组成部分（图 2F）。
3、FDX1和蛋白质脂酰化是铜离子载体诱导细胞死亡的关键调节因子
既然锁定了target范围，下面作者就要去找到底是什么介导了铜死亡。于是他们进行了全基因组 CRISPR-Cas9 功能缺失筛选（loss-of-function screen），
这个我们之前也讲过，就是利用sgRNA文库，然后感染细胞，通过CRISPR敲掉某个基因，如果敲完之后，细胞没发生铜死亡，说明这个基因就是参与铜死亡的关键基因。为了提高筛选广度，他们用了两种结构不同的铜离子载体（elesclomol 和双硫仑的活性形式，二乙基二硫代氨基甲酸酯），然后取了交集（图 3 A 到 C）。最后锁定了七个基因 (图3A，用蓝色标记)，包括 FDX1和六个基因编码硫辛酸途径的组分(图 3D)。他们又用一个独立的基因敲除screen去验证这一结果，这回只集中在3000种代谢酶上(图 3E)。单独敲掉FDX1 和 LIAS 后，抑制了铜死亡，进一步验证了实验结果（图 3 F 和 G）。
筛出来的这俩基因FDX1和LIAS是啥东西？FDX1编码一种还原酶，一种小的铁硫蛋白，可将 Cu2+ 还原为毒性更强的形式Cu1+，而且是elesclomol的直接靶标。而LIAS属于生物素和硫辛酸合成酶家族，定位于线粒体，催化从头合成硫辛酸的最后一步。而硫辛酸能干嘛？这就引出了文章的重点，脂酰化（lipoylation）是线粒体蛋白特有的一种翻译后修饰，这个修饰依赖于线粒体合成的脂肪酸，即硫辛酸（lipoic, LA，一种含有五元环内二硫键的特殊脂肪酸，通过酰胺键连接在底物蛋白赖氨酸残基的侧链氨基上。这样作者就把FDX1、蛋白质脂酰化和铜死亡都牵出来了。
4、FDX1 是蛋白质脂酰化的上游调节因子
蛋白质脂酰化作为保守的赖氨酸翻译后修饰，已知仅发生在四种酶上，这些酶都涉及调节碳进入TCA循环的代谢，包括DBT、GCSH、DLST和DLAT，其中DLAT是丙酮酸脱氢酶复合物的重要组成部分，可以看到这些蛋白质的脂酰化对于酶促功能是必需的（图 3D）。所以作者就猜，FDX1 会不会可能是蛋白脂酰化的上游调节因子，进而调节TCA循环呢？
为了验证这个假设，接下来他们进行了三个分析。首先，作者在Cancer Dependency Map ( http://www.depmap.org) 中找FDX1和硫辛酸协调依赖的证据，这个网站拥有数百个癌症细胞系中进行全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选的信息。他们发现，FDX1和硫辛酸途径的组分在整个细胞系中的活性效应高度相关(p<0.0001；图4A)。其次，他们对208例肿瘤标本做了FDX1和硫辛酸的免疫组化染色，证明FDX1和脂酰化蛋白的表达高度相关(p < 0.0001图4B和4C)。第三步，作者用硫辛酸特异性抗体作为DLAT和DLST脂酰化的标准去看了一下FDX1敲掉后是否影响蛋白质的脂酰化。通过WB，证明FDX1敲掉后蛋白脂酰化完全丧失(图4D)，而且还导致细胞呼吸的显著下降，跟直接敲掉LIAS本身所观察到的水平差不多(图4E)。敲掉FDX1后分析细胞的代谢谱，发现丙酮酸和α-酮戊二酸变多，而琥珀酸耗尽了。所以就形成了图4F的示意图：FDX1作为上游调节因子，会促进丙酮酸脱氢酶（PDH）和α-酮戊二酸脱氢酶（α-KDH）的脂酰化，进而影响TCA循环（图4F）。
5、铜直接结合并诱导脂酰化DLAT的寡聚化
实验做到这里，作者证明了FDX1会影响铜死亡，铜死亡又会影响TCA循环，TCA循环又会间接因为脂酰化受到FDX1的调控，小伙伴看到这里可能会觉得，哇已经做的非常好了呀。但这还不是发Science的水平呐，因为还没做到从机制上把这三者直接作用模式binding起来。
所以接下来，作者就提出了一个假设：铜离子可能直接与脂酰化蛋白质结合，进而影响后面的种种。为了检验这一假设，他们从细胞裂解物中纯化了DLAT和DLST，然后去过载着不同离子的树脂柱，结果发现这些蛋白质能载铜树脂结合，但不与钴或镍树脂结合(图5A)。敲掉FDX1后，DLAT蛋白脂酰化缺失，就不再结合铜离子了(图5B)，这就说明蛋白脂酰是铜结合所必需的。比较有意思的一点是，跑非变性凝胶电泳后，他们发现铜与DLAT结合后，会出现蛋白寡聚体（oligomers），而且这种寡聚体是依赖于脂酰化的 (图5 B和C)。同样，对elesclomol敏感细胞的用Cu-elesclomol处理增加了DLAT寡聚体和，而elesclomol不敏感细胞系或FDX1敲除(FDX1 KO)细胞只有在用非常高Cu-elesclomol处理时才会发生DLAT寡聚化(图5 D和E)。通过免疫荧光也证明了，elesclomol处理显著诱导产生DLAT 小的聚集体（foci），而这种foci在FDX1 KO和脂酰化缺陷细胞中减少(图5F至H)。
这样的话就提出了一个想法：脂酰化蛋白结合铜离子载体后，会发生异常寡聚化。然后作者又打了质谱，做了functional enrichment，发现Cu-elesclomol处理导致Fe-S簇蛋白表达降低(图6 A，B)，而且是依赖FDX1的(图6C)。这些发现与在细菌和酵母中那些paper报道过的现象是一致的，即铜离子可以破坏含铁硫蛋白的稳定性。
6、铜诱导的死亡机制与铜稳态失调的遗传模式相同
文章到这里，这些实验用到都是铜离子载体elesclomol去人为克服细胞内较低的铜浓度稳态。细胞本身的铜离子转运这些机制主要涉及到铜离子importer：SLC31A1(CTR1)和铜离子exporters：ATP7A和ATP7B，图6D已经清晰地画出来了(图6D)。那么铜死亡跟这些蛋白功能是否有关系呢？所以接下来他们做了三个实验。首先，作者在HEK293T细胞中过表达SLC31A1，发现显著增加了细胞对生理浓度下铜离子的敏感性(图6E)。同时，蛋白质脂酰化减少，Fe-S簇蛋白水平降低，HSP70表达升高(图6F)。另外，在过表达 SLC31A1 的细胞中，铁死亡、坏死和凋亡抑制剂并不能抑制铜诱导的细胞死亡（图 6G），只有铜离子螯合剂、FDX1 KO 和 LIAS KO 各自部分挽救了铜死亡（图 6 G 和 H）。
根据图6D示意图，我们可以了解到铜离子在细胞内能够被GSH结合，降低其毒性。所以第二步，作者用谷胱甘肽合成酶抑制剂BSO耗竭掉细胞内铜伴侣谷胱甘肽的，结果细胞发生了铜死亡 (图6I)，如果再加上敲掉FDX1和LIAS的话，铜离子诱导的死亡又减弱了 (图6J)。最后，作者使用了一个威尔逊病小鼠模型（缺失Atp7b），在该模型中，随着鼠龄增加，细胞内会发生铜积累导致细胞死亡。他们比较了老年Atp7b缺陷(Atp7b−/−)小鼠与Atp7b杂合子(Atp7b-/+)小鼠和WT小鼠的肝脏，观察到蛋白脂酰化降低、Fe-S簇蛋白表达降低，以及HSP70丰度增加(图6K)。算是把铜毒性的细胞实验在小鼠身上做了个验证。
文章到这里就结束了，老熊总结俩字就是：烧钱，非常的烧钱
首先呢，他们通过筛到一个载铜小分子：elesclomol，然后利用这个工具做后面的细胞实验，排除掉其他的调节性细胞死亡形式后，他们发现铜诱导的死亡在线粒体呼吸中异常明显，进而发现是影响了TCA循环。上游是通过CRISPR-Cas9 功能缺失筛选找到了上游调节因子FDX1及LIAS，证明了铜死亡跟FDX1和蛋白脂酰化有关系。然后提出了铜离子能结合脂酰化蛋白形成寡聚体，进而影响TCA循环。这里面除了TCA循环，因为FDX1本身的功能，他们还提出FDX1还调控铁硫簇蛋白表达。这些实验用到的都是elesclomol这个工具，如果不用这个工具，细胞本身的铜离子是否也会导致铜死亡呢？所以他们又做了过表达铜离子importer和exporter，证明了细胞中铜离子本身泵入泵出也会导致类似的铜死亡。最后选了一个铜离子exporter敲除的小鼠模型上做了验证。
小伙伴读完可能跟我有同样的感觉，前面的数据和推理做的很漂亮，但是有点高开低走的感觉。尤其是后面加入了铁硫簇蛋白，真让人摸不着头脑。把每条途径都做了，也都说得通，但是线索太多，结论性东西太少，到最后也没说明白为啥铜离子影响了有氧呼吸就会发生铜死亡，why？I don’t know。留着大家去挖掘吧，希望你能从中get到一些点子。
好了，讲到这里要累死了，希望大家点赞、转发、关注我，让我有动力继续分享！我是老熊，一个立志用通俗易懂的语言带你玩转科研的忍者~
参考文献：
[1] Tsvetkov P, Coy S, Petrova B, et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 2022;375(6586):1254-1261.
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