肖智雄｜发现KRAS-驱动肺癌生长关键调控蛋白并已开展转化研究
作者： 生辉SciPhi
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当今肺癌仍是发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一，其中，非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌发生率的 85% 左右，约 75% 的患者在发现时已处于中晚期，5 年生存率较低。然而，现阶段针对非小细胞肺癌的治疗仍然面临重大挑战。
近期，四川大学研究团队揭示了双重调控自噬和细胞衰老的去泛素化酶 USP5-自噬蛋白 Beclin1 （USP5-Beclin 1）轴在 KRAS 介导的非小细胞肺癌生长中的关键作用，并在 CDX 和 PDX 小鼠模型上验证基因敲低或小分子抑制该轴能够有效抑制肺癌生长。目前，这项研究已经以“USP5-Beclin 1 axis overrides p53-dependent senescence and drives Kras-induced tumorigenicity”为题发表在 Nature Communications 上。
（来源：Nature Communications）
“KRAS 是驱动肿瘤生长的关键蛋白，但由于其结构特异性，长期以来被认为不可成药。最近针对 KRasG12C 特异性突变开发出的抑制小分子是临床肿瘤治疗的重要突破， 然而 KRasG12C 突变肿瘤只占 KRAS 突变肿瘤的一部分， 且伴随耐药突变的出现。因此领域中迫切需要寻找 KRAS 信号通路中新的药物靶点。”四川大学生命科学学院肖智雄教授告诉生辉。
“我们实验室长期从事抗癌基因 p53 及其信号通路的研究，一直好奇为什么在 KRAS 驱动的 NSCLC 中超过 60% 肿瘤组织带有野生型的 p53 基因，而这篇研究论文的出发点则主要围绕临床问题，探索 KRAS 癌信号通路与抗肿瘤 p53 信号通路的互作及在肿瘤发生发展中的内在关系。”他补充说。
▲图｜四川大学生命科学学院肖智雄教授（来源：受访者）
肖智雄在四川大学先后获得理学学士和硕士学位。1985 年，他入选教育部中美生化和分子生物学留美项目（CUSBEA）留学美国，在麻省大学阿默斯特分校获得分子生物学博士学位。随后，他进入哈佛大学 Dana-Farber 癌症研究所从事博士后研究工作，师从 David Livingston 教授，围绕抗肿瘤基因 p53 和 Rb 及家族成员的功能和调控开展研究。1996 年，他受聘于美国波士顿大学医学院生化系和医学系，先后担任助理教授、副教授、教授等职务。
2010 年，肖智雄入选国家高层次人才全职回国，在四川大学创立“生长代谢与衰老研究中心”转化平台并担任主任，他还曾任四川大学生命科学学院院长、国家科技部重大基础研究计划（973 项目）首席科学家，主持多项国家自然基金委重点项目和重点国际合作项目。现阶段，他课题组的研究主要围绕肿瘤转移及耐药、肿瘤代谢、细胞衰老以及肿瘤免疫等领域，目前，他以通讯作者已在 Nature、PNAS、Nature Communications、Plos Biology、Oncogene、Redox Biology、Stem Cell Report 、JBC、CDDis 等期刊上发表论文 90 余篇，拥有国家发明专利4项。
“KRAS 作为一个原癌基因，一旦被激活会诱导细胞衰老（oncogene-induced senescence，OIS）从而阻碍肿瘤的发生发展，那么肿瘤的发生发展过程中必定存在一种内在机制能够抑制致癌基因诱导的细胞衰老。”肖智雄指出。
据介绍，肖智雄团队的近几年这项研究中，发现 KRAS 基因的激活能够促进去泛素化酶 USP5 的蛋白形成二聚体并提高酶活和蛋白稳定性，随后，他们证明了 USP5 是自噬关键蛋白 Beclin 1 的去泛素化酶。USP5 结合 Beclin 1，促进 Beclin 1 去泛素化，提高蛋白稳定性，并促进细胞自噬。
▲图｜USP5 去泛素化并稳定 Beclin 1（来源：Nature Communications）
进一步研究发现，下调 USP5 或 Beclin1 的表达，不仅抑制细胞自噬， 还诱导 p53-依赖性的细胞衰老。而激活的 KRAS 上调 USP5 和 Beclin1，导致核质 Beclin1 增加，促进 MDM2-介导的 p53 蛋白酶体降解，从而抑制细胞衰老。
随后基于小鼠模型研究发现，下调 USP5 或 Beclin 1 能够导致细胞自噬下降、细胞衰老增加，从而显著抑制肿瘤的生长。这些发现表明，KRAS 信号通路通过上调 USP5 稳定核质 Beclin 1 进而克服 p53 依赖的细胞衰老，促进肿瘤生长。
▲图｜USP5 调节 Beclin 1 蛋白表达以调控自噬、衰老和肿瘤生长（来源：Nature Communications）
关于这项研究的意义，肖智雄认为 “在理论层面有拓展创新，在临床层面发现具有转化潜力的靶点。”
首先在理论层面，细胞自噬在肿瘤发生发展中的作用已有很多相关研究，但其研究结果不一， 甚至结论相反，可能细胞自噬对肿瘤生长的作用存在细胞、肿瘤特异性。“我们的这项研究在已有理论的基础上进行了拓展与创新，揭示了细胞自噬、细胞周期、细胞衰老的有机联系，证明了细胞自噬在促进肿瘤生长中起到重要作用，并且也揭示了癌基因 KRAS 与抗癌基因 p53 信号通路的对话。”肖智雄表示。
其次在临床层面，一直以来靶向 KRAS 的肿瘤治疗存在很大挑战。“我们发现了一个新的抑制 KRAS 信号通路上游的关键分子，即去泛素化酶 USP5，其能够双重调控细胞自噬与细胞衰老，所以，USP5 很有可能是一个较好的药物靶点。在细胞水平和动物水平研究中发现，使用我们筛选的小分子抑制剂降低 USP5 的酶活，对体外肿瘤细胞增殖以及动物模型的肿瘤生长能够得到有效抑制。”他说。
▲图｜KRAS 通过 USP5 及 Beclin 1 抑制细胞衰老、增强细胞自噬促进肿瘤生长（来源：Nature Communications）
谈及在开展这项研究过程中遇到的挑战，肖智雄总结了 3 个方面。
第一，Beclin 1 如何调控细胞衰老和细胞周期。“Beclin 1 是一种位于胞质的自噬调控蛋白，在胞质中发挥功能，但其定位于核质的Beclin1 的功能调控知之甚少。”肖智雄指出。
第二，如何将 Beclin 1 调控的细胞自噬功能和细胞衰老功能划分开来。“换句话说，Beclin 1 在下调后可抑制肿瘤生长，这究竟是由细胞自噬引起的还是细胞衰老引起的。”他解释说，“通过分析发现，Beclin 1 下调以后既影响了细胞自噬，也影响了细胞衰老，这两个过程都对 KRAS 介导的肿瘤起关键作用。”
第三，在生化机制方面，USP5 究竟是如何被激活的。“对此，我们花费了大量时间探索是蛋白丰度的增加造成了酶活增加，还是 KRAS 促进其二聚体化进而导致酶活增加。最终，我们证明 KRAS 通过提升胞内活性氧促进 Beclin1-C195 形成 二硫键，诱导 USP5 同源二聚体的形成进而稳定并激活 USP5。”他补充说。
对于下一步的研究动向，肖智雄表示，“首先，围绕临床方面是进一步开发 USP5 小分子抑制剂，并且我们已经在体外模型中验证其有效性；另外，这项研究解决了一些理论问题，但同时很多新问题也随之出现。比如，Beclin 1 的‘入核’是通过什么信号通路来进行调控的，以及核质 Beclin 1 除了调控 p53 以外还能够调控什么，这些将是我们接下来的一个研究方向。”他说道。
临床统计数据表明，很多肿瘤患者并非死于原发性肿瘤，而是肿瘤细胞转移，同时肿瘤耐药是导致肿瘤难以治疗治愈的主要原因之一，这也限制了抗肿瘤药物的选择和使用，因此，肿瘤转移和耐药是临床治疗过程所面临的重大问题。
针对肿瘤转移方面，“我先前的研究方向主要围绕 p53 和 Rb 基因，回国后重点转移到了 p53 的家族蛋白，如 ΔNp63α 蛋白，探索其在肿瘤转移过程中所起到的作用。”肖智雄表示。
先前研究证实，磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）、Ras 和 Her2 信号的激活在癌症发展中起着关键作用，而在上皮细胞中表达的 p63 的主要蛋白亚型 ΔNp63α 是细胞粘附程序的重要调节剂，并且是癌症转移的关键抑制剂。
（来源：PNAS）
2017 年，肖智雄和团队在 PNAS 上发表了题为“ΔNp63α is a common inhibitory target in oncogenic PI3K/Ras/Her2-induced cell motility and tumor metastasis”的研究论文，他们发现 PIK3CA 和 RAS 上的致癌突变，比如 p110αH1047R、K-RasG12V、H-RasG12V 和 Her2，使用共同的 Akt1-FOXO3a 通路抑制 ΔNp63α 表达，从而促进细胞迁移、侵袭和肿瘤转移，因此，ΔNp63α 是 PI3K、Ras 和 Her2 信号通路的抑制靶点并有望作为肿瘤转移中致癌信号传导的关键整合因子。
随后，肖智雄和团队针对肿瘤转移，基于肿瘤代谢开展了进一步的研究工作，探索能量代谢调控与肿瘤转移的内在机制。
能量感受器（AMPK），即腺苷酸激活蛋白激酶，是能量调控的关键蛋白，其在细胞能量感知和维持细胞能量稳态过程中起着关键作用。
肖智雄和团队通过前期研究发现 PI3K、Ras 和 Her2 信号通路通过转录抑制 ΔNp63α 来促进肿瘤转移，而此次的研究则揭示了 AMPK 在 PI3K、Her2 驱动的乳腺癌转移中起着关键调控作用。“我们在先前研究的基础上进一步探索发现，AMPK 蛋白的丰度与肿瘤的转移密切相关，具体而言，AMPK 的表达受到 ΔNp63α 的调控，即 ΔNp63α 是 AMPK 的直接转录因子。”他指出，“PI3K、Her2 信号通路通过抑制 ΔNp63α，进而抑制 AMPKa1（AMPK 催化亚基）基因转录，最终导致乳腺肿瘤细胞侵袭和转移。”
（来源：PNAS）
这项研究 2020 年以“Transcriptional suppression of AMPKα1 promotes breast cancer metastasis upon oncogene activation”为题发表在 PNAS 上。
“综上所述，这两篇 PNAS 论文都是围绕肿瘤转移机制方面的研究，第一篇揭示了 ΔNp63α 是癌症信号通路下游的抑制靶点；第二篇揭示了 ΔNp63α 是 AMPK 直接的、上游的转录因子。”肖智雄总结说。
针对肿瘤耐药方面，肖智雄团队的研究主要聚焦于非小细胞肺癌。“靶向 EGFR 激活突变的酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）对于非小细胞肺癌疗效显著，但是该肿瘤很容易产生耐药性，因此医药公司需要针对肿瘤耐药性进行不断迭代药物，然而肿瘤又会针对新开发的药物出现新的耐药突变，这是临床治疗非小细胞肺癌所面临的一大挑战。”他指出。
我们认为“不仅 EGFR 基因的耐药突变，EGFR 耐药蛋白的丰富在非小细胞肺癌的 TKI 耐药性中也起到重要作用。所以，我们实验室开始着手将把 EGFR-TKIs 耐药蛋白的丰度降低，以提高（已经产生耐药性的）非小细胞肺癌对于 TKI 的敏感性。”肖智雄表示。
2021 年，他和团队在 Nature Communications 上发表了题为“FBXL2 counteracts Grp94 to destabilize EGFR and inhibit EGFR-driven NSCLC growth”的研究论文。“我们的研究发现 FBXL2 是 EGFR 新的 E3 泛素连接酶，可促进 EGFR 的多泛素化蛋白酶体途径的降解从而抑制 EGFR 驱动的非小细胞肺癌的生长。”肖智雄指出，“随后，我们挑选出一个亲和力比较高、已经用于临床的小分子药物奈必洛尔（Nebivolol），其能够抑制 EGFR 耐药蛋白表达，克服 TKI 耐药。”
（来源：Nature Communications）
“这项研究具有较好的临床转化潜力。”肖智雄表示，“目前，我们已经根据 Nebivolol 的作用机制筛选了一系列新的小分子先导化合物，相较于 Nebivolol，基于体外细胞试验和动物模型试验显示其治疗效果更好。”
除了肿瘤转移和耐药之外，肖智雄和团队还致力于开展降低肿瘤化疗副作用的研究，以期能够开发出一种能够有效杀死肿瘤（与传统化疗药物疗效相当）但是副作用小的新型治疗策略和药物。“现阶段，我们已经发现一种临床应用的小分子，通过增加辅助剂的策略，即可实现选择性杀死肿瘤细胞，而对正常细胞没有明显的细胞毒性，同时我们还基于多种PDX肿瘤模型的动物试验已经验证，其能够有效杀死肿瘤且副作用不明显。”他介绍说。
谈及转化研究和产业化层面，肖智雄表示，“上述列举的相关研究已经通过大量在细胞水平和动物水平的试验证明其有效性，我希望能够联合相关公司合作开发创新药物，尽快将这些基础研究的成果推向临床，以期造福更多的肿瘤患者。”他说道。