本发明属于生物医学领域,涉及一种可用于早期诊断散发型肌萎缩性脊髓侧索硬化症(als)的潜在标志物,具体涉及脑脊液中次磺酸化修饰的sod1可作为诊断散发型肌萎缩性脊髓侧索硬化症的潜在标志物。
背景技术:
肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophiclateralsclerosis,als)是一种致命性的神经退行性疾病,这种疾病是以家族性和散发型的形式存在。约5%~10%的患者有家族遗传史,其遗传方式是常染色体显性遗传。其重要病理特征之一就是由铜锌超氧化物歧化酶(cu/znsuperoxidedismutase,sod1)在运动神经元中形成的纤维样聚集体。sod1蛋白异常的翻译后修饰及其突变体均可诱发als。90%的als是散发型als,散发型als发病机理及其与翻译后修饰的关系目前还不清楚。
以往对于als的临床诊断主要有肌电图分析、基因组测序鉴定、脑脊液神经纤维丝轻链分析、脑脊液tdp-43蛋白分析等。脑脊液比血浆等体液具有两大优势:首先,血浆中的高丰度蛋白在脑脊液中的含量较低,因此一些低丰度的与疾病相关的蛋白质能够更准确可靠地进行检测;第二,als病人脑脊液中含有大量不断从发病位点释放的疾病相关蛋白质和分泌物,并且随着疾病进程大脑环境的改变而动态变化。除此之外,腰椎穿刺(腰穿)获取脑脊液的方式比脑部和脊髓的活体组织检测方式更安全而且可操作性更强。因此,鉴定脑脊液中与散发型als相关的标志物,将其应用于散发型als的早期诊断,是临床诊断中一项亟待解决的难题。
技术实现要素:
本申请的发明人研究了病理过氧化氢对野生型sod1积聚的影响,用基于dimedone的次磺酸化检测抗体,发现病理浓度(20-200μm)过氧化氢无论在体外还是在活的神经细胞中,都可以使得野生型sod1发生次磺酸化修饰,其修饰位点为111位的半胱氨酸,并诱导野生型sod1形成寡聚体和纤维样聚集体,进而诱导神经细胞凋亡。发明人运用免疫沉淀和酶联免疫的方法检测了als病人的脑脊液样本,发现散发型als病人脑脊液样本中的次磺酸化修饰sod1水平显著高于对照组脑脊液样本。
基于次磺酸化修饰的sod1与散发型als的这种相关性,以次磺酸化修饰的sod1作为散发型als早期诊断的潜在生化指标是可行的。
因此,本发明的目的在于提供脑脊液中次磺酸化修饰的sod1在早期诊断散发型als中的应用。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
本发明提供一种检测脑脊液中次磺酸化修饰的sod1含量的试剂在制备散发型als早期诊断产品中的应用。
进一步,所述试剂包括利用免疫方法检测脑脊液中次磺酸化修饰的sod1含量的试剂。
优选地,所述免疫方法包括酶联免疫吸附测定(elisa)检测、免疫沉淀(immunoprecipitation-ip)检测。
优选地,所述试剂包括蛋白酶抑制剂混合物、双甲酮溶液、双甲酮抗体及sod1抗体。
优选地,所述双甲酮抗体或sod1抗体包括单克隆抗体和多克隆抗体。
进一步,所述产品包括试剂盒、芯片、试纸。
本发明与现有技术相比,具有以下优点和效果:
以往对于als的临床诊断主要有肌电图分析、基因组测序鉴定、脑脊液神经纤维丝轻链分析、脑脊液tdp-43蛋白分析等。脑脊液比血浆等体液具有两大优势:首先,血浆中的高丰度蛋白在脑脊液中的含量较低,因此一些低丰度的与疾病相关的蛋白质能够更准确可靠地进行检测;第二,als病人脑脊液中含有大量不断从发病位点释放的疾病相关蛋白质和分泌物,并且随着疾病进程大脑环境的改变而动态变化。除此之外,腰椎穿刺(腰穿)获取脑脊液的方式比脑部和脊髓的活体组织检测方式更安全而且可操作性更强。脑脊液次磺酸化修饰sod1水平检测是从蛋白质翻译后修饰角度出发的,和以往检测技术相比,具有操作更方便快捷、耗费低、准确率高等优势。因此,本发明的脑脊液次磺酸化修饰的sod1与散发型als的相关性这一发现将为早期als的诊断和/治疗提供一条全新的途径。
附图说明
表1为15例als病人和6例对照组病人脑脊液样本获取时的临床信息;
图1a为胰酶酶解sod1得到的一个肽段111位的半胱氨酸发生次磺酸化修饰的示意图;
图1b为质谱所得的图1a的酶解肽段各种碎片离子的相对丰度图;
图2a为病理浓度(100μm)过氧化氢诱导野生型sod1蛋白积聚的动力学曲线;
图2b为还原条件(5mmdtt处理)下野生型sod1蛋白积聚的动力学曲线;
图2c为病理浓度(100μm)过氧化氢诱导的sod1次磺酸化修饰水平随时间变化的免疫沉淀检测图;
图2d为次磺酸化修饰检测的原理图;
图2e为不同时间次磺酸化修饰的sod1量与sod1总蛋白量的比值;
图3a为野生型sod1蛋白在100μmh2o2处理37h后,透射电子显微镜观测到的纤维样聚集体;
图3b为野生型sod1蛋白在还原条件5mmdtt处理44h后,透射电子显微镜观测到的诱导聚集产生的纤维;
图4a为在sh-sy5y细胞的培养基中加入5μm次磺酸化修饰sod1寡聚体,孵育4天后,用流式细胞检测得到的细胞凋亡率;
图4b为在sh-sy5y细胞的培养基中不加寡聚体,孵育4天后,用流式细胞检测得到的细胞凋亡率;
图5a-5e为免疫沉淀检测15个散发型als病人和6个相同年龄段对照组病人(未患als的病人,包括阿尔茨海默病患者1人,ⅱ型糖尿病并发肌坏死患者1人,脑干梗塞患者1人,颅内感染病人1人,吉兰-巴雷综合征患者1人,脑囊虫病患者1人)的脑脊液中次磺酸化修饰的野生型sod1蛋白量与总sod1蛋白量;
图5f为15位散发型als病人和6位相同年龄段对照组病人的脑脊液中野生型总sod1蛋白量散点图;
图5g为免疫沉淀检测15个散发型als病人和6个相同年龄段对照组病人的脑脊液样本的sod1蛋白次磺酸化水平散点图;
图6为酶联免疫吸附测定(elisa)检测15个散发型als病人和6个相同年龄段对照组病人的脑脊液中次磺酸化修饰的野生型sod1蛋白量散点图。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】质谱鉴定次磺酸化修饰发生位点为sod1第111位半胱氨酸(cys)
用wt-sod1质粒转化大肠杆菌感受态细胞bl21,诱导培养使其产生野生型sod1蛋白。脱辅基:依次用缓冲液1(10mmnaac,10mmedta,ph3.8)、缓冲液2(10mmnaac,ph3.8)、缓冲液3(20mmnah2po4,ph7.4)分别透析4~5次,每次透析4~5h。用胰酶酶解sod1得到一个片段,其序列是s102vislsgdhciigr115(如图1a所示)。
a.取10μm脱辅基的野生型sod1蛋白,用100μmh2o2处理30min后,加入5mm双甲酮(购自国药公司)孵育2h;
b.跑sds-page胶,用考马斯亮蓝r250染色1h,高脱液洗去背景染色;
c.切下含有目的片段的胶块,将胶块切碎后用胰蛋白酶消化,然后通过lcms/ms进行分析;
d.对胰酶消化后含有双甲酮的肽段s102vislsgdhciigr115进行ms2分析。
通过对不同离子的质荷比进行分析,在sod1第111位的半胱氨酸(cys)残基位点上有双甲酮加合物(分子量增加138.07da),表明病理浓度(100μm)过氧化氢可以使得野生型sod1发生次磺酸化修饰,其修饰位点为111位的半胱氨酸,如图1a、1b所示。
【实施例2】病理氧化条件下sod1的聚集及其次磺酸化修饰的检测
氨基酸次磺酸化修饰检测原理如图2d所示,发生次磺酸化修饰的sod1中次磺酸化的半胱氨酸(cys)上的-oh可与双甲酮2号位碳上的-h反应脱水,使得双甲酮与sod1结合形成一个复合物。该复合物能与双甲酮抗体结合,因而用双甲酮和双甲酮抗体可以检测次磺酸化修饰。
a.用100μmh2o2处理30μm的脱辅基的野生型sod1蛋白(制备与脱辅基方法同实施例1),与5mmdtt处理30μm的脱辅基的野生型sod1蛋白进行比较,放置于37℃恒温摇床,随时间取样;
b.将sod1样品稀释至3μm,加入终浓度为25μmtht,用440nm的荧光激发,测得480nm发射荧光的强度。如图2a、2b分别为最佳动力学拟合曲线,与以往文献所使用的5mmdtt处理条件相比,100μmh2o2处理更接近病理条件。在病理条件下,h2o2通过sod1的次磺酸化修饰来引发野生型sod1纤维样聚集体的形成;
c.再取30μm脱辅基的野生型sod1,用100μmh2o2处理48h(控制ph为7.4,在37℃下不断搅拌)。在不同时间点(0,2,4,6,8,24,36,48h)分别取样,加入用终浓度5mm双甲酮(购自国药公司),然后加入无还原剂的sds-pageloadingbuffer煮样;
d.用双甲酮抗体(购自millipore公司)通过westernblot检测sod1次磺酸化修饰。
如图c为westernblot的检测结果。将不同时间点的野生型sod1样品的考马斯蓝染色设定为参照,双甲酮表示的次磺酸化修饰的sod1条带(图2c:wb:双甲酮)除以相应总量的sod1条带(图2c:考马斯亮蓝)的平均值,即可计算得到每个时间点所取得的次磺酸化修饰的sod1相对含量,如图2e所示。
【实施例3】透射电子显微镜观察病理氧化条件下sod1生成的纤维样聚集体
a.100μmh2o2处理30μm脱辅基的野生型sod1蛋白,放置于37℃恒温摇床,220rpm/min,37h取样,5mmdtt处理30μm脱辅基的野生型sod1蛋白在44h进行取样。
b.取10μl样品置于铜网上,静置1min;
c.用滤纸毛边吸取样品,水洗铜网3次,10μl/次;
d.乙酸双氧铀染色1min,在空气中静置干燥;
e.透射电镜观察sod1纤维形态。
病理氧化条件下(图3a)sod1蛋白形成了100-400nm较短的纤维结构,在生理还原条件下(图3b)形成的是很长的纤维结构。两种条件下生成的纤维在大小和形态方面都有所不同,这说明病理浓度过氧化氢可以通过使野生型sod1发生次磺酸化修饰,诱导野生型sod1形成寡聚体和纤维样聚集体,形成与生理还原条件下不同的纤维结构。
【实施例4】流式细胞术检测神经细胞凋亡
a.100μmh2o2处理30μm脱辅基的野生型sod1蛋白,放置于37℃恒温摇床,220rpm/min,6h(蛋白质发生寡聚化)取出;
b.将样品稀释至5μm加入到sh-sy5y细胞的培养基中,孵育4天后,annexinv和pi双染;用流式细胞检测。
病理氧化条件下(100μmh2o2处理)制得的sod1蛋白寡聚体处理细胞,细胞凋亡率达到了10.94%(图4a);不加寡聚体的细胞凋亡率只有0.82%(图4b),因此我们得出结论次磺酸化修饰的sod1寡聚体可以诱导sod1稳转细胞发生凋亡。
【实施例5】免疫沉淀(immunoprecipitation-ip)检测脑脊液中次磺酸化的sod1蛋白量
a.吸取200μl的脑脊液样本加入2μl蛋白酶抑制剂混合物(购自sigma公司)和2μl100mm的双甲酮溶液(购自国药公司),与1μl的兔源双甲酮抗体(1mg/ml,购自millipore公司)4℃过夜孵育;
b.加入2μlg蛋白琼脂糖珠子(购自abcam公司),4℃孵育12-14h;
c.用pbs缓冲液洗涤珠子3次,加入50μl不带还原剂的sds-page上样缓冲液煮5min;
d.利用鼠源sod1抗体(购自abcam公司)做westernblot检测。
注:20μl相同的脑脊液样本加入sds-page上样缓冲液煮5min,用兔源sod1抗体(购自abcam公司)做westernblot检测获得的总sod1蛋白量作为参照,次磺酸化的sod1蛋白量与sod1蛋白总量的比值就是次磺酸化水平。
实验结果表明:在13个散发型als病人脑脊液样本中检测到次磺酸化修饰的sod1蛋白,但是在对照组和2个散发型als脑脊液样本中未检测或检测到极少量次磺酸化修饰的sod1蛋白,如图5a-e所示,病人详细信息见表1;图5f为15位散发型als病人和6位相同年龄段对照组病人(未患als的病人)的脑脊液中野生型总sod1蛋白量散点图,通过与对照组病人c1脑脊液野生型总sod1蛋白量相比来进行标准化,通过t检验表明,散发型als患者和对照组病人脑脊液中野生型总sod1蛋白量没有显著性差异(p=0.079),因此从另一个角度表明sod1的翻译后修饰才是致病关键所在;图5g为脑脊液样本的sod1蛋白次磺酸化水平(次磺酸化修饰的sod1蛋白量与总sod1蛋白量的比值)散点图,通过t检验分析表明对照组和散发型als病人组具有显著性差异(p=0.021)。因此,病人脑脊液中sod1蛋白质的次磺酸化水平是散发型als临床诊断的一个潜在指标。
表1.15例als病人和6例对照组病人(未患als的病人)脑脊液样本获取时的临床信息
【实施例6】酶联免疫吸附测定(elisa)检测脑脊液中次磺酸化的sod1蛋白量
a.用鼠源sod1抗体(购自abcam公司)4℃过夜孵育的方式来包裹elisa板(购自nest公司),每孔加入100μl(抗体用200mmnahco3缓冲液ph9.6稀释至终浓度为0.5μg/ml);
b.用pbst缓冲液洗涤板子3次,每孔加入100μl含有5%脱脂奶粉的pbst缓冲液,37℃封闭2h;
c.每孔加入用1μl蛋白酶抑制剂混合物(购自sigma公司)和1μl100mm双甲酮(购自国药公司)预处理的脑脊液样本100μl;
d.接着每孔加入100μl兔源双甲酮抗体(0.5μg/ml,购自millipore公司)孵育;
e.每孔加入100μl带有辣根过氧化物酶的山羊抗兔二抗(1:10000稀释,购自碧云天公司);
f.每孔加入200μl3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(购自碧云天公司),测量其在630nm处的吸收值,数据结果用t检验进行分析。
对15个散发型als病人和6个相同年龄段对照组病人(病人详细信息见表1)的脑脊液样本中次磺酸化修饰的野生型sod1蛋白量经过t检验分析,结果显示:als病人和对照组之间次磺酸化的sod1蛋白量具有显著性(p=0.0019)。再一次佐证病人脑脊液中sod1蛋白质的次磺酸化水平用来作为散发型als临床诊断潜在指标具有可行性,如图6所示。注:p<0.05和p<0.001分别用来表示显著和非常显著两个显著度。
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