一种检测B-raf基因突变的数字PCR试剂盒及其使用方法与流程

本发明属于生物，具体涉及一种检测b-raf基因突变的数字pcr试剂盒及其使用方法。

背景技术：

1、b-raf是一种癌基因，它编码一种丝/苏氨酸特异性激酶，是ras/raf/mek/erk/mapk通路重要的转导因子，参与调控细胞内多种生物学事件，如细胞生长、分化和凋亡等。既往发现，至少30种b-raf基因突变与多种人类肿瘤的发生发展相关，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺腺癌等均存在不同比例的b-raf基因突变，约66％恶性黑色素瘤和15％的结肠癌中b-raf基因存在体细胞错义突变。2017版中国黑色素瘤规范化病历诊断专家共识中指出，b-raf突变为黑色素瘤靶向治疗最主要的基因靶点。大约80-90％的b-raf基因突变发生在exon15的1799核苷酸上，t突变为a，导致其编码的谷氨酸由颉氨酸取代(v600e)。目前认为，v600e突变可模拟t599和s602两个位点的磷酸化过程，从而使得b-raf蛋白异常激活。对b-raf基因的热点突变v600e位点进行快速、可靠且灵敏的检测，可指导肿瘤相关靶向药物的选择、甲状腺癌等分子诊断、为辅助临床医生进行诊断和治疗所需。

2、目前，关于b-raf基因突变检测的方法很多，国内外学者对此进行了大量的研究，已报道的方法包括：直接测序法、变性高效液相色谱分析(dhplc)、基于荧光定量pcr平台开发的scorpins-arms、arms-tag man pcr、等位基因竞争抑制性荧光pcr、荧光pcr-hrm法和ihc检测等。这些方法各有优缺点。其中，直接测序法简单直观，但其检测能力有限，其灵敏度约为20％，其操作步骤复杂，包括pcr-电泳-测序-测序结果解读等一系列步骤。dhplc技术具有高通量检测、自动化程度高、灵敏度和特异性较高、检测dna片段和长度变动范围广、相对价廉等优点，灵敏度可达到3％-1％，但由于不同批次检测时需要重新冲洗过柱，若冲洗液或者洗脱液浓度稍微有变化，则会导致批次间的测量产生差异。目前较为常用的是基于荧光定量pcr平台开发出的检测方法，如采用扩增阻碍突变系统(amplificationrefractorymutation system，arms)衍生的系列技术，但荧光定量pcr检测下限仅为1％。ihc方法学灵敏度和特异度均较高，但使用的是组织样本，且目前尚无批准上市的相关国产试剂盒，无法在医院推广使用。

3、新一代pcr技术，即数字pcr(digital pcr，dpcr)技术，在突变检测中凸显出极大优势，可以提高b-raf基因突变检测特异性和灵敏度。dpcr是一种新的绝对定量pcr，主要是对pcr反应物进行有限稀释，随后在不同的反应腔室里进行pcr扩增，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度的技术。多重数字pcr是在同一数字pcr反应体系里加上两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的数字pcr反应。在数字pcr中实现多指标的并行检测能显著降低检测成本，获取更丰富的检测信息。

4、但是，提高b-raf基因突变检测灵敏度一直是难点，通过绝对定量的方法对b-raf突变进行检测是除数字pcr方法外现有各种检测技术都无法通过一次检测实现的技术。

技术实现思路

1、为解决上述技术问题，本发明提供用于检测b-raf基因突变的数字pcr反应中使用的引物、探针、组合物、包含所述引物和/或探针的试剂盒，以及所述试剂盒的使用方法，其能对b-raf基因突变尤其是b-rafv600e突变进行绝对定量、快速、方便、高灵敏的检测，且可含有野生型探针和/或完善的内参系统，便于计算突变频率和/或对反应体系进行质量控制，适合推广应用和产业化。

2、技术方案：

3、1.一种检测b-raf基因突变的数字pcr试剂盒，其含有引物探针混合液，其特征在于：

4、所述引物探针混合液包括b-raf基因v600e引物对和b-raf基因v600e突变型探针；

5、所述b-raf基因v600e引物对的上游引物的核苷酸序列含有seq id no.1或如seqid no.1所示，下游引物的核苷酸序列含有seq id no.2或如seq id no.2所示；

6、所述b-raf基因v600e突变型探针的核苷酸序列含有seq id no.3或如seq idno.3所示；

7、所述b-raf基因v600e突变型探针带有荧光基团。

8、2.如项1所述的数字pcr试剂盒，其特征在于：还包括pcr预混液；此外还可以包括油相包裹试剂，所述油相包裹试剂为液滴生成油。

9、3.如项1或2所述的数字pcr试剂盒，其特征在于：

10、其还包括b-raf基因野生型探针，所述b-raf基因野生型探针的核苷酸序列含有seq id no.4或如seq id no.4所示；

11、所述b-raf基因v600e突变型探针和所述b-raf基因野生型探针带有不同的5’荧光基团。

12、4.如项1或2所述的数字pcr试剂盒，其特征在于：

13、其还包括内参基因引物对和内参基因特异性探针；

14、所述内参基因引物对的上游引物的核苷酸序列含有seq id no.5或如seq id no：5所示，下游引物的核苷酸序列含有seq id no.6或如seq id no.6所示；

15、所述内参基因特异性探针的核苷酸序列含有seq id no.7或如seq id no.7所示；

16、所述b-raf基因v600e突变型探针和所述内参基因特异性探针带有不同的5’荧光基团。

17、5.如项1～4中任一项所述的数字pcr试剂盒，其特征在于：

18、所述引物探针混合液包括b-raf基因v600e引物对、b-raf基因v600e突变型探针、b-raf基因野生型探针、内参基因引物对、内参基因特异性探针；

19、所述b-raf基因v600e引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示；

20、所述b-raf基因v600e突变型探针的核苷酸序列如seq id no.3所示；

21、所述b-raf基因野生型探针的核苷酸序列如seq id no.4所示；

22、所述内参基因引物对的上游引物的核苷酸序列如seq id no.5所示，下游引物的核苷酸序列如seq id no.6所示；

23、所述内参基因特异性探针的核苷酸序列如seq id no.7所示；

24、所述b-raf基因v600e突变型探针、野生型探针和所述内参基因特异性探针均带有不同的荧光基团；

25、所述油相包裹试剂为液滴生成油。

26、6.根据项5所述的数字pcr试剂盒，其特征在于：

27、所述b-raf基因v600e突变型探针的5’端、b-raf基因野生型探针的5’端、和/或所述内参基因特异性探针的5’端带有的荧光基团选自fam、hex、和rox组成的组；其中这三种探针5’端带有的荧光基团各不相同；

28、所述b-raf基因v600e突变型探针的3’端、b-raf基因野生型探针的3’端、和/或所述内参基因特异性探针的3’端分别带有选自bhq1或bhq2的淬灭基团。

29、7、根据项6所述的数字pcr试剂盒，其特征在于：

30、所述b-raf基因v600e突变型探针的5’端、b-raf基因野生型探针的5’端、和所述内参基因特异性探针的5’端分别带有荧光基团fam、hex、和rox；所述b-raf基因v600e突变型探针的3’端、b-raf基因野生型探针的3’端、和所述内参基因特异性探针的3’端分别带有淬灭基团bhq1、bhq1和bhq2。

31、8.根据项5-7任一项所述的检测b-raf基因突变的数字pcr试剂盒，其特征在于：

32、配制反应体系时，所述内参基因引物对的终浓度与所述b-raf基因v600e引物对的终浓度相同；所述内参基因探针的终浓度、b-raf基因v600e突变型探针的终浓度与b-raf基因野生型探针的终浓度相同。

33、9.根据项1-8任一项所述检测b-raf基因突变的数字pcr试剂盒，其特征在于：

34、所述反应体系为20μl，所述引物探针混合液中，上游引物和下游引物的终浓度均各为0.4μm，探针的终浓度均各为0.2μm。

35、10.根据项1-9任一项所述的数字pcr试剂盒，其特征在于：还包括阳性对照品和空白对照液，所述阳性对照品为包含b-raf基因v600e突变型质粒与野生型人类基因组dna的混合物，所述空白对照液为无菌过滤水。

36、11.根据项10所述检测b-raf基因突变的数字pcr试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品中b-raf基因v600e突变型质粒的终浓度为500copies/μl，野生型人类基因组dna的终浓度为500copies/μl。

37、12.一种项1-11任一项所述的检测b-raf基因突变的数字pcr试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

38、s1、提取样本dna；

39、s2、配制pcr反应体系，其中含有项1-11任一项所述的pcr试剂盒；

40、s3、制备微滴，进行pcr扩增反应；

41、s4、使用微滴读取仪进行微滴读取和分析。

42、13.根据项12所述的检测b-raf基因突变的数字pcr试剂盒的使用方法，其特征在于：

43、所述pcr扩增的扩增程序为：95℃预变性10min；94℃变性30s，55℃退火与延伸1min，变性-退火与延伸共40个循环；98℃10min，20℃2min；结束反应。

44、14.根据项12或13所述的检测b-raf基因突变的数字pcr试剂盒的使用方法，其特征在于：步骤s1中样本为肿瘤组织或血浆或血清。

45、15.一种引物序列，其如seq id no：1、2、5，或6所示。

46、16.一种探针序列，其如seq id no：3、4或7所示。

47、17.一种组合物，其含有seq id no：1-7中的任一条或任几条序列。

48、18.一种试剂盒，其含有seq id no：1-7中的任一条或任几条序列。

49、19.一种芯片，其含有seq id no：1-7中的任一条或任几条序列。

50、20.项1-11任一项所述数字pcr试剂盒、项15所述引物序列、项16所述探针序列、项17所述组合物、项18所述试剂盒、项19所述芯片在制备检测b-xaf基因突变试剂中的应用。

51、本技术中用到的引物和探针序列如表1所示：

52、表1：本技术中用到的最佳引物和探针列表

53、

54、表2：本技术中用到的非最佳引物和探针列表(对比例)

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56、

57、本技术中使用的探针所带荧光标记的一种情况如表3所示：

58、表3：本技术中用到的最佳探针序列荧光标记的一种示例

59、 探针 5’端荧光标记 3’端荧光标记 b-raf野生型探针 hex bhq1 b-rafv600e突变型探针 fam bhq1 内参探针 rox bhq2

60、表4：本技术中用到的对比例探针序列的荧光标记的一种示例

61、

62、有益效果：本发明的试剂盒和方法不仅利用了数字pcr将模板分子分割在不同的单元中分别检测的能力，而且利用了单、双、或三探针(即突变型探针、野生型探针、和/或内参探针，这三个探针分别标记不同荧光染料)对突变进行特异性检测，根据识别的不同荧光信号来区分野生型和突变型，根据突变的阳性液滴数目来对突变进行绝对定量，确定突变比例。反应中还增加了内参基因的检测，可以对提取dna的质量进行检测，并对反应体系是否成功扩增进行判定。该方法所实现的技术效果是不能通过其他技术如荧光定量pcr来实现的，该方法具有绝对定量、检测准确、灵敏度和特异性高的优势。

63、请注意：反应体系中并非必须存在内参模板和探针，也并非必须含有野生型模板和/或探针。内参模板和探针、野生型模板和/或探针的存在并非检测b-rafv600e突变型所必须的，只是为优化所述检测提供的辅助手段，如内参基因的作用是确定：1)是否加入了反应所需的所有成分，防止没有加入某些成分造成的假阴性漏件；2)内参基因扩增正常可以确保反应正常，相当于给反应做了个内部质控。即可以把内参的作用理解为反应质控，但不是确定样本是否有b-raf突变必须的，也不是确定b-raf突变频率必须的。此外b-raf v600e突变引物探针(b-raf mut)可以确定是否有b-raf v600e突变序列的存在，b-raf野生型引物探针(b-rafwt)可以确定是否有b-raf野生型序列的存在，b-raf mut/b-raf wt＝b_raf突变频率。即b-raf野生型引物和探针与b-raf v600e突变型引物和探针共存的作用是计算b-rafv600e的突变频率。