一种用于DMD基因检测的数字PCR检测试剂

本发明涉及基因检测，尤其涉及一种用于dmd基因检测的数字pcr检测试剂。

背景技术：

1、假肥大性肌营养不良(dmd)，也称杜氏肌营养不良症(omim 310200)，是最常见的一类进行性肌营养不良症，为x-连锁隐性遗传。本病主要是男孩发病，大多数女性不患病，可能为致病基因的携带者，少数患病女性可能与x染色体失活有关。现有的dmd检测方法主要包括血清学检测和基因检测。基因检测相比血清学检测可以有效评估遗传发病风险，但也存在成本高、周期长等不利因素，制约了对风险人群筛查的应用可能。

2、中国专利cn110527720a公开了一种用于检测dmd基因外显子拷贝数变异的扩增系统及其试剂盒，其仅pcr检测dmd基因的8个外显子，这种基于筛选部分外显子区域进行检测的qpcr方法，则存在比较高的假阴性检测结果概率，考虑到漏检可能导致严重的临床后果，仍需要其他方法对阴性结果进行二次判别，实际应用价值有限，无法发挥方法学低成本的优势。

3、而基于超多重数字pcr的检测方法对dmd基因的79个外显子全部进行检测，则可以尽量避免漏检，同时兼顾基于pcr技术的成本和周期优势，具有显著的临床应用前景。虽然目前已有针对dmd基因的79个外显子全部进行检测的pcr技术，(如中国专利cn112410410a、cn108220418a、cn109554443a、cn113652474a)，但是基于mlpa技术的检测方法无法进行定量，需要对dna浓度有精确控制才能得到可靠的结果。基于超多重数字pcr的检测方法可以实现绝对定量，只需对样品内目标片段与内参片段的拷贝数进行比较即可得到具体的基因变异丰度。

4、基于mlpa技术的检测方法对样品量也有一定要求，无法用于产前孕妇外周血中胎儿游离dna的检测。基于超多重数字pcr的检测方法具有超高灵敏度，可以实现同一检测方法覆盖孕前准父母dmd基因缺陷携带筛查、产前婴儿dmd基因缺陷无创检测、新生儿dmd基因缺陷检测等多个阶段的不同检测需求。

5、基于ngs技术的检测方法成本高周期长，常常需要数十个工作日才能给出检测结果，花费普遍在数千元的水平。基于超多重数字pcr的检测方法一般在1天内即可完成全部检测过程并给出检测结果，花费较低，大规模应用后更可能花费更低。

6、超多重数字pcr技术结合了超多重pcr技术可以对多个基因区域同时检测的能力和数字pcr的精准定量能力,应用于dmd基因缺陷携带检测兼具了准确性高和成本低的优势。数字pcr的原理是将反应体系分割为尽可能多的微小反应单元，以液滴形式或芯片微孔形式均可。每个反应单元中均含有进行pcr所需的酶、引物探针及其他成分，模板则随机分布在这些反应单元中，大部分反应单元仅包含一段模板序列。通过扩增后反应单元给出的荧光信号即可区分不同模板序列在样品中的存在情况。最终可以将所有反应单元的荧光信号情况以二维散点图的形式呈现。由于二维平面理论上可容纳并区分很多种类的反应单元信号，因此有潜力用于多重检测(如图1和图2所示)。

7、上述现有的pcr体系仅能对突变进行定性检测，并不进行突变的定量检测，更为重要的是，这些现有技术并没有考虑pcr检测技术本身的特异性，精密度和灵敏度，而较高的特异性，精密度和灵敏度则是超多重数字pcr检测必不可少的条件，较低特异性，精密度和灵敏度的pcr技术无法精确地测定突变的种类和数量，因此如何提高超多重数字pcr检测方法的特异性，精密度和灵敏度是一项亟待解决的问题，同时解决这一问题对于发挥超多重数字pcr检测方法的定量检测优势也至关重要。

技术实现思路

1、本申请旨在基于以上的调研分析，针对dmd基因的全部79个外显子设计引物对及探针，利用合理设计的引物混合物提高超多重数字pcr技术的特异性，精密度和灵敏度。

2、本发明提供如下技术方案：

3、一种用于dmd基因检测的数字pcr检测试剂，包括seq id no:1～seq id no:158所示的外显子引物序列。

4、优选地，还包括seq id no:159～seq id no:237所示的外显子探针序列。

5、优选地，还包括seq id no:238～seq id no:277所示的内参引物序列及seq idno:278～seq id no:297所示的内参探针序列。

6、一种超多重数字pcr检测方法，包含如下步骤：

7、s1、配制pcr反应体系；所述pcr反应体系包含权利要求3中所述引物和探针序列混合物；

8、s2、在液滴生成芯片中加入混合好的pcr反应体系和微滴生成油，将液滴生成芯片放入样本制备仪进行微滴生成；

9、s3、微滴生成完毕后，将微滴转移至pcr板，并封膜；

10、s4、将pcr板在pcr仪上进行扩增；

11、s5、pcr扩增反应完成后，将pcr板置于阅读仪中进行微滴检测和结果分析；

12、优选地，所述pcr反应的体系为：

13、

14、

15、所述dmd引物混合液中99对引物等量添加，99条探针依据信号分布浓度呈梯度变化。

16、优选地，每条引物的添加终浓度是200nm；所述信号共分7阶，位于1阶的探针终浓度是20nm，2阶的探针终浓度是40nm，3阶的探针终浓度是60nm，4阶的探针终浓度是90nm，5阶的探针终浓度是120nm，6阶的探针终浓度是150nm，7阶的探针终浓度是190nm。

17、优选地，所述pcr反应液的成分包含50mm tris-hcl、35mm kcl、3.5mm mgcl2、0.5mm dntp、6mm甘油、0.3mm edta、0.5μg/μl bsa；所述dna聚合酶浓度为0.08u/μl。

18、优选地，所述样本为人基因组dna。如提取自新生儿外周血的白细胞的基因组dna。

19、优选地，所述pcr反应条件为：

20、

21、本发明取得的有益效果：

22、本发明在引物和探针设计优化基础上对提高数字pcr的信号分辨能力进行了优化。本发明针对dmd的79个外显子，基于超多重pcr技术各设计1对引物探针对每个外显子分别进行拷贝数定量检测，同时对x染色体上不包含dmd基因的片段中挑选20个不同位点设计20对引物探针进行拷贝数定量检测作为内参。通过判断每个外显子拷贝数定量结果与x染色体20重定量结果的1/20是否一致，即可得到dmd基因每个外显子是否发生了缺失、重复等缺陷，及这种缺陷的丰度是100％纯合致病还是50％杂合携带。实现了dmd所有外显子的多重定量。

技术特征：

1.一种用于dmd基因检测的数字pcr检测试剂，其特征在于，包括seq id no:1～seq idno:158所示的外显子引物序列。

2.根据权利要求1所述一种用于dmd基因检测的数字pcr检测试剂，其特征在于，还包括seq id no:159～seq id no:237所示的外显子探针序列。

3.根据权利要求2所述一种用于dmd基因检测的数字pcr检测试剂，其特征在于，还包括seq id no:238～seq id no:277所示的内参引物序列及seq id no:278～seq idno:297所示的内参探针序列。

4.一种超多重数字pcr检测方法，其特征在于，包含如下步骤：

5.根据权利要求4所述一种超多重数字pcr检测方法，其特征在于，所述pcr反应的体系为：

6.根据权利要求5所述一种超多重数字pcr检测方法，其特征在于，每条引物的添加终浓度是200nm；所述信号共分7阶，位于1阶的探针终浓度是20nm，2阶的探针终浓度是40nm，3阶的探针终浓度是60nm，4阶的探针终浓度是90nm，5阶的探针终浓度是120nm，6阶的探针终浓度是150nm，7阶的探针终浓度是190nm。

7.根据权利要求5所述一种超多重数字pcr检测方法，其特征在于，所述pcr反应液的成分包含50mm tris-hcl、35mm kcl、3.5mm mgcl2、0.5mm dntp、6mm甘油、0.3mm edta、0.5μg/μl bsa；所述dna聚合酶浓度为0.08u/μl。

8.根据权利要求5所述一种超多重数字pcr检测方法，其特征在于，所述样本为人基因组dna。

9.根据权利要求5所述一种超多重数字pcr检测方法，其特征在于，所述人基因组dna提取自新生儿外周血的白细胞。

10.根据权利要求5所述一种超多重数字pcr检测方法，其特征在于，所述pcr反应条件为：

技术总结
本申请公开了一种用于DMD基因检测的数字PCR检测试剂，涉及基因检测技术领域，包括包括SEQ ID NO:1～NO:237所示的外显子引物和探针序列及SEQ ID NO:238～SEQ IDNO:297所示的内参探针序列。本发明在引物和探针设计优化基础上对提高数字PCR的信号分辨能力进行了优化，针对DMD的79个外显子，基于超多重PCR技术各设计1对引物探针对每个外显子分别进行拷贝数定量检测，同时对X染色体上不包含DMD基因的片段中挑选20个不同位点设计20对引物探针进行拷贝数定量检测作为内参，实现了DMD所有外显子的多重定量。

技术研发人员：陈松长,徐晨明,张丽,黄荷凤,吴琰婷,金丽
受保护的技术使用者：复旦大学附属妇产科医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11