羰基还原酶突变体及其在环戊二酮类化合物还原中的应用

羰基还原酶突变体及其在环戊二酮类化合物还原中的应用
1.本技术是申请日为2018年5月31日、申请号为201810555674.6、发明名称为“羰基还原酶突变体及其在环戊二酮类化合物还原中的应用”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及酶及酶工程领域，具体地，本发明涉及羰基还原酶突变体及其在环戊二酮类化合物还原中的应用。


背景技术：

3.对2,2-双取代的环戊二酮的羰基不对称还原是合成许多药物关键中间体的有效途径，例如在激素类药物中的左炔诺孕酮及其羟化物。左炔诺孕酮(式i)是目前我国市场上最为常见的紧急避孕药品为单方孕激素药品——左炔诺孕酮片的有效成分(每片0.75mg或每片1.5mg)，已纳入了我国的《国家非处方药药品目录》。
[0004][0005]
左炔诺孕酮的合成路线中涉及到了通过对双羰基中间体的不对称还原合成手性中间体，目前的生产路线是通过利用酿酒酵母转化制备手性中间体(路线1)。该路线的转化需要首先对酿酒酵母进行两天至三天的培养，随后加入底物乙基缩合物，而乙基缩合物的浓度为4g/l，转化时间最短的报道为3天。近几年的报道中仍然是野生菌对乙基缩合物的报道，如利用pichia minuta cbs 1708实现乙基缩合物的转化，但是反应产物的ee值仅为90％，无法满足对立体选择性的要求。
[0006][0007]
利用野生菌进行转化不仅培养菌体时间长，而且由于野生菌中不会过量表达需要的羰基还原酶进行转化，因此催化效率低。
[0008]
因此本领域迫切需要开发高效的羰基还原酶，从而实现环戊二酮类化合物，尤其是乙基缩合物的高立体选择性转化。


技术实现要素：

[0009]
本发明提供了一种高效的羰基还原酶，从而实现环戊酮醇的高立体选择性合成。
[0010]
本发明第一方面提供了一种羰基还原酶突变蛋白，所述的突变蛋白为非天然蛋白，且所述突变蛋白具有催化环戊二酮类化合物生成环戊酮醇化合物的催化活性，并且所述突变蛋白在野生型的羰基还原酶的对应于seq id no.:1的选自下组的四个或四个以上与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：
[0011]
第91位异亮氨酸(i)；
[0012]
第92位谷氨酸(e)；
[0013]
第93位谷氨酰胺(q)；
[0014]
第142位亮氨酸(l)；
[0015]
第144位亮氨酸(l)；
[0016]
第147位组氨酸(h)；
[0017]
第150位酪氨酸(y)；
[0018]
第187位异亮氨酸(i)；
[0019]
第188位异亮氨酸(i)；
[0020]
第191位谷氨酰胺(q)；
[0021]
第201位亮氨酸(l)；
[0022]
第204位赖氨酸(k)；
[0023]
第205位苯丙氨酸(f)；和
[0024]
第246位亮氨酸(l)。
[0025]
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的羰基还原酶的对应于seq id no.:1的选自下组与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：
[0026]
第91位异亮氨酸(i)；
[0027]
第92位谷氨酸(e)；
[0028]
第93位谷氨酰胺(q)；
[0029]
第142位亮氨酸(l)；
[0030]
第144位亮氨酸(l)；
[0031]
第147位组氨酸(h)；
[0032]
第150位；酪氨酸(y)；
[0033]
第187位异亮氨酸(i)；
[0034]
第188位异亮氨酸(i)；
[0035]
第191位谷氨酰胺(q)；
[0036]
第201位亮氨酸(l)；
[0037]
第204位赖氨酸(k)；
[0038]
第205位苯丙氨酸(f)；和
[0039]
第246位亮氨酸(l)。
[0040]
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的羰基还原酶的对应于seq id no.:1的选自下组与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：
[0041]
第91位异亮氨酸(i)；
[0042]
第92位谷氨酸(e)；
[0043]
第93位谷氨酰胺(q)；
[0044]
第142位亮氨酸(l)；
[0045]
第144位亮氨酸(l)；
[0046]
第147位组氨酸(h)；
[0047]
第150位酪氨酸(y)；
[0048]
第187位异亮氨酸(i)；
[0049]
第188位异亮氨酸(i)；
[0050]
第191位谷氨酰胺(q)；
[0051]
第201位亮氨酸(l)；
[0052]
第204位赖氨酸(k)；和
[0053]
第205位苯丙氨酸(f)。
[0054]
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的羰基还原酶的对应于seq id no.:1的选自下组与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：
[0055]
第91位异亮氨酸(i)；
[0056]
第187位异亮氨酸(i)；
[0057]
第188位异亮氨酸(i)；
[0058]
第204位赖氨酸(k)；和
[0059]
第205位苯丙氨酸(f)。
[0060]
在另一优选例中，所述突变蛋白在野生型的羰基还原酶的对应于seq id no.:1的选自下组与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变：
[0061]
第91位异亮氨酸(i)；
[0062]
第187位异亮氨酸(i)；
[0063]
第188位异亮氨酸(i)；和
[0064]
第205位苯丙氨酸(f)。
[0065]
在另一优选例中，第91位异亮氨酸(i)突变为丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、或其组合，优选丙氨酸(a)和/或缬氨酸(v)。
[0066]
在另一优选例中，所述第92位谷氨酸(e)突变为缬氨酸(v)、亮氨酸(l)、或其组合，优选缬氨酸(v)。
[0067]
在另一优选例中，所述第93位谷氨酰胺(q)突变为谷氨酸(e)、天冬氨酸(d)、或其组合，优选谷氨酸(e)。
[0068]
在另一优选例中，所述第142位亮氨酸(l)突变为缬氨酸(v)、丙氨酸(a)、甘氨酸(g)、或其组合，优选缬氨酸(v)。
[0069]
在另一优选例中，所述第144位亮氨酸(l)突变为丙氨酸(a)、缬氨酸(v)、或其组合，优选丙氨酸(a)。
[0070]
在另一优选例中，所述第147位组氨酸(h)突变为苯丙氨酸(f)、亮氨酸(l)、或其组合，优选苯丙氨酸(f)。
[0071]
在另一优选例中，所述第150位酪氨酸(y)突变为甘氨酸(g)、丙氨酸(a)、或其组合，优选甘氨酸(g)。
[0072]
在另一优选例中，第187位异亮氨酸(i)突变为苏氨酸(t)、丝氨酸(s)、或其组合，优选丝氨酸(s)。
2000％。
[0096]
在另一优选例中，所述羰基还原酶的突变蛋白具有选自下组的一个或多个特征：
[0097]
(a)与野生型的羰基还原酶相比，催化获得的环戊酮醇化合物的2r，3s手性产物的比例≥85％，较佳地，≥90％，更佳地95-99％；
[0098]
(b)与野生型的羰基还原酶相比，催化获得的环戊酮醇化合物的产率≥95％，较佳地，≥98％；
[0099]
(c)与野生型的羰基还原酶相比，催化获得的环戊酮醇化合物的时空产率为0.1-6g/l.h，较佳地，2-4g/l.h；
[0100]
(d)与野生型的羰基还原酶相比，催化获得的环戊酮醇化合物的ee值≥95％，较佳地，》98％；
[0101]
(e)与野生型的羰基还原酶相比，催化获得的环戊酮醇化合物含量》99％，并且无环戊二醇产物生成。
[0102]
本发明第二方面提供了一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的突变蛋白。
[0103]
在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：
[0104]
(a)编码如seq id no.:6－9任一所示的多肽；
[0105]
(b)序列如seq id no.：2-5任一所示的多核苷酸；
[0106]
(c)核苷酸序列与seq id no.:2-5任一所示序列的同源性≥95％(较佳地≥98％)，且编码seq id no.:1，6-9任一所示多肽的多核苷酸；
[0107]
(d)与(a)-(c)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。
[0108]
在另一优选例中，所述的多核苷酸在羰基还原酶的突变蛋白的orf的侧翼还额外含有选自下组的辅助元件：信号肽、分泌肽、标签序列(如6his)、或其组合。
[0109]
在另一优选例中，所述的多核苷酸选自下组：dna序列、rna序列、或其组合。
[0110]
本发明第三方面提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸。
[0111]
在另一优选例中，所述载体包括表达载体、穿梭载体、整合载体。
[0112]
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。
[0113]
在另一优选例中，所述的宿主细胞为真核细胞，如酵母细胞或植物细胞。
[0114]
在另一优选例中，所述的宿主细胞为原核细胞，如大肠杆菌。
[0115]
本发明第五方面提供了一种产生本发明第一方面所述的羰基还原酶的突变蛋白的方法，包括步骤：
[0116]
在适合表达的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出羰基还原酶的突变蛋白；和/或
[0117]
分离所述羰基还原酶的突变蛋白。
[0118]
本发明第六方面提供了一种酶制剂，所述酶制剂包含本发明第一方面所述的羰基还原酶的突变蛋白。
[0119]
在另一优选例中，所述的酶制剂包括注射剂、和/或冻干制剂。
[0120]
本发明第七方面提供了一种制备环戊酮醇化合物的方法，包括步骤：
[0121]
(i)将本发明第一方面所述的羰基还原酶的突变蛋白与反应底物接触，进行催化反应，从而获得所述环戊酮醇化合物；和
[0122]
(i i)任选地，分离并纯化所述环戊酮醇化合物。
[0123]
在另一优选例中，所述环戊酮醇化合物为手性环戊酮醇化合物。
[0124]
在另一优选例中，在步骤(i)中，在辅因子存在下，所述羰基还原酶的突变蛋白与辅酶再生体系共同作用。
[0125]
在另一优选例中，所述辅酶再生体系选自下组：葡萄糖脱氢酶/葡萄糖、甲酸脱氢酶/甲酸钠、或其组合。
[0126]
在另一优选例中，所述辅因子包括：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化态(如nadp+)、和/或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸还原态(如nadph)。
[0127]
在另一优选例中，所述反应底物为环戊二酮类化合物。
[0128]
在另一优选例中，在步骤(i)中，所述催化反应的时间为2-20h，较佳地，3-10h，更佳地，6-8h。
[0129]
在另一优选例中，在步骤(i)中，所述催化反应的温度为20-40℃，较佳地，25-35℃，更佳地，28-32℃。
[0130]
本发明第八方面提供了一种本发明第一方面所述的突变蛋白的用途，所述的突变蛋白用于催化环戊二酮类化合物生成环戊酮醇化合物，或被用于制备催化环戊二酮类化合物生成环戊酮醇化合物的催化制剂。
[0131]
本发明第九方面提供了一种本发明第一方面所述的突变蛋白或本发明第四方面所述的宿主细胞的用途，用于制备环戊酮醇化合物。
[0132]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0133]
图1显示了rasadh突变体蛋白经过纯化后结果。
[0134]
其中，m表示marker，1为代表性突变体蛋白
具体实施方式
[0135]
通过广泛而深入的研究，本发明人通过大量筛选，意外的筛到了可显著提高羰基还原酶的突变蛋白催化活性的关键氨基酸位点。本发明发现，对本发明的野生型的羰基还原酶中的关键位点进行改造后，可以显著提高羰基还原酶的催化活性、提高2r、3s手性产物的比例、提高环状戊酮醇化合物的产率、时空产率、ee、de值。在此基础上，本发明人完成了本发明。
[0136]
术语
[0137]
如本文所用，术语“axxb”表示第xx位的氨基酸a变为氨基酸b，例如“l87i”表示第87位的氨基酸l突变为i，以此类推。
[0138]
本发明突变蛋白及其编码核酸
[0139]
如本文所用，术语“突变蛋白”、“本发明突变蛋白”、“本发明羰基还原酶突变蛋
白”、“本方面羰基还原酶突变体”可互换使用，均指非天然存在的羰基还原酶突变蛋白，且所述突变蛋白为基于seq id no.:1所示蛋白进行人工改造的蛋白，其中，所述的突变蛋白含有与酶催化活性相关的核心氨基酸，且所述核心氨基酸中至少有一个是经过人工改造的；并且本发明突变蛋白具有催化环戊二酮类化合物形成环戊酮醇化合物的酶活性。
[0140]
术语“核心氨基酸”指的是基于seq id no.:1，且与seq id no.:1同源性达至少80％，如84％、85％、90％、92％、95％、98％的序列中，相应位点是本文所述的特定氨基酸，如基于seq id no.:1所示的序列，核心氨基酸为：
[0141]
第91位异亮氨酸(i)；和/或
[0142]
第92位谷氨酸(e)；和/或
[0143]
第93位谷氨酰胺(q)；和/或
[0144]
第142位亮氨酸(l)；和/或
[0145]
第144位亮氨酸(l)；和/或
[0146]
第147位组氨酸(h)；和/或
[0147]
第150位酪氨酸(y)；和/或
[0148]
第187位异亮氨酸(i)；和/或
[0149]
第188位异亮氨酸(i)；和/或
[0150]
第191位谷氨酰胺(q)；和/或
[0151]
第201位亮氨酸(l)；和/或
[0152]
第204位赖氨酸(k)；和/或
[0153]
第205位苯丙氨酸(f)；和/或
[0154]
第246位亮氨酸(l)。
[0155]
且对上述核心氨基酸进行突变所得到的突变蛋白具有催化环戊二酮类化合物形成环戊酮醇化合物的酶活性。
[0156]
优选地，在本发明中，对本发明的所述核心氨基酸进行如下突变，如表1所示。
[0157]
表1
[0158]
位置野生型最优选突变体突变位点1(第91位氨基酸)ia或v突变位点2(第92位氨基酸)ev突变位点3(第93位氨基酸)qe突变位点4(第142位氨基酸)lv突变位点5(第144位氨基酸)la突变位点6(第147位氨基酸)hf突变位点7(第150位氨基酸)yg突变位点8(第187位氨基酸)is突变位点9(第188位氨基酸)il突变位点10(第191位氨基酸)qn突变位点11(第201位氨基酸)lp突变位点12(第204位氨基酸)kt突变位点13(第205位氨基酸)fa
突变位点14(第246位氨基酸)lc
[0159]
应理解，本发明突变蛋白中的氨基酸编号基于seq id no.:1作出，当某一具体突变蛋白与seq id no.:1所示序列的同源性达到80％或以上时，突变蛋白的氨基酸编号可能会有相对于seq id no.:1)的氨基酸编号的错位，如向氨基酸的n末端或c末端错位1-5位，而采用本领域常规的序列比对技术，本领域技术人员通常可以理解这样的错位是在合理范围内的，且不应当由于氨基酸编号的错位而使同源性达80％(如90％、95％、98％)的、具有相同或相似产生环戊二酮化合物催化活性的突变蛋白不在本发明突变蛋白的范围内。
[0160]
本发明突变蛋白是合成蛋白或重组蛋白，即可以是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的突变蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的突变蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
[0161]
本发明还包括所述突变蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述突变蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。
[0162]
本发明的突变蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的突变蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的突变蛋白，或(iii)成熟突变蛋白与另一个化合物(比如延长突变蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的突变蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此突变蛋白序列而形成的突变蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此突变蛋白的序列或蛋白原序列，或与抗原igg片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。本发明中，保守性替换的氨基酸最好根据表i进行氨基酸替换而产生。
[0163]
表i
[0164]
最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaala
ser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu
[0165]
本发明的活性突变蛋白具有催化环戊二酮类化合物形成环戊酮醇化合物的酶活性。
[0166]
优选地，所述的突变蛋白如seq id no.:6，7，8，9所示。应理解，本发明突变蛋白与seq id no.:6，7，8，9所示的序列相比，通常具有较高的同源性(相同性)，优选地，所述的突变蛋白与seq id no.:6，7，8，9所示序列的同源性至少为80％，较佳地至少为85％-90％，更佳地至少为95％，最佳地至少为98％，最佳地，≥99％。此外，还可以对本发明突变蛋白进行修饰。修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的突变蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在突变蛋白的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的突变蛋白。这种修饰可以通过将突变蛋白暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的突变蛋白。
[0167]
术语“编码突变蛋白的多核苷酸”可以是包括编码本发明突变蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
[0168]
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或突变蛋白的片段、类似物和衍生物。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的突变蛋白的功能。
[0169]
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2
×
ssc，0.1％sds，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。
[0170]
本发明的突变蛋白和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地，被纯化至均质。
[0171]
本发明多核苷酸全长序列通常可以通过pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0172]
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0173]
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0174]
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
[0175]
应用pcr技术扩增dna/rna的方法被优选用于获得本发明的多核苷酸。特别是很难从文库中得到全长的cdna时，可优选使用race法(race-cdna末端快速扩增法)，用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。
[0176]
本发明的羰基还原酶具有宽广的底物谱，对一系列环戊二酮类底物均具有高的反应活性及立体选择性，尤其对乙基缩合物立体选择性高。
[0177]
在本发明的一优选实施方式中，本发明所述重组羰基还原酶的制备方法为：培养如上所述的重组表达转化体，获得重组表达的羰基还原酶。其中所述的培养重组表达转化体所用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明的重组羰基还原酶的培养基。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同，按本领域常规知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并生产羰基还原酶即可。
[0178]
在本发明的一优选实施方式中，本发明的羰基还原酶突变体(rasadh突变体)的制备方法如下：大肠杆菌作为表达宿主。
[0179]
具体地，该制备方法包括以下步骤：(1)rasadh相应突变位点的基因构建到pet21a表达载体上，获得带有目的酶基因的重组质粒。(2)将重组质粒转入宿主菌细胞(优选大肠杆菌bl21(de3))，获得相应的工程菌株。(3)将工程菌株接种至l-b培养基中，25℃培养16小时。(4)离心收集菌体，破菌留取上清液。
[0180]
本发明还提供了利用rasadh及突变体重组菌作为生物催化剂转化环戊二酮的方法。具体地，将环戊二酮底物与重组菌或者破菌液、纯酶构建反应体系，利用葡萄糖脱氢酶、葡萄糖或者甲酸脱氢酶、甲酸钠实现辅因子nadph的再生。反应体系为ph 6.0-9.0的缓冲溶液，反应温度为20℃到45℃。
[0181]
待不对称还原反应结束后，反应液用等量本领域常规的水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醚、甲基叔丁基醚等进行萃取，重复萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，即得光学纯手性产物，进一步通过常规方法，比如减压蒸馏、重结晶等方法进行纯化即可得高度化学纯和光学纯的产物。
[0182]
野生型羰基还原酶
[0183]
如本文所用，“野生型羰基还原酶”是指天然存在的、未经过人工改造的羰基还原酶，其核苷酸可以通过基因工程技术来获得，如基因组测序、聚合酶链式反应(pcr)等，其氨基酸序列可由核苷酸序列推导而得到。所述野生型羰基还原酶的氨基酸序列如seq id no.:1所示。
[0184]
上述涉及的野生蛋白、本发明突变蛋白的序列信息如表2(见实施例)所示。
[0185]
表达载体
[0186]
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或本发明突变蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
[0187]
通过常规的重组dna技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重
组的突变蛋白。一般来说有以下步骤：
[0188]
(1).用本发明的编码本发明突变蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0189]
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0190]
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0191]
本发明中，编码突变蛋白的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
[0192]
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明突变蛋白编码dna序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mrna合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体pl启动子；真核启动子包括cmv立即早期启动子、hsv胸苷激酶启动子、早期和晚期sv40启动子、反转录病毒的ltrs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0193]
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0194]
包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0195]
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母。
[0196]
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是dna的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的sv40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
[0197]
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
[0198]
用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0199]
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0200]
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如
果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0201]
本发明的所述羰基还原酶基因的启动子可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或使用不同来源的更有效的启动子进行完全替换，可提高所述羰基还原酶的表达水平。
[0202]
本发明的所述重组表达载体可通过本领域常规方法将上述羰基还原酶基因克隆到各种载体上构建而成。所述的表达载体较佳地包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体对于大肠杆菌优选地为pet28a质粒。
[0203]
本发明的主要优点包括：
[0204]
(i)经大量筛选和改造，本发明首次发现了羰基还原酶的催化活性位点，改造了相关位点后，能够显著提高羰基还原酶的催化活性、提高2r、3s手性产物的比例、提高环状戊酮醇化合物的产率(等同于产量)、时空产率、以及ee值。
[0205]
(ii)本发明首次发现一种能够提高对乙基缩合物，尤其是环戊二酮类化合物底物活力和立体选择性的羰基还原酶(rasadh突变体蛋白质)。
[0206]
(iii)本发明的羰基还原酶具有宽广的底物谱，对一系列环戊二酮类化合物底物均具有高的反应活性及立体选择性，尤其对乙基缩合物立体选择性高。
[0207]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0208]
除非有特别说明，否则本发明实施例中的试剂和材料均为市售产品。
[0209]
实施例1rasadh羰基还原酶重组表达质粒和重组表达转化体的制备
[0210]
将seq id no.1的序列全合成后连接到pet 28a空质粒同时用限制性内切酶bamhi和hindiii双酶切过夜，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、dna试剂盒回收。将回收的酶切目的片段和空载体在t4dna连接酶的作用下，于4℃连接12小时，得到重组质粒pet28a-rasadh，进一步转化至e.coli bl21(de3)，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体e.coli bl21(de3)/pet28a-rasadh。
[0211]
实施例2羰基还原酶rasadh突变体构建
[0212]
构建羰基还原酶rasadh的突变库：根据rasadh的晶体结构，选取其底物结合口袋内非保守残基、底物通道氨基酸，分组进行组合饱和突变，采用简并密码子ndt设计突变引物，以pet28a-rasadh作为模板，用高保真聚合酶primestar进行pcr。pcr反应条件如下：总体积为20μl的pcr反应体系中，加入模板0.5～20ng，10μl 2
×
primestar(premix)，一对突变引物各0.4μl(10μm)，加灭菌蒸馏水至20μl。pcr反应程序：(1)98℃变性10sec，(2)55℃退火5sec，(3)72℃延伸60sec，步骤(1)～(3)共进行30个循环，4℃保存产物。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后加入限内酶dpni在37℃消化1h。将消化产物转入e.coli bl21(de3)感受态细胞并涂布于含有卡那抗生素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得
到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对表达的蛋白进行高通量活力筛选，对活性较高的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。
[0213]
其中，代表性的突变体2的蛋白序列如seq id no.:6所示，其核苷酸序列如seq id no.:2所示。
[0214]
突变体3的蛋白序列如seq id no.:7所示，其核苷酸序列如seq id no.:3所示。
[0215]
突变体5的蛋白序列如seq id no.:8所示，其核苷酸序列如seq id no.:4所示。
[0216]
突变体6的蛋白序列如seq id no.:9所示，其核苷酸序列如seq id no.:5所示。
[0217]
表2提供本发明的具有相关活性以及较高2r，3s手性产物所占比例(％)的特定序列的羰基还原酶rasadh突变体的列表。
[0218]
在下表中，序列标号分别指表1后面的一系列序列，在活性列中，一个加号“+”表示突变体蛋白比由序列表中seq id no.1(野生型羧基还原酶)所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了1～5倍；两个加号“++”表示突变体蛋白比seq id no.1所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了5～10倍，三个加号“+++”表示突变体蛋白比seq id no.1所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了10倍以上。
[0219]
表2
[0220]
[0221][0222]
实施例3：羰基还原酶rasadh突变体的诱导表达及纯化
[0223]
配置种子液50ml，培养基为lb液体培养基(蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl 10g/l)，用接种环挑取基因工程菌单菌落接入培养基中，37℃，200rpm培养过夜。将过夜培养的种子液以1％的接种量转接到发酵培养基(lb培养基)，37℃，200rpm培养至a
600 0.6-1.0左右，加入0.25mm的iptg，并置于37℃，200rpm诱导10～12h。4℃，6000rpm条件下离心收集菌体，用磷酸钠缓冲液(50mm，ph 7.5)清洗两遍，并用高压匀浆机破碎，13000rpm离心留取上清液，然后采用金属亲和层析(镍柱)法纯化回收目的蛋白，目的蛋白经透析除去咪唑后即得rasadh突变体纯酶液。sds-page电泳图谱显示纯化所得蛋白条带单一，如图1所示。
[0224]
结果表明，本实施例的方法能够获得较纯的蛋白突变体，分子量为27kd，纯度》95％。
[0225]
实施例4 rasadh突变体的底物谱
[0226]
构建反应检测底物转化率及产物立体选择性：1ml，ph 7.0-7.5，浓度为100mm的磷酸钠缓冲液，0.1mm的nadp
+
和10mm的不同环戊二酮底物，30mm葡萄糖，0.2u葡萄糖脱氢酶，加入适量纯酶液，反应过夜后hplc检测。产物测定方法：aglient高效液相色谱仪，色谱柱：daicel od-h(3μm，4.6
×
150mm)，流动相：正己烷-异丙醇(v/v＝95:5)，检测波长：254nm，柱温：30℃，流速：0.8ml/min。
[0227]
结果表明，rasadh突变体能够高效的转化环戊二酮类化合物(如乙基缩合物)为
2r,3s-环戊酮醇，转化产物的ee，de值均》98％。
[0228]
实施例5 rasadh突变体重组菌转化环戊二酮的方法
[0229]
按照实施例2的方法诱导表达本发明的rasadh突变体，离心收集菌体(8000rpm)，并以磷酸钾缓冲液(ph 7.0，100mm)洗涤菌体2次，以菌体作为生物催化剂。
[0230]
(1)取菌体重悬于10ml磷酸钾缓冲液(ph 7.0，100mm)，菌体浓度为20g/l，加入底物环戊二酮(10％v/v乙醇或dmf)至终浓度为10g/l，辅助底物葡萄糖30g/l，30℃，200r/min的摇床上反应，8h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。hplc检测，产率(等同于产量)为95％，时空产率为2.40g/(l.h)，ee，de值均》98％。
[0231]
(2)取菌体重悬于10ml磷酸钾缓冲液(ph 7.0，100mm)，菌体浓度为50g/l，加入底物环戊二酮(10％v/v乙醇或dmf)至终浓度为40g/l，辅助底物葡萄糖60g/l，30℃，200r/min的摇床上反应，12h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。hplc检测，产率为95％，时空产率为3.96g/(l.h)，ee，de值均》98％。
[0232]
(3)取菌体重悬于10ml磷酸钾缓冲液(ph 7.0，100mm)，菌体浓度为50g/l，加入底物乙基缩合物(10％v/v乙醇或dmf)至终浓度为20g/l，辅助底物葡萄糖40g/l，30℃，200r/min的摇床上反应，12h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。hplc检测，产率为95％，时空产率为2.40g/(l.h)，ee，de值均》98％。
[0233]
(4)取菌体重悬于10ml磷酸钾缓冲液(ph 7.0，100mm)，菌体浓度为50g/l，加入底物乙基缩合物(10％v/v乙醇或dmf)至终浓度为40g/l，辅助底物葡萄糖60g/l，30℃，200r/min的摇床上反应，12h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。hplc检测，产率为95％，时空产率为3.96g/(l.h)，ee，de值均》98％。
[0234]
(5)取菌体重悬于1l磷酸钾缓冲液(ph 7.0，100mm)，菌体浓度为50g/l，加入底物乙基缩合物(10％v/v乙醇或dmf)至终浓度为40g/l，辅助底物葡萄糖60g/l，30℃，200r/min的摇床上反应，12h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。hplc检测，产率为95％，时空产率为3.96g/(l.h)，ee，de值均》98％。
[0235]
(6)取菌体重悬于10ml磷酸钾缓冲液(ph 7.0，100mm)，菌体浓度为50g/l，加入底物环戊二酮(r取代基团为乙烯基)(10％v/v乙醇或dmf)至终浓度为40g/l，辅助底物葡萄糖60g/l，30℃，200r/min的摇床上反应，12h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。hplc检测，产率为95％，时空产率为3.96g/(l.h)，ee，de值均》98％。
[0236]
(7)取菌体重悬于10ml磷酸钾缓冲液(ph 7.0，100mm)，菌体浓度为50g/l，加入底物环戊二酮(r取代基团为乙炔基)(10％v/v乙醇或dmf)至终浓度为40g/l，辅助底物葡萄糖60g/l，30℃，200r/min的摇床上反应，12h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。hplc检测，产率为95％，时空产率为3.96g/(l.h)，ee，de值均》98％。
[0237]
(8)取菌体重悬于10ml磷酸钾缓冲液(ph 7.0，100mm)，菌体浓度为50g/l，加入底物环戊二酮(r取代基团为苯基)(10％v/v乙醇或dmf)至终浓度为40g/l，辅助底物葡萄糖60g/l，30℃，200r/min的摇床上反应，12h后停止反应。反应结束后，用乙酸乙酯萃取反应液数次，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。hplc检测，产率为95％，时空产率为3.96g/(l.h)，ee，de值均》98％。
[0238]
具体结果见表3。
[0239]
表3
[0240]
[0241][0242]
结果表明，与野生型的羰基还原酶相比，本发明的羰基还原酶的突变蛋白可显著提高2r,3s-环戊酮醇的产率、时空产率、ee、de值。
[0243]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。