一种高表达CD106和/或CD142表达降低的间充质干细胞群、其制备方法及应用与流程

一种高表达cd106和/或cd142表达降低的间充质干细胞群、其制备方法及应用
技术领域
1.本发明涉及干细胞培养及生物医药领域。具体的，涉及一种高表达cd106和/或cd142表达降低的间充质干细胞群，其制备方法、培养物及其应用。所述间充质干细胞群经炎症因子（ifn-γ和/或tnf-α）培养后，免疫调节因子cd106表达量增加，和/或cd142组织因子（cd142/tf）表达量降低，可选的，同时间充质干细胞群的免疫调节因子cd274表达量及迁移/趋化能力的增加，但cd80表达无变化。


背景技术：

2.间充质干细胞（mesenchymal stem cell, mscs）是起源于中胚层且具有很强自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。间充质干细胞具有促血管新生能力，可促进损伤组织再生修复、缓解多种免疫性或炎症性疾病，例如移植物抗宿主病（graft versus-host disease, gvhd），一种由异体供者移植物中的t淋巴细胞对宿主器官进行免疫攻击导致的疾病。它可通过直接细胞接触和/或可溶性因子的分泌来调节免疫活动，如抑制淋巴细胞增殖、抑制促炎性t细胞亚群并提升免疫抑制性t细胞亚群。由于其来源广泛、易分离培养、增殖能力强、免疫原性较低、免疫调节能力强、不存在伦理问题等特性被认为是极具潜力治愈炎性或免疫相关疾病的新技术。
3.cd106参与淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞等黏附于血管内皮。它能调节t细胞、b细胞和造血祖细胞迁移。研究表明，cd106高表达能提高mscs的免疫调节能力和造血祖细胞的迁移。现有通过流式分选技术提高纯化cd106阳性细胞的表达的方法，但这种方法具有诸多的缺陷：一是分选抗体成本高，二是容易污染且得率低往往不能满足治疗所需，三是分选后的cd106 阳性细胞在体外培养扩增过程中，细胞表达cd106也会丢失。
4.cd274（也称为pd-l1，b7h1 ）是pd-1（也称为cd273）和cd80的配体。cd274由抗原呈递细胞（apc）组成。cd80由naive t细胞表达，并在t细胞活化早期上调，而cd274在t细胞活化晚期表达。cd274/pd-l1和pd-1的相互作用，可以传导抑制性的信号，减低淋巴结cd8
+ t细胞的增生。pd-1还可以调节bcl-2基因，控制淋巴结中抗原特异性t细胞的聚积。研究表明，cd274（pd-l1））与cd80的相互作用会加重移植物抗宿主病的严重程度，而在没有pd-1的情况下，阻断cd274和cd80的相互作用可以改善急性gvhd。
5.组织因子（tissue factor, tf）也被称为细胞表面抗原cd142，是凝血因子ⅶ/ⅶa在细胞表面的受体和辅助因子，启动凝血级联反应。
6.机体免疫系统长期失调可导致多种炎症性疾病和自身免疫性疾病，包括炎症性肠病（ibd)、移植物抗宿主病（gvhd)、i型糖尿病等。mscs可通过直接细胞接触和/或可溶性因子的分泌来调节免疫活动，被认为是极具潜力治愈炎性或免疫相关疾病的新技术。但在体外扩增过程中细胞质量的下降、体内移植后细胞存活率低以及向靶向部位迁移的效率低限制了msc治疗的有效性，且不同来源的间充质干细胞组织因子表达也不同，可能会引发患者
群体的血液介导的即刻炎性反应（ibmir），并进一步增加血栓栓塞的风险。
7.有不少研究致力于提高mscs的免疫调节能力，例如，流式分选、多种炎症因子预处理和缺氧/低氧预处理。缺氧/低氧处理对培养环境及检测环境要求较高，流式分选会带来的人工成本和污染问题。但是对降低间充质干细胞组织因子的方法却从少有报道。
8.现有技术分离得到的间充质干细胞细胞在体外具有强大的免疫抑制能力，但是在临床治疗疾病疗效不均一，分离出来的mscs表面抗原cd274 比例 ≤ 2%，cd106阳性亚群比例为15 ~ 40%，且来自不同组织来源的 mscs cd142 比例不均一，在静脉注射时可能对患者具有潜在的风险。因此，现阶段研究致力于提高mscs的免疫调节及向靶向部位迁移能力的同时降低组织因子的表达，基于此，需要提高间充质干细胞cd106和/或降低cd142 的表达，同时提高间充质干细胞的免疫调节能力，对于开发更安全、更有效的mscs疗法和临床转化至关重要。


技术实现要素：

9.鉴于现有技术中的上述缺陷，本发明致力于提高mscs的免疫调节及向靶向部位迁移/趋化能力的同时降低组织因子的表达，旨在生产出更有效、更安全的细胞产品。因此：本发明第一方面，提供一种间充质干细胞群，所述间充质干细胞群高表达cd106和/或cd142表达降低，所述高表达cd106是指所述间充质干细胞群中cd106阳性亚群比例至少为45%，所述cd142表达降低是指所述间充质干细胞群培养后cd142阳性亚群比例降低至少4%。
10.优选的，所述间充质干细胞群高表达cd106；优选的，所述间充质干细胞群cd142表达降低；优选的，所述间充质干细胞群高表达cd106和cd142表达降低。
11.更优选的，所述间充质干细胞群还高表达cd274；和/或，所述间充质干细胞群的cd80表达量无变化。
12.更优选的，所述cd106阳性亚群比例至少为45%，可以是高于或等于45%的任一数值，例如至少45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、81%、82%、85%、86%、88%、90%，92%、95%，甚至更高，进一步优选的，所述cd106阳性亚群比例至少为80%。
13.更优选的，所述间充质干细胞群的cd142表达量降低是指所述cd142阳性亚群比例降低了至少4%，例如至少4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%等，进一步优选的，所述cd142阳性亚群比例降低了至少10%，例如至少10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%，22%、25%等等，在一个具体的实施方式中，所述cd142阳性亚群比例降低了20%以上。
14.更优选的，所述高表达cd274是指cd274阳性亚群比例至少20%，可以是高于或等于20%的任一数值，例如至少20%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、62%、65%、68%、70%、72%、75%、78%、80%、82%、85%、88%、90%、92%、95%等等。进一步优选的，所述高表达cd274是指cd274阳性亚群比例至少60%。
15.优选的，所述间充质干细胞群cd80表达量无变化，所述间充质干细胞群cd80表达量无变化是指间充质干细胞群培养前后间充质干细胞群的cd80表达量在统计学上没有显著性的差异。
16.本发明中，表达量和表达有着基本相同的含义，可以用阳性亚群比例来表示，例
如，高表达cd106意味着在间充质干细胞群中cd106阳性亚群比例高，cd142表达量降低意味着在间充质干细胞群中cd142阳性亚群比例降低，等等。
17.优选的，所述间充质干细胞群具有增强的细胞免疫抑制能力，例如，抑制外周血单个核细胞分泌tnf-α，th1细胞群体比例降低，免疫调节因子il-6和/或pge2分泌量增加。
18.在一个具体的实施方式中，所述间充质干细胞群抑制外周血单个核细胞tnf-α分泌，th1细胞群体比例降低，免疫调节因子il-6和pge2分泌量增加。
19.优选的，所述间充质干细胞群具有增强的细胞迁移/趋化能力。
20.优选的，所述间充质干细胞群经炎症因子培养，所述炎症因子包括ifn-γ和/或tnf-α。
21.优选的，所述炎症因子均为5-30ng/ml，优选为5-20 ng/ml，更优选为8-15 ng/ml，可以是5-30 ng/ml之间的任意数值，例如5.5、6.0、7.0、8.0、10、12、15、18、20、23、25、28、30ng/ml等等。
22.更优选的，所述炎症因子为ifn-γ。
23.所述间充质干细胞群高表达cd106；所述间充质干细胞群高表达cd274；所述间充质干细胞群的cd142表达降低；和，所述间充质干细胞群的cd80表达无变化；所述的间充质干细胞迁移/趋化能力增加；优选的，所述间充质干细胞群抑制外周血单个核细胞分泌tnf-α，th1细胞群体比例下降，和/或il-6和pge2的分泌量增加。
24.更优选的，所述炎症因子为tnf-α。
25.所述间充质干细胞群高表达cd106，cd142表达降低，和，所述间充质干细胞群的cd80表达不变；所述的间充质干细胞迁移/趋化能力增加；优选的，所述间充质干细胞群抑制外周血单个核细胞分泌tnf-α，th1细胞群体比例下降，和/或il-6和pge2的分泌量增加。
26.更优选的，所述炎症因子为ifn-γ和tnf-α。
27.所述间充质干细胞群高表达cd106；所述间充质干细胞群的cd142表达降低；所述间充质干细胞群高表达cd274，和，所述间充质干细胞群的cd80表达不增加；所述的间充质干细胞迁移/趋化能力增加；优选的，所述间充质干细胞群抑制外周血单个核细胞分泌tnf-α，th1细胞群体比例下降，il-6 和 pge2的分泌量增加。
28.在一个具体的实施方式中，所述炎症因子不包含ifn-γ和tnf-α之外的其它炎症因子。
29.本发明第二方面，提供一种炎症因子在培养高表达cd106和/或cd142表达降低的间充质干细胞群中的应用，所述炎症因子包括ifn-γ和/或tnf-α。
30.优选的，所述炎症因子均为5-30ng/ml，优选为5-20 ng/ml，更优选为8-15 ng/ml，
可以是5-30 ng/ml之间的任意数值，例如5.5、6.0、7.0、8.0、10、12、15、18、20、23、25、28、30ng/ml等等。
31.优选的，所述间充质干细胞群是本发明第一方面的间充质干细胞群。
32.优选的，所述炎症因子增强间充质干细胞群的免疫抑制能力和/或细胞迁移/趋化能力。
33.更优选的，所述炎症因子为ifn-γ。
34.所述间充质干细胞群高表达cd106；所述间充质干细胞群高表达cd274；所述间充质干细胞群的cd142表达降低；和，所述间充质干细胞群的cd80表达无变化；所述的间充质干细胞迁移/趋化能力增加；优选的，所述间充质干细胞群抑制外周血单个核细胞分泌tnf-α，th1细胞群体比例下降，和/或il-6和pge2的分泌量增加。
35.更优选的，所述炎症因子为tnf-α。
36.所述间充质干细胞群高表达cd106，cd142表达降低，和所述间充质干细胞群的cd80表达无变化；所述的间充质干细胞迁移/趋化能力增加；优选的，所述间充质干细胞群抑制外周血单个核细胞分泌tnf-α，th1细胞群体比例下降，和/或il-6和pge2的分泌量增加。
37.更优选的，所述炎症因子为ifn-γ和tnf-α。
38.所述间充质干细胞群高表达cd106；所述间充质干细胞群高表达cd274；所述间充质干细胞群的cd142表达降低；和，所述间充质干细胞群的cd80表达不增加。
39.所述的间充质干细胞迁移/趋化能力增加；优选的，所述间充质干细胞群抑制外周血单个核细胞分泌tnf-α，th1细胞群体比例下降，il-6 和 pge2的分泌量增加。
40.在一个具体的实施方式中，所述炎症因子不包含ifn-γ和tnf-α之外的其它炎症因子。
41.本发明第三方面，提供一种培养基，所述培养基包括基础培养基和炎症因子，所述炎症因子包括ifn-γ和/或tnf-α。
42.优选的，所述培养基的炎症因子均为5-30ng/ml，优选为5-20 ng/ml，更优选为8-15 ng/ml，可以是5-30 ng/ml之间的任意数值，例如5.5、6.0、7.0、8.0、10、12、15、18、20、23、25、28、30ng/ml等等。
43.更优选的，所述炎症因子为ifn-γ。
44.更优选的，所述炎症因子为tnf-α。
45.进一步优选的，所述炎症因子为ifn-γ和tnf-α。
46.在一个具体的实施方式中，所述炎症因子不包含ifn-γ和tnf-α之外的其它炎症因子。
47.优选的，所述基础培养基可以是任意适合间充质干细胞群培养的基础培养基。例如： msc无血清培养基、dmem/f12、tl、dmem、α-mem、f-12、mem及其任意组合；更优选的，所述基础培养基选自α-mem、dmem/f12、tl、dmem。进一步优选的，所述基础培养基是msc无血清培养基。
48.本发明第四方面，提供一种上述培养基在培养高表达cd106和/或cd142表达降低的间充质干细胞群中的应用。
49.优选的，所述间充质干细胞群是本发明第一方面的间充质干细胞群。
50.更优选的，所述培养基的炎症因子为ifn-γ。
51.所述间充质干细胞群高表达cd106；所述间充质干细胞群高表达cd274；所述间充质干细胞群的cd142表达降低；和，所述间充质干细胞群的cd80表达无变化。
52.所述的间充质干细胞迁移/趋化能力增加；优选的，所述间充质干细胞群tnf-α分泌量下降，th1细胞群体比例下降，il-6和pge2的分泌量增加。
53.更优选的，所述培养基的炎症因子为tnf-α。
54.所述间充质干细胞群高表达cd106，cd142表达降低，和/或，所述间充质干细胞群的cd80表达不增加。
55.优选的，所述间充质干细胞群tnf-α分泌量下降，th1细胞群体比例下降，il-6和pge2的分泌量增加。
56.所述的间充质干细胞迁移/趋化能力增加。
57.更优选的，所述培养基的炎症因子为ifn-γ和tnf-α。
58.所述间充质干细胞群高表达cd106所述间充质干细胞群高表达cd274；所述间充质干细胞群的cd142表达降低；和，所述间充质干细胞群的cd80表达不增加。
59.所述的间充质干细胞迁移/趋化能力增加。
60.优选的，所述间充质干细胞群tnf-α分泌量下降，th1细胞群体比例下降，il-6和pge2的分泌量增加。
61.在一个具体的实施方式中，所述炎症因子不包含ifn-γ和tnf-α之外的其它炎症因子。
62.本发明第五方面，提供一种高表达cd106和/或cd142表达降低的间充质干细胞群的制备方法，所述方法包括用上述任一的培养基对间充质干细胞群进行培养。
63.1）将间充质干细胞群进行培养；2）将间充质干细胞群培养至细胞融合度60
ꢀ‑ꢀ
70%，添加炎症因子。
64.优选的，在将间充质干细胞群进行培养之前包括对间充质干细胞群进行解冻复苏步骤。
65.更优选的，所述解冻复苏步骤包括水浴解冻细胞，将细胞重悬于缓冲液。
66.优选的，所述添加炎症因子后，培养16-30小时，更优选培养18-26小时，进一步优
选，培养20-24小时。
67.优选的，所述方法包括对间充质干细胞群进行分级。
68.更优选的，所述分级包括对间充质干细胞群建立原始细胞库（p2）、主细胞库（p4）、和工作细胞库（p5）。
69.进一步优选的，所述分级包括对各级细胞库进行质量检测。
70.在一个具体的实施方式中，对p2代细胞进行质量检测，所述质量检测包括但不限于：细胞形态、细胞数量及活率、细胞表型、分化能力、遗传标志物、无菌、支原体、内毒素、特殊人源病毒、免疫学反应及细胞因子分泌的一种或者多种，质量合格者作为原始细胞库（p2）。
71.在一个具体的实施方式中，对p4代细胞进行质量检测，所述质量检测包括但不限于：细胞形态、细胞数量及活率、无菌、支原体及内毒素一种或者多种，质量合格者作为主细胞库（p4）。
72.优选的，选择p4代的间充质干细胞进行炎症因子培养。更优选的，选择主细胞库（p4）的间充质干细胞。
73.在一个具体的实施方式中，对经炎症因子培养后获得p5代细胞，对p5代细胞的进行质量检测，所述质量检测包括但不限于：细胞形态、细胞数量及活率、细胞表型、分化能力、细胞遗传学、端粒酶、遗传标志物、无菌、支原体、内毒素、特殊人源病毒、免疫学反应及细胞因子分泌一种或者多种，质量合格者作为工作细胞库（p5）。
74.上述分级使得间充质干细胞群更适合于临床上使用，间充质干细胞群更具有安全性，同时具备更多的功能。
75.优选的，所述制备方法获得的间充质干细胞群是本发明第一方面的间充质干细胞群。
76.本发明第六方面，提供一种培养上清，所述培养上清由上述培养物制备获得。
77.优选的，所述间充质干细胞群、培养上清包括il-6 、pge2和/或间充质干细胞群外泌体。
78.本发明第七方面，提供一种细胞因子的制备方法，所述制备方法包括从上述培养物上清中分离获得所述细胞因子。
79.优选的，所述细胞因子包括il-6和/或pge2。
80.本发明第八方面，提供一种上述间充质干细胞群、培养上清或细胞因子的应用，所述应用包括：1）在与cd106表型、cd274表型、cd142表型和/或cd80表型相关的研究、药物研发中的应用；2）在降低cd142相关的凝血级联反应中的应用；和/或，3）在免疫调节中的应用。
81.本发明第九方面，提供一种上述间充质干细胞群、培养上清或细胞因子在制备组合物中的应用。
82.优选的，所述组合物为药物组合物。
83.本发明第十方面，提供一种组合物，所述组合物包括上述间充质干细胞群、培养上清、或细胞因子。
84.优选的，所述组合物为药物组合物。
85.更优选的，所述组合物为注射剂、微针剂、粘膜贴片、灌肠剂、凝胶剂、气雾剂、滴剂等等。
86.所述药物组合物可选的包括药物辅料。进一步优选的，所述辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂和/或缓冲剂等等。
87.在一些具体的实施方式中，所述载体选自明胶、壳聚糖、海藻酸钠、胶原、纤维蛋白、聚乳酸、聚氨醋、聚环氧乙皖、聚乙二醇、聚乳酸楚基乙酸、硅酸盐、细胞外基质、脱细胞支架或其任何组合。
88.本发明第十一方面，提供一种免疫和/或炎症相关的疾病的治疗方法，所述治疗方法包括向个体给予上述任意的药物组合物。
89.优选的，所述个体是哺乳动物，例如人。
90.优选的，上述药物组合物可用于治疗和免疫和/或炎症相关的疾病，更优选的，所述疾病包括血液系统疾病、心血管疾病、神经系统疾病、消化系统疾病、生殖系统疾病、泌尿系统疾病、自身免疫性疾病、再生医学/修复医学领域的疾病和损伤等等，例如，移植物抗宿主病（graft versus-host disease, gvhd）、溃疡性结肠炎（uc)、i 型糖尿病、糖尿病足、脊髓损伤、脑瘫、肌萎缩侧索硬化症、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、克隆氏病、中风、肝硬化、造血重建等等。
91.上述任意的间充质干细胞群来源于脐带血、骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等组织以及羊水等等。
92.本发明相关术语说明间充质干细胞（mesenchymal stem cells, msc）：是一种多能干细胞，它具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力。
93.脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells, uc-mscs）：从新生儿脐带组织中分离出来的干细胞。因能分化成间质组织而得名，具有亚全能分化潜能，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成多种组织细胞。脐带间充质干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力，被称科学家称之为“功能强大的起源细胞”。
94.移植物抗宿主病（graft versus-host disease, gvhd）：由于移植后异体供者移植物中的t淋巴细胞，经受者发动的一系列“细胞因子风暴”刺激，增强了其对受者抗原的免疫反应，以受者靶细胞为目标发动细胞毒攻击，其中皮肤、肝及肠道是主要的靶目标。急性移植物抗宿主病的发生率为30% ～ 45%，慢性者发生率低于急性患者。
95.人外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell, pbmc）：单核的血细胞异质种群，包括巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞和淋巴细胞。
96.立即经血液介导而炎症反应（instant blood-mediated inflammatory reaction, ibmir）：移植物导致移植受体凝血系统激活并继发性导致补体系统活化，从而发生瀑布式级联反应，引起血小板活化、聚集，中性粒细胞粘附。
97.组织因子（tissue factor, tf），细胞表面抗原 cd142（cd142 antigen），是凝血因子
ꢀⅶ
/ⅶa 在细胞表面的受体和辅助因子，是外源性凝血过程中的启动因子。在正常情况下tf不存在于循环中或不与循环血液接触，以保证血液流动通畅，维持血液循环功能的正常，只有当血管壁的完整性遭到破坏时，内皮细胞大量表达，tf才暴露于循环血液，在钙、
磷脂存在的条件下，通过与凝血因子
ꢀⅶ
/ⅶa 结合而启动凝血级联反应（coagulation cascade），发挥止血作用。
98.血管细胞粘附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1, vcam-1）也称 cd106，它是一种粘附分子，它是属于免疫球蛋白家族。存在于活性内皮细胞、组织巨噬细胞、树突状细胞和骨髓成纤维细胞上。它参与淋巴细胞、单核细胞和嗜酸性嗜酸杆菌与活性内皮的粘附。它能调节t细胞、b细胞和造血祖细胞迁移。研究表明，cd106高表达能提高 mscs 的免疫调节能力。
99.程序性细胞死亡配体（programmed cell death 1 ligand 1, pd-l1）也称为 cd274，该基因编码一种免疫抑制受体配体，在造血细胞和非造血细胞（如t细胞和b细胞）以及各种类型的肿瘤细胞中表达。通过与其受体的相互作用来抑制活t细胞活化和细胞因子的产生。在正常组织的感染或炎症期间，这种相互作用通过维持免疫反应的平衡来预防自身免疫。
100.分化簇80（cluster of differentiation 80, cd80）也称为b7-1，属于免疫球蛋白超家族，是cd86活化t淋巴细胞时的协同刺激因子，在自身免疫监控、体液免疫应答及移植反应中发挥重要作用。在活化b淋巴细胞、t淋巴细胞、巨噬细胞、外周血单核细胞及树突状细胞均有表达，而非活化b淋巴细胞、红细胞、粒细胞及核细胞上不表达。
101.本发明的有益效果1. 本发明使用 ifn-γ 或/和 tnf-α 处理 msc，使得 cd106 阳性亚群的比例由 15 ~ 40% 提高至 80 ~ 90%，从而提高间充质干细胞群的免疫调节能力以及细胞迁移能力。在优选的方案中，ifn-γ 和 tnf-α 联用在提高cd106的表达上具有协同作用。
102.2. 本发明首次利用炎症因子培养间充质干细胞群降低其 cd142 表型，在优选的方案中，ifn-γ和 tnf-α 联用在降低 cd142 的表达上具有协同作用。cd142 阳性亚群的比例降低 20%，避免在使用间充质干细胞群时由于高cd142导致的凝血级联反应，降低 ibmir、血栓栓塞等风险。
103.3.本发明炎症因子培养后的间充质干细胞群高表达cd274，在优选的方案中，ifn-γ和 tnf-α 联用在提高cd274的表达上具有协同作用，可提高至85%，可以进一步抑制 cd142不利影响；并且在高表达cd274的同时，并未增加 cd80 的比例，从而避免加重 gvhd患者病情的隐患。
104.4.本发明使用 ifn-γ 或/和 tnf-α 处理间充质干细胞，使得细胞迁移/趋化能力增加，在治疗疾病时，趋化/迁移至靶器官的 msc 数量增多，使其更好发挥免疫调节作用。
105.5.本发明利用一种或者两种炎症因子培养间充质干细胞群就可使得间充质干细胞群具有多种性能，方法操作简单，只需普通细胞培养操作即可，杜绝了流式分选所带来的人工成本和污染问题。
附图说明
106.图 1 为脐带间充质干细胞群经ifn-γ 或/和 tnf-α处理后 cd274、cd80 和 cd106 阳性亚群的变化结果；图 2 为 间充质干细胞群经ifn-γ或/和tnf-α处理后cd142阳性亚群的变化结
果；；图 3 为ifn-γ或/和tnf-α 处理后的 huc-msc 冻存前后cd274、cd80 和 cd106细胞表型的变化结果；图 4为 ifn-γ 或/和tnf-α 处理后的 huc-msc 冻存后 cd142 阳性亚群的变化结果；图 5为不同培养基培养的 huc-msc 经ifn-γ 或/和 tnf-α 处理后 cd274、cd80 和 cd106 阳性亚群的变化结果；图 6 为不同培养基培养的 huc-msc 经 ifn-γ 或/和 tnf-α 处理后 cd142 阳性亚群的变化结果；图 7 为不同浓度tnf-α 和 ifn-γ 处理 huc-msc 细胞后 cd274、cd80 和 cd106 阳性亚群的变化结果；图 8 为不同浓度 tnf-α 和 ifn-γ 处理 huc-msc 细胞后cd142的变化结果；图 9 为 ifn-γ 或/和 tnf-α 处理后的 huc-msc 与 pbmcs 共培养后其免疫调节能力的变化，其中图（a）不同组别 tnf-α 因子分泌量；（b）不同组别 huc-msc 对 pbmcs 的抑制率；图 （c） th1 （ifn-γ+
） 细胞比例评估结果；图 10 为炎症因子处理 huc-msc 后免疫调节因子的分泌量，其中（a）图为 il-6 的分泌量；（b）图为 pge
2 的分泌量；图 11 为 ifn-γ或/和 tnf-α 处理后对 huc-msc 迁移和趋化的影响，其中图（a）为 0h、6h 细胞划痕结果；（b）为 0h、6h 细胞迁移率；（c）为不同浓度的 ifn-γ和tnf-α处理 huc-msc 细胞趋化结果；（d）为10 ng/ml的ifn-γ或/和tnf-α处理 huc-msc细胞趋化结果。
具体实施方式
107.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
108.在下述每一实施例中，设备和试剂是从以下所指出的几家公司获得本说明使用的设备如下：设备名称厂家型号生物安全柜thermo1384二氧化碳培养箱thermoheracell150i离心机thermost16r细胞计数仪nexcelomk2倒置显微镜明美mi11自动洗板机thermowellwash微孔板恒温孵育器miulabst70-2多功能酶标仪thermo3020流式细胞仪bdbdfacsverse
本说明使用的试剂如下：tnf-α（peprotech 300-01a-50）、ifn-γ（peprotech af-300-02-20）、间充质干细胞（msc）无血清培养基（北京三有利科技发展有限公司 120408）、amms
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msc medium serum free medium animal free medium sterile filtered（同立海源生物 as09-2）、dmem/f12 基础培养基（普诺赛 pm150310）、tryple
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express enzyme（gibco 12604-021）、origen biomedical cryopurtm,70ml（origen cp-70）、人血白蛋白（baxter ag）、0.9%氯化钠注射液（石家庄四药有限公司）、mitomycin c（abmole m5791-10mg）、胎牛血清（gibco 10099141）、pbs磷酸盐缓冲液，ph7.2（gibco 20012027）、cell activation cocktail（with brefeldin a)（biolegend 423303）、u1tra-leaf purified anti-human cd3（biolegend 317326）、u1tra-leaf purified anti-human cd28（biolegend 302943）、ao/pi染液（nexcelom bioscience cs2-0106-5ml）、fitc anti-human ifn（biolegend 502505）、apc anti-human cd4（biolegend 344614）、pe anti-human il-17a（biolegend 512306）、cyto-fast
tm fix/permbuffer set（biolegend 426803）、cell staining buffer（biolegend 420201）、viability stain 510（bd 564406）、celltrace
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violet cell proliferation kit（invitrogen
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c34557）、fitc anti-human cd3（biolegend 300406）、7-aad viability staining solution（biolegend 420403）、human tnf-alpha quantikine elisa kit（r&d sta00d）、prostaglandin e2 parameter assay kit（r&d skge004b）、human il-6 quantikine elisa kit summary（r&d s6050）、fitc mouse anti-human cd274（bd pharmingen 7125831）、apc anti-human cd80（biolegend 305219）、apc anti-human cd106（biolegend 305809）、apc anti-human cd142（biolegend 365205）、dapi solution 1.0 mg（bd pharmingen 564907）、4%组织细胞固定液（solarbio p1110-100ml）、草酸铵结晶紫染色液（结晶紫染色液）(1%)（solarbio g1062-10ml）实施例1. 建立三级细胞库工艺，生产足够量的各级细胞库按照现有技术（例如cn103266081b）在符合gmp条件下分离人脐带间充质干细胞群原代细胞，至p2代细胞经检验合格后为原始细胞库；解冻p2代细胞长至p4代，经检验合格后为主细胞库；p4代细胞解冻复苏按照一定浓度接种，期间使用炎症因子处理22
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2 h 后收获p5代细胞，经检验合格后为工作细胞库。
109.其中p2原始细胞库检验包括但不限于此：细胞形态、细胞数量及活率、细胞表型、分化能力、遗传标志物、无菌、支原体、内毒素、特殊人源病毒、免疫学反应及细胞因子分泌的一种或者多种；p4主细胞库检验包括但不限于以下项目：细胞形态、细胞数量及活率、无菌、支原体及内毒素的一种或者多种；p5工作细胞库检验项目包括但不限于此：细胞形态、细胞数量及活率、细胞表型、分化能力、细胞遗传学、端粒酶、遗传标志物、无菌、支原体、内毒素、特殊人源病毒、免疫学反应及细胞因子分泌的一种或者多种。各项指标合格的细胞即为临床级别干细胞。
110.实施例2. 脐带间充质干细胞群经炎症因子处理后 cd106、cd274、cd80和cd142表型的变化培养方法：1）解冻复苏：37 ~ 40℃ 水浴解冻 p4 主库细胞库，将细胞悬液重悬于缓冲液中
（此处缓冲液可以为 pbs、生理盐水、含 1% 人血白蛋白的生理盐水），重悬比例至少为 2 倍缓冲液，300 ~ 500
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g，离心 8
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10 min，弃上清加入三有利培养基；2）培养：按照5000 ~ 6000个细胞/cm2接种于t75细胞培养瓶中，将培养瓶置于37℃，5% co2的培养箱中培养；3）添加炎症因子继续培养：48
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2 h 后更换含有浓度为10 ng/ml ifn-γ 或/和 tnf-α 的三有利msc无血清培养基（分组信息见表 1 ），22
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2 h后分别收获细胞，取 2
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106个细胞用于流式细胞术分析。检测的细胞使用pbs洗涤三次，200 μl重悬，根据抗体使用说明书加入抗体，4℃，避光孵育20 min。孵育完成后，pbs洗涤三次，300 μl dapi（0.1 μg/ml）重悬细胞，流式细胞仪上机检测。
111.表 1：不同组别炎症因子添加量明细表 1234（ntc)tnf-α++
‑‑
ifn-γ+-+-表2：炎症因子处理huc-msc 24h后cd106、cd274、cd80和cd142表型的变化结果如图 1、2和表2所示，对于表型cd106而言，单一的ifn-γ 可以明显提高cd106的表达量，而tnf-α 组并未显著提高的比例，但是两种炎症因子联合后，具有协同提高cd106表达的作用。
112.对于表型cd274而言，单一tnf-α 或 ifn-γ 均可以提高cd274的表达量，单一ifn-γ具有显著提高cd274的表达量，相对于对照组，cd274阳性亚群比例增加约近60倍；两种炎症因子联合后对cd274的表达量的提高远高于单一炎性因子作用之和，说明，两种炎性因子联合后对于cd274的表达量的提高具有协同作用。
113.对于cd142表型而言，单一ifn-γ 炎症因子组具有一定的降低cd142表型的作用，而联合炎症因子组 cd142 表型与对照组相比下降约20%，具有显著降低cd142的作用，也说明两种炎症因子对于降低cd142表达量具有协同作用。
114.对于cd80表型而言，无论是单一炎症因子培养，还是两者联合培养，均未有显著性的变化。
115.实施例3：经炎症因子处理的huc-msc冻存前后细胞表型的变化培养方法：根据实施例2的方法接种、处理和收获细胞。收获后的细胞沉淀取 2
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10
6 个细胞进行流式细胞术分析，其余细胞进行冻存。在液氮冻存两个月后复苏检测表型。
116.结果：
表3：冻存复苏后细胞表型的检测结果如图3、4和表3所示，冻存前后cd106、cd274、cd80和cd142表型并无显著变化，表明炎症因子处理后各种表型稳定表达。
117.实施例4：不同培养基培养的huc-msc经炎症因子处理后cd106、cd274、cd80和cd142表型的变化培养方法：在37 ~ 40℃，复苏p4主细胞库细胞，按照5000 ~ 6000个细胞/cm2接种t25细胞培养瓶中，使用amms
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msc medium serum free medium animal free medium sterile filtered（tl）以及dmem/f12 + 10% fbs（df12）进行培养，48
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2 h 后分别更换含有如表1所示的炎症因子的培养基（tl、df12），22
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2 h后分别收获细胞。
118.结果：表4：不同培养基对细胞表型的影响如图5、6和表2和表4所示，虽然在不同的培养基中，细胞表型的表达量不同，但其影响趋势与实施例2相同，即便是在包含血清的df12+10%fbs培养基中，炎症因子对各种细胞表型的影响也都相同。
119.对于表型cd106而言，单一tnf-α 或 ifn-γ 可以明显提高cd106的表达量，两种炎症因子联合后，具有协同提高cd106表达的作用。
120.对于表型cd274而言，单一tnf-α 或 ifn-γ 均可以提高cd274的表达量，单一ifn-γ具有显著提高cd274的表达量；两种炎症因子联合后对cd274的表达量的提高作用远高于单一炎性因子作用之和，说明，两种炎性因子联合后对于cd274的表达量的提高具有协同作用。
121.对于cd80表型而言，无论是单一炎症因子培养，还是两者联合培养，均未有显著性
的变化。
122.对于cd142表型而言，联合炎症因子组可以降低 cd142 阳性亚群比例，但当培养基为tl时，单一tnf-α也可以降低cd142比例。
123.综上所述，不论是何种培养基，双加组都能使cd106和cd274比例增加的同时cd80比例不变，cd142比例降低。因此，本发明的炎症因子可适合于各种不同的培养基以达到预期对细胞表型的影响。
124.实施例5：不同浓度炎症因子处理后cd106、cd274、cd80和cd142表型的变化培养方法：在37 ~ 40℃，复苏p4主细胞库细胞，按照5000 ~ 6000个细胞/cm2接种t25细胞培养瓶中，使用三有利（sanly）培养基培养，48
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2 h 后分别用5、10、20、30 ng/ml的tnf-α 和ifn-γ 共同处理 huc-msc细胞，22
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2 h后分别收获细胞，收获后的细胞沉淀取 2
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10
6 个细胞进行流式细胞术分析。
125.结果：表5：不同浓度炎症因子处理huc-msc后细胞表型的变化结果如图7、8和表5所示，对于表型cd106而言，炎症因子的浓度范围在5-30 ng/ml之间都具有协同增加cd106表达的作用；对于表型cd274而言，随着炎症因子的浓度增加，两者对cd274表达的协同作用也在增加；对于表型cd80而言，随着炎症因子的浓度增加，对cd80的表达量没有显著性的改变；对于表型cd142而言，联合处理后随炎性因子浓度的增加，cd142比例呈现先降低后升高的趋势，但总体上看，在5-30ng/ml区间范围内都具有降低cd142阳性比例的作用，尤其在10 ng/ml时比例最低。
126.实施例6：炎症因子处理后对细胞免疫抑制能力的影响
方法：根据实施例2的方法进行接种、处理和收获。收获后的细胞重悬，接种6孔板每孔1
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10
6 个细胞，培养24 h收集上清检测il-6 和pge2分泌量。接种12孔板，待细胞贴壁后，加入终浓度 20 μg/ml的丝裂霉素c处理 2 h，洗涤3次，加入 rpmi 1640（10% fbs) 继续培养。将 pbmc和msc 共培养，在未接种msc的孔中加入pbmc细胞悬液，作为阳性对照组。向实验组和阳性对照组的孔中分别加入终浓度5 μg/ml的cd3单抗和终浓度为1 μg/ml 的cd28 单抗。将细胞在37℃、5% co2条件下培养3 ~ 4天后，使用流式细胞仪分析 th1 细胞群体比例。
127.结果：表6： 炎症因子处理后免疫调节因子的影响注：p值为炎症因子处理组与对照组显著性分析（t检验）；表中p 值小于0.05表示差异显著；小于0.01时表示差异极显著。
128.从图9、10和表6可知，对于外周血单核细胞的tnf-α分泌量而言，无论是单一的ifn-γ还是tnf-α或者两者联合，均具有降低外周血单核细胞的tnf-α分泌量的作用。例如：pbmcs tnf-α 阳性对照分泌量为2510 pg/ml，炎症因子联合处理后外周血单核细胞的tnf-α分泌量降低可降低225.1 pg/ml。
129.对于th1细胞群体比例而言，无论是单一的ifn-γ还是tnf-α或者两者联合，均具有减少th1细胞群体比例的作用。
130.对于免疫调节因子 il-6的分泌量而言，无论是单一的ifn-γ、tnf-α 还是联合作用都能使其分泌量增加。
131.对于免疫调节因子 pge2的分泌量而言，无论是单一的ifn-γ还是tnf-α或者两者
联合，均具有增加其分泌量的作用。
132.上述结果表明炎症因子处理后的huc-mscs免疫抑制能力增强。
133.实施例7：炎症因子处理后对细胞迁移的影响方法：在37 ~ 40℃，复苏p4主细胞库细胞，按照 6000个细胞/cm
2 6孔板中，使用sanly（三有利间充质干细胞无血清培养基）进行培养，将培养瓶置于37℃、5% co2的培养箱中培养，48 h后更换含有浓度为10 ng/ml tnf-α或ifn-γ 和5、10、20、30 ng/ml tnf-α和ifn-γ的msc无血清培养基，炎症因子处理22
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2 h。
134.细胞划痕：试验取10 ng/ml tnf-α 和/或ifn-γ 加入终浓度为 20 μg/ml的丝裂霉素c处理2 h后，用枪头划痕，pbs洗涤3次后换成 α-mem基础培养基继续培养，显微镜下拍照观察划痕面积，标记拍照位置，拍照保存0、4、6 h的划痕图片。
135.细胞趋化：试验取10 ng/ml 的tnf-α 、ifn-γ 和5、10、20、30 ng/ml的tnf-α 和ifn-γ 使用 α-mem（2% fbs）重悬，调整细胞密度为5
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105/ml，取200 μl细胞悬液置于上室，下室 α-mem（30% fbs），总体积 700 μl，置于37℃、5% co
2 培养箱中培养24 h后，pbs 洗涤3次后，使用4%多聚甲醛固定30 min后，pbs 洗涤5次，0.1% 结晶紫染色15 min，pbs洗涤3次，采集20
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图片。
136.结果：表7： 细胞迁移面积明细表表8 不同浓度的炎症因子联合处理后细胞迁移面积明细表
注：p值为同一个时间点炎症因子处理组与对照组显著性分析（t检验）；表中p 值小于0.05表示差异显著；小于0.01时表示差异极显著。
137.从图11和表7所示，经炎症因子处理后细胞迁移能力增加（图11 a和b）；联合组随着浓度的增加，趋化能力降低，但是高于对照组的趋化能力（图11 c），表明炎症因子浓度在一定范围内是合适的；单加组与对照相比趋化能力增强（图11 d），ifn-γ 组高于tnf-α 和联合组的趋化能力。从表8所示，经不同浓度的炎症因子联合处理huc-msc，4h时迁移率随着浓度的增加而增加，6h时随着浓度的增加迁移率反而降低。表明不论是单加组还是不同浓度的双加组处理后都能使得huc-msc迁移能力增加，但是炎症因子浓度需要在一个合适的范围才能使细胞更好的发挥作用。
138.综上所述，不论是单加组还是联合处理后都能使得细胞迁移和趋化能力增加。
139.实施例8：制备包含间充质干细胞群的组合物本发明功能增强型间充质干细胞群组合物可以包括：（1）经炎性因子处理后间充质干细胞群按照一定浓度（2
×
105cell/ml ~1
×
106cell/ml）置于含1%人血蛋白的生理盐水中，用于静脉回输使用；（2）经炎性因子处理后间充质干细胞群按照一定浓度（2
×
105cell/ml ~1
×
106cell/ml）置于含一定比例丙二醇+海藻糖+人血白蛋白+复方电解质注射液中，用于静脉回输使用；或者，（3）经炎性因子处理后间充质干细胞群分泌上清经外泌体提取工艺后，与明胶、壳聚糖、海藻酸钠、胶原、纤维蛋白、聚乳酸、聚氨醋、聚环氧乙皖、聚乙二醇、聚乳酸楚基乙酸、硅酸盐、细胞外基质、脱细胞支架等制备成涂抹制剂或是喷雾剂等。
140.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
141.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
142.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。