通过基因组编辑靶向微小RNA以调节天然基因功能的制作方法

通过基因组编辑靶向微小rna以调节天然基因功能
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2020年1月21日提交的美国临时申请号62/963572的权益，该临时申请通过援引以其全文并入本文。
3.以电子方式递交的序列表的引用
4.该序列表的官方副本经由efs-web作为ascii格式的序列表以电子方式提交，文件名为“7137-us-psp_sequencelisting_st25.txt”，创建于2020年1月16日，大小为99千字节，并与本说明书同时提交。包含在该ascii格式的文件中的序列表是本说明书的一部分并且通过援引以其全文并入本文。
技术领域
5.本披露涉及分子生物学，并且具体地涉及靶基因的组织和/或时间特异性敲低。


背景技术：

6.基因编辑提供了一种精确插入、敲低或修饰特定dna序列的方法，并且已经应用于主要农作物以调节基因功能和加速遗传获得。然而，靶向基因敲低在许多情况下只会产生缺乏组织和/或时间特异性的隐性、功能丧失的性状。
7.因此，需要开发用于组织和/或时间特异性靶向基因敲低的新组合物和方法。本披露提供了这样的组合物和方法。


技术实现要素：

8.本文提供了在编码目的多肽的基因的基因组基因座中包含靶向遗传修饰的植物、植物部分、植物细胞、种子和谷物，其中该靶向遗传修饰将内源性微小rna(mirna)识别序列引入该基因组基因座中，由此与该内源性mirna识别序列杂交的内源mirna的表达降低该目的多肽的表达。在某些实施例中，将该mirna识别序列插入编码该目的多肽的该基因的3
′‑
非翻译区。在某些实施例中，将该mirna识别序列插入编码该目的多肽的该基因的5
′‑
非翻译区。在某些实施例中，将该mirna识别序列插入编码该目的多肽的该基因的编码区。在某些实施例中，与该内源性mirna识别序列杂交的该内源性mirna包含seq id no：1-554中任一个的核苷酸序列。在某些实施例中，编码该目的多肽的该基因编码含锌指的蛋白、激酶、热休克蛋白、通道蛋白、农艺性状增强蛋白、抗昆虫蛋白、抗病蛋白、抗除草剂蛋白或与不育有关的蛋白。在某些实施例中，编码该目的多肽的该基因包含与seq id no：564至少80％同一的核酸序列。
9.进一步提供了在内源性微小rna序列的核苷酸序列中包含靶向遗传修饰的植物、植物部分、植物细胞、种子和谷物，其中该靶向遗传修饰修饰该内源性微小rna序列以编码经修饰的微小rna，该经修饰的微小rna靶向编码目的多肽的基因的基因组基因座，由此该经修饰的微小rna的表达降低该目的多肽的表达。在某些实施例中，该经修饰的mirna靶向编码该目的多肽的该基因的3
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非翻译区中的序列。在某些实施例中，该经修饰的mirna靶
向编码该目的多肽的该基因的5
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非翻译区中的序列。在某些实施例中，该经修饰的mirna靶向编码该目的多肽的该基因的编码中的序列。在某些实施例中，编码该目的多肽的该基因编码含锌指的蛋白、激酶、热休克蛋白、通道蛋白、农艺性状增强蛋白、抗昆虫蛋白、抗病蛋白、抗除草剂蛋白或与不育有关的蛋白。在某些实施例中，编码该目的多肽的该基因包含与seq id no：564至少80％同一的核酸序列。在某些实施例中，该内源性mirna序列包含seq id no：1-554中任一个的核苷酸序列。
10.提供了一种改变植物细胞中目的多肽的表达的方法。在某些实施例中，该方法包括在该植物细胞中在编码该目的多肽的基因的基因组基因座中引入靶向遗传修饰，其中该靶向遗传修饰修饰该内源性基因以编码内源性微小rna识别序列。在某些实施例中，该方法包括(a)在可再生植物细胞中在编码该目的多肽的基因的基因组基因座处引入靶向遗传修饰，其中该靶向遗传修饰修饰该基因组基因座以编码内源性微小rna识别序列；以及(b)产生植物，其中该植物包含该靶向遗传修饰。在某些实施例中，将该mirna识别序列插入编码该目的多肽的该基因的3
′‑
非翻译区。在某些实施例中，将该mirna识别序列插入编码该目的多肽的该基因的5
′‑
非翻译区。在某些实施例中，将该mirna识别序列插入编码该目的多肽的该基因的编码区。在某些实施例中，与该内源性mirna识别序列杂交的该内源性mirna包含seq id no：1-554中任一个的核苷酸序列。在某些实施例中，编码该目的多肽的该基因编码含锌指的蛋白、激酶、热休克蛋白、通道蛋白、农艺性状增强蛋白、抗昆虫蛋白、抗病蛋白、抗除草剂蛋白或与不育有关的蛋白。在某些实施例中，编码该目的多肽的该基因包含与seq id no：564至少80％同一的核酸序列。在某些实施例中，使用基因组修饰技术引入该靶向遗传修饰，该基因组修饰技术选自包括以下项的组：多核苷酸指导的内切核酸酶、crispr-cas内切核酸酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活子样效应子核酸酶(talen)、工程化位点特异性大范围核酸酶或argonaute。
11.进一步提供了一种改变植物细胞中目的多肽的表达的方法。在某些实施例中，该方法包括在该植物细胞中引入内源性微小rna的靶向遗传修饰以产生经修饰的微小rna，其中该经修饰的微小rna靶向编码该目的多肽的基因，从而降低该目的多肽的表达。在某些实施例中，该方法包括(a)在可再生植物细胞中在内源性微小rna的核苷酸序列中引入靶向遗传修饰，其中该靶向遗传修饰修饰该内源性微小rna以编码经修饰的微小rna，该经修饰的微小rna靶向编码该目的多肽的基因；以及(b)产生植物，其中该植物包含该靶向遗传修饰。在某些实施例中，该经修饰的mirna靶向编码该目的多肽的该基因的3
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非翻译区中的序列。在某些实施例中，该经修饰的mirna靶向编码该目的多肽的该基因的5
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非翻译区中的序列。在某些实施例中，该经修饰的mirna靶向编码该目的多肽的该基因的编码中的序列。在某些实施例中，编码该目的多肽的该基因编码含锌指的蛋白、激酶、热休克蛋白、通道蛋白、农艺性状增强蛋白、抗昆虫蛋白、抗病蛋白、抗除草剂蛋白或与不育有关的蛋白。在某些实施例中，编码该目的多肽的该基因包含与seq id no：564至少80％同一的氨基酸序列。在某些实施例中，该内源性mirna序列包含seq id no：1-554中任一个的核苷酸序列。在某些实施例中，使用基因组修饰技术引入该靶向遗传修饰，该基因组修饰技术选自包括以下项的组：多核苷酸指导的内切核酸酶、crispr-cas内切核酸酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活子样效应子核酸酶(talen)、工程化位点特异性大范围核酸酶或argonaute。
12.附图和序列表的说明
13.从以下详细描述以及构成本技术的一部分的附图和序列表(其通过援引并入本文)可以更全面地理解本披露。
14.图1提供了显示来自玉米培养样本的早期叶组织中的萎黄病的实验结果，在这些玉米培养样本中，与不含微小rna 156识别序列的对照样本相比，将该识别序列插入八氢番茄红素去饱和酶基因的3
′‑
非翻译区。
15.序列表描述总结了所附的序列表。如描述于以下文献中的iupac-iub标准中所定义的，序列表包含核苷酸序列字符的单字母代码和氨基酸的单字母和三字母代码：nucleic acids research[核酸研究]13：3021-3030(1985)和biochemical journal[生物化学杂志]219(2)：345-373(1984)。
[0016]
表1：序列表说明
[0017]
具体实施方式
[0018]
本披露提供了在目的基因的基因组基因座中包含靶向遗传修饰的植物、植物细胞、植物部分、种子和/或谷物，其中该靶向遗传修饰将内源性微小rna识别序列引入该目的基因的该基因组基因座中，由此与该微小rna识别序列杂交的内源性微小rna的表达降低该目的基因的表达。
[0019]
如本文所用的“微小rna识别序列”、“mirna识别序列”、“微小rna靶序列”等通常是指与微小rna杂交的核酸序列(例如，转录的mrna)。
[0020]
与mirna识别序列杂交的mirna序列没有特别限制，并且可以是包含靶向遗传修饰的植物、植物细胞、植物部分、种子和/或谷物的任何内源性mirna序列。用于本文所述的组合物和方法中的来自多种植物的内源性mirna序列的代表性实例可以在mirbase.org的mirbase序列数据库中找到。
[0021]
在某些实施例中，mirna序列选自美国专利申请公开2016/0017349或美国专利申请公开2008/0115240中所披露的序列，这些专利申请公开中的每一项通过援引以其全文并入本文。
[0022]
在某些实施例中，mirna识别序列包含与mirna序列杂交的核酸序列，该mirna序列与选自组seq id no：1-554的核酸序列至少80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一。在某些实施例中，mirna识别序列包含与选自由seq id no：1-554组成的组的mirna序列杂交的核酸序列。
[0023]
如本文所用，相对于参考序列(主题序列)的“序列同一性百分比(％)”被确定为在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性后，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何氨基酸保守取代，候选序列(查询序列)中与参考序列中的相应氨基酸残基或核苷酸同一的氨基酸残基或核苷酸的百分比。用于确定序列同一性百分比目的而进行的比对能以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公共可用的计算机软件，如blast、blast-2。本领域的技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在进行比较的序列的全长度上实现最大比对所需的任何算法。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的同一的位置的数目的函数(例如，查询序列的同一性百分比＝查询序列和主题序列之间同一的位置的数目/查询序列的位置总数
×
100)。
[0024]
除非另外说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用blast 2.0程序包、使用默认参数获得的值(altschul等人，(1997)nucleic acids res.[核酸研究]25：3389-402)。
[0025]
在某些实施例中，目的基因的表达在靶向位置(例如特定组织)和/或在某一发育阶段和/或在胁迫条件(例如非生物胁迫)下降低。
[0026]
因此，在某些实施例中，mirna识别序列的选择将取决于相应内源性mirna的表达模式。例如，为了降低目的基因在雄穗(例如玉米雄穗)中的表达，可以使用与雄穗特异性/优选mirna诸如mir529(seq id no：198)杂交的微小rna识别序列。mir529是与植物生殖发育相关的雄穗优选微小rna，已表明其靶向squamosa启动子结合蛋白样(sbp盒)基因。
[0027]
替代性地，为了降低目的基因在根中的表达，可以使用与根特异性/优选mirna诸如mir160(seq id no：166)杂交的微小rna识别序列。
[0028]
为了降低植物营养阶段期间目的基因的表达，可以使用与在营养阶段期间表达上调的mirna诸如mir156b(seq id no：155)杂交的微小rna识别序列。mir156是植物中幼叶和幼芽发育表达所必需的微小rna。mir156通过协调转变过程中多种途径的表达来调节幼年到成年转变的时间。mir156在营养阶段生长早期强烈表达，在植物转变到成年阶段后减弱。
[0029]
替代性地，为了降低植物生殖阶段期间目的基因的表达，可以使用与在生殖阶段
期间表达上调的mirna诸如mir172(seq id no：16)杂交的微小rna识别序列。
[0030]
如本文所用，“降低表达”、“降低的表达”、“敲低”等同义使用，并且是指与对照样本(例如不含基因组修饰的植物)相比，样本(例如修饰的植物)中核酸(例如mrna)或蛋白表达的水平的任何可检测的降低。本领域普通技术人员可以使用本领域中的常规方法诸如western印记和pcr容易地鉴定样本中核酸或蛋白表达的降低。
[0031]
如本文所用的“基因组基因座”通常是指植物染色体上发现基因的位置。如本文所用，“基因”包括表达功能性分子的核酸片段，诸如但不限于特定蛋白编码序列和调节元件，诸如启动子、增强子、内含子、5
′‑
非翻译区(5
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utr，也称为前导序列)或3
′‑
非翻译区(3
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utr)。只要所得植物、植物细胞、植物部分、种子和/或谷物具有降低的目的基因的表达，基因组基因座中靶向遗传修饰的位置没有特别限制。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的3
′‑
utr中。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的5
′‑
utr中。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的编码区中。
[0032]“内含子”是转录成rna、但是然后在产生成熟mrna的过程中被切除的基因中的间插序列。该术语也用于切除的rna序列。“外显子”是经转录的基因的序列的一部分，并且在衍生自基因的成熟信使rna中被发现，但不一定是编码最终基因产物的序列的一部分。
[0033]5′
非翻译区(5
′
utr)(也称为翻译前导序列或前导rna)是mrna的直接位于起始密码子上游的区域。该区域涉及通过病毒、原核生物和真核生物中的不同机制对转录物的翻译的调节。
[0034]“3
′
非编码序列”是指位于编码序列下游的dna序列，并且包括聚腺苷酸化识别序列和编码能够影响mrna加工或基因表达的调节信号的其他序列。聚腺苷酸化信号通常表征为影响聚腺苷酸片添加到mrna前体的3
′
末端。
[0035]“靶向遗传修饰”是指通过在内源性核苷酸序列中插入、缺失或取代一个或多个核苷酸而对任何核酸序列或遗传元件的直接修饰。可使用本领域已知的任何技术引入靶向遗传修饰，例如多核苷酸指导的内切核酸酶、crispr-cas内切核酸酶、转录激活子样效应子核酸酶(talen)、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、工程化位点特异性大范围核酸酶或argonaute。
[0036]
术语“目的多肽”、“目的基因”等是同义的，并且通常是指需要降低表达的任何多肽。
[0037]
用于本文所述的方法和组合物中的目的基因没有特别限制，并且反映了涉及作物发育的那些的商业市场和兴趣。目的作物和市场发生变化，并且随着发展中国家打开国际市场，新的作物和技术也将出现。此外，随着我们对农艺学特征和性状(例如产率和杂种优势)的了解增加，用于转化的基因的选择也会相应变化。
[0038]
目的基因的一般类别包括但不限于参与信息传递的那些基因(诸如锌指)、参与通信的那些基因(诸如激酶)、参与转运的那些基因(诸如孔蛋白)以及参与看家的那些基因(诸如热休克蛋白)。例如，更具体的类别包括但不限于编码重要农艺学性状(例如，产量提高、抗旱性、氮利用效率、成熟度、开花时间、衰老、身高、植物结构、叶角和形态)、抗昆虫性、抗病性、除草剂抗性、不育、谷物或种子特征和商业产品的基因。
[0039]
目的基因通常包括参与油、淀粉、碳水化合物或营养素代谢的那些基因，以及影响种子大小、植物发育、植物生长调节和产率改善的那些基因。植物发育和生长调节也指植物
各部分(如花、种子、根、叶和芽)的发育和生长调节。
[0040]
其他商业上需要的性状是赋予抗冷性、抗热性、抗盐性和抗旱性的基因和蛋白。
[0041]
抗病性和/或抗昆虫性基因可编码对具有很大产量拖累(诸如玉米大斑病、丝黑穗病、炭疽病、大豆花叶病毒、大豆异皮线虫、根结线虫、叶褐斑病、霜霉病、紫斑病、烂种，以及通常由真菌-腐霉属(pythium)物种、疫霉属(phytophthora)物种、丝核菌属(rhizoctonia)物种、腐皮壳属(diaporthe)物种引起的种子腐烂和幼苗病害，以及由细菌丁香假单胞菌大豆致病变种(pseudomonas syringae pv.glycinea)引起的细菌疫病)的害虫的抗性。赋予抗昆虫性的基因包括例如苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)毒性蛋白基因(美国专利号5,366,892、5,747,450、5,737,514、5,723,756、5,593,881和geiser等人(1986)gene[基因]48：109)、凝集素(van damme等人(1994)plant mol.biol.[植物分子生物学]24：825)等等。
[0042]
除草剂抗性性状可以包括编码针对用于抑制乙酰乳酸合酶(als)，特别是磺酰脲类除草剂(例如含有导致这种抗性的突变(特别是s4和/或hra突变)的乙酰乳酸合酶als基因)作用的除草剂的抗性的基因。als基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。草甘膦乙酰转移酶(gat)是来自地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的n-乙酰转移酶，其通过基因改组针对广谱除草剂草甘膦的乙酰化进行优化，从而形成转基因植物中草甘膦耐受性的新颖机制的基础(castle等人(2004)science[科学]304，1151-1154)。
[0043]
已经在植物中鉴定出参与植物生长和发育的基因。参与细胞分裂素生物合成的一种这样的基因是异戊烯基转移酶(ipt)。细胞分裂素通过刺激细胞分裂和细胞分化在植物生长和发育中起关键作用(sun等人，(2003)，plant physiol.[植物生理学]131：167-176)。
[0044]
在某些实施例中，目的多肽是植物、植物细胞、植物部分、种子和/或谷物天然的多肽(例如内源性基因)。在某些实施例中，目的多肽是已经插入植物、植物细胞、植物部分、种子和/或谷物中的多肽，诸如在异源启动子控制下由基因编码的多肽。
[0045]
在某些实施例中，目的多肽是参与雄穗形成的多肽，并且微小rna识别序列包含与seq id no：1-554中任一个的核酸序列杂交的核酸序列。
[0046]
在某些实施例中，编码目的多肽的基因包含与seq id no：564(tls)至少60％(例如，60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的核酸序列，并且微小rna识别序列包含与seq id no：1-554中任一个的核酸序列杂交的核酸序列。
[0047]
在某些实施例中，目的多肽是参与雄穗形成的多肽，并且微小rna识别序列包含与seq id no：1-197中任一个的核酸序列杂交的核酸序列。在某些实施例中，编码目的多肽的基因包含与seq id no：564至少60％同一的核酸序列，并且微小rna识别序列包含与seq id no：1-197中任一个的核酸序列杂交的核酸序列。在某些实施例中，编码目的多肽的基因包含与seq id no：564(tls)至少60％同一的核酸序列，并且微小rna识别序列包含与mir529(seq id no：198)的核酸序列杂交的核酸序列，诸如seq id no：559。
[0048]
如本文所用，术语植物包括植物原生质体、从中可再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物部分(例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果、籽粒、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等)中的完整植物细胞。谷物旨在意指由商业种植者出
于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生植物的子代、变体和突变体也包括在本披露的范围内，条件是这些部分包含靶向遗传修饰。
[0049]
目的植物物种的实例包括但不限于玉米(玉蜀黍)、芸苔属(brassica)物种(例如，甘蓝型油菜(b.napus)、芜菁(b.rapa)、芥菜(b.juncea))(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)、苜蓿(紫花苜蓿(medicago sativa))、稻(水稻(oryza sativa))、黑麦(裸麦(secale cereale))、高粱(两色高粱(sorghum bicolor)、扫帚高粱(sorghum vulgare))、粟(例如，珍珠粟(御谷(pennisetum glaucum))、黍(粟米(panicum miliaceum))、粟(谷子(setaria italica))、穇子(龙爪稷(eleusine coracana)))、向日葵(helianthus annuus)、红花(carthamus tinctorius)、小麦(triticum aestivum)、大豆(glycine max)、烟草(nicotiana tabacum)、马铃薯(solanum tuberosum)、花生(arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(gossypium barbadense)、陆地棉(gossypium hirsutum))、甘薯(番薯(ipomoea batatas))、木薯(manijot esculenta)、咖啡(咖啡属物种(coffea spp.))、椰子(cocos nucifera)、菠萝(ananas comosus)、柑橘树(柑橘属物种(citrus spp.))、可可(theobroma cacao)、茶树(camellia sinensis)、香蕉(芭蕉属物种(musa spp.))、鳄梨(persea americana)、无花果(ficus casica)、番石榴(psidium guajava)、芒果(mangifera indica)、橄榄(olea europaea)、木瓜(番木瓜(carica papaya))、腰果(anacardium occidentale)、澳洲坚果(macadamia integrifolia)、巴旦杏(prunus amygdalus)、甜菜(beta vulgaris)、甘蔗(甘蔗属物种(saccharum spp.))、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物、针叶树、草坪草(包括冷季草和暖季草)。
[0050]
蔬菜包括例如番茄(lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，lactuca sativa)、青豆(菜豆(phaseolus vulgaris))、利马豆(phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属(lathyrus spp.))和黄瓜属的成员诸如黄瓜(c.sativus)、香瓜(c.cantalupensis)和甜瓜(c.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属(rhododendron)物种)、八仙花(macrophylla hydrangea)、朱槿(hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(rosa)物种)、郁金香(郁金香属(tulipa)物种)、水仙(水仙属(narcissus)物种)、矮牵牛(petunia hybrida)、康乃馨(dianthus caryophyllus)、一品红(euphorbia pulcherrima)和菊花。
[0051]
可用于所披露的实践的针叶树包括例如松树诸如火炬松(pinus taeda)、湿地松(pinus elliotii)、西黄松(pinus ponderosa)、黑松(pinus contorta)和辐射松(pinus radiata)；花旗松(pseudotsuga menziesii)；西部铁杉(tsuga canadensis)；北美云杉(picea glauca)；红杉(sequoia sempervirens)；枞树(true firs)诸如银枞(abies amabilis)和胶枞(abies balsamea)；以及雪松，诸如西方红雪松(北美乔柏(thuja plicata))和阿拉斯加黄雪松(黄扁柏(chamaecyparis nootkatensis))，以及白杨和桉树。在特定实施例中，本披露的植物是作物植物(例如，玉米、苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物是最佳的，并且在又其他的实施例中，玉米植物是最佳的。
[0052]
其他目的植物包括例如提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括例如谷物种子，诸如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括例如棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉米、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜耳豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴
豆。
[0053]
本披露还提供了包含内源性微小rna序列的靶向遗传修饰的植物、植物细胞、植物部分、种子和/或谷物，其中该靶向遗传修饰修饰内源性微小rna序列以编码经修饰的微小rna序列，该经修饰的微小rna序列与编码目的多肽的基因的基因组基因座杂交，从而降低目的多肽的表达。
[0054]
如本文所用，“经修饰的微小rna序列”、“经修饰的mirna序列”等通常是指包含至少一个核苷酸修饰(诸如插入、缺失和/或取代)的内源性微小rna序列。在某些实施例中，经修饰的微小rna在与相应的未修饰的内源性微小rna序列相同的位置和/或相同的发育阶段表达。
[0055]
待修饰的内源性微小rna序列没有特别限制，并且可以是本文所述的任何内源性微小rna序列。
[0056]
在某些实施方式中，被修饰的内源性微小rna序列包含seq id no：1-554中任一个的核苷酸序列，其中与内源性微小rna序列相比，所得经修饰的微小rna序列包含至少一个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)核苷酸修饰。
[0057]
在某些实施例中，经修饰的微小rna被修饰成包含与目的基因的基因组基因座杂交的核苷酸序列并且降低目的基因的表达。在某些实施例中，经修饰的微小rna被修饰成包含在严格条件下与目的基因的基因组基因座杂交的核苷酸序列并且降低目的基因的表达。在某些实施例中，经修饰的微小rna被修饰成包含与目的基因的基因组基因座的连续核苷酸序列至少80％(例如，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一的核苷酸序列并且降低目的基因的表达。在某些实施例中，经修饰的微小rna被修饰成包含与目的基因的基因组基因座的连续核苷酸序列同一的核苷酸序列并且降低目的基因的表达。
[0058]
在某些实施例中，经修饰的微小rna与目的基因的蛋白编码序列杂交。在某些实施例中，经修饰的微小rna与目的基因的调节元件杂交。在某些实施例中，经修饰的微小rna与目的基因的内含子序列杂交。在某些实施例中，经修饰的微小rna与目的基因的5
′‑
utr的区域杂交。在某些实施例中，经修饰的微小rna与目的基因的3
′‑
utr的区域杂交。
[0059]
方法
[0060]
本文提供了降低植物、植物部分、植物细胞、种子或谷物中目的基因的表达的方法。
[0061]
在某些实施例中，该方法包括向植物细胞中在目的基因的基因组基因座中引入靶向遗传修饰，其中该靶向遗传修饰修饰目的内源性基因以编码内源性微小rna识别序列。在某些实施例中，植物细胞是可再生植物细胞，并且该方法进一步包括产生植物，其中该植物包含该靶向遗传修饰。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的3
′‑
utr中。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的5
′‑
utr中。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的编码区中。
[0062]
用于本文所述的方法中的内源性微小rna识别序列可以是本文所述的任何内源性微小rna识别序列。在某些实施例中，内源性微小rna识别序列包含与seq id no：1-554中任一个的核酸序列杂交的核酸序列。
[0063]
还提供了一种改变植物细胞中目的基因的表达的方法，该方法包括在植物细胞中
在内源性微小rna的核苷酸序列中引入靶向遗传修饰，其中该靶向遗传修饰修饰内源性微小rna以编码与目的基因杂交并且降低目的基因的表达的经修饰的微小rna。
[0064]
在某些实施例中，该方法包括在可再生植物细胞中在内源性微小rna的核苷酸序列中引入靶向遗传修饰，其中该靶向遗传修饰修饰内源性微小rna以编码经修饰的微小rna，该经修饰的微小rna靶向编码目的基因；以及产生植物，其中该植物包含该靶向遗传修饰。
[0065]
用于本文所述的方法中的经修饰的微小rna序列可以是本文所述的任何经修饰的微小rna序列。
[0066]
还提供了一种降低植物雄穗中目的基因表达的方法，该方法包括向植物细胞中在目的基因的基因组基因座中引入靶向遗传修饰，其中该靶向遗传修饰修饰目的内源性基因以编码与雄穗特异性/优选微小rna序列(例如mir529，seq id no：198)杂交的内源性微小rna识别序列。
[0067]
在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的3
′‑
utr中。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的5
′‑
utr中。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的编码区中。
[0068]
还提供了一种降低营养阶段期间目的基因的表达的方法，该方法包括向植物细胞中在目的基因的基因组基因座中引入靶向遗传修饰，其中该靶向遗传修饰修饰目的内源性基因以编码内源性微小rna识别序列，该内源性微小rna识别序列包含与在营养阶段期间表达增加的mirna序列(例如mir156b seq id no：155)杂交的核酸序列。
[0069]
在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的3
′‑
utr中。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的5
′‑
utr中。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的编码区中。
[0070]
还提供了一种降低生殖阶段期间目的基因的表达的方法，该方法包括向植物细胞中在目的基因的基因组基因座中引入靶向遗传修饰，其中该靶向遗传修饰修饰目的内源性基因以编码内源性微小rna识别序列，该内源性微小rna识别序列包含与在生殖阶段期间表达增加的mirna序列(例如mir172 seq id no：16)杂交的核酸序列。
[0071]
在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的3
′‑
utr中。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的5
′‑
utr中。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的编码区中。
[0072]
如本领域普通技术人员将理解的，可以修改本文所述的方法以在表达mirna的任何发育/生长阶段期间和/或在表达mirna的任何胁迫条件(例如生物或非生物胁迫)下降低表达mirna的任何组织中目的基因的表达(例如根特异性降低)。在某些实施例中，mirna识别序列是与微小rna杂交的序列，该微小rna的表达水平在所述组织、发育阶段或胁迫条件中改变(例如，增加)。
[0073]
在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的3
′‑
utr中。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的5
′‑
utr中。在某些实施例中，靶向遗传修饰在目的基因的编码区中。
[0074]
可以使用各种方法将编码目的基因的基因组基因座处和/或内源性微小rna序列处的遗传修饰引入植物、植物部分、植物细胞、种子和/或谷物中。在某些实施例中，通过基因组修饰技术进行靶向遗传修饰，该基因组修饰技术选自由以下项组成的组：多核苷酸指导的内切核酸酶、crispr-cas内切核酸酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活子样效应子核酸酶(talen)、工程化位点特异性大范围核酸酶或argonaute。
[0075]
在一些实施例中，可以通过在所需改变附近的基因组中的确定位置诱导双链断裂
(dsb)或单链断裂来促进基因组修饰。可以使用任何可用的dsb诱导剂诱导dsb，该诱导剂包括但不限于，talen、大范围核酸酶、锌指核酸酶、cas9-grna系统(基于细菌性crispr-cas系统)、指导的cpf1内切核酸酶系统等。在一些实施例中，可以将dsb的引入与多核苷酸修饰模板的引入组合。
[0076]
可以通过本领域已知的任何方法将多核苷酸修饰模板引入细胞中，该方法例如但不限于瞬时引入方法、转染、电穿孔、显微注射、颗粒介导的递送、局部施用、晶须介导的递送、经由细胞穿透肽的递送或介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)介导的直接递送。
[0077]
可以将多核苷酸修饰模板作为单链多核苷酸分子、双链多核苷酸分子或作为环状dna(载体dna)的一部分引入细胞中。该多核苷酸修饰模板还可以与指导rna和/或cas内切核酸酶进行系链。系链的dna可以允许共定位靶标和模板dna，可用于基因组编辑和靶向的基因组调节，并且还可以用于靶向有丝分裂后期细胞，在这些细胞中内源性hr机制的功能预计会大大降低(mali等人2013 nature methods[自然方法]第10卷：957-963)。该多核苷酸修饰模板可以瞬时地存在于细胞中，或可以经由病毒复制子引入。
[0078]“修饰的核苷酸”或“编辑的核苷酸”是指当与其非修饰的核苷酸序列相比时，包含至少一个改变的目的核苷酸序列。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
[0079]
术语“多核苷酸修饰模板”包括，当与待编辑的核苷酸序列相比时，包含至少一个核苷酸修饰的多核苷酸。核苷酸修饰可以是至少一个核苷酸取代、添加或缺失。任选地，多核苷酸修饰模板可以进一步包含位于至少一个核苷酸修饰侧翼的同源核苷酸序列，其中侧翼同源核苷酸序列为待编辑的希望的核苷酸序列提供了充足同源性。
[0080]
组合dsb和修饰模板来编辑基因组序列的过程通常包括：向宿主细胞提供dsb诱导剂或编码dsb诱导剂的核酸(识别染色体序列中的靶序列并且能够诱导基因组序列中的dsb)，和与待编辑的核苷酸序列相比时包含至少一个核苷酸改变的至少一个多核苷酸修饰模板。多核苷酸修饰模板还可以包含侧翼于该至少一个核苷酸变化的核苷酸序列，其中侧翼序列与侧翼于dsb的染色体区域基本同源。
[0081]
内切核酸酶可以通过本领域已知的任何方法提供给细胞，该方法例如但不限于瞬时引入方法、转染、显微注射、和/或局部施用、或间接经由重组构建体。内切核酸酶可以作为蛋白或作为指导多核苷酸复合物直接提供给细胞或经由重组构建体间接提供。使用本领域已知的任何方法，可以瞬时地将内切核酸酶引入细胞中，或可以将内切核酸酶并入宿主细胞的基因组中。在crispr-cas系统的情况下，如2016年5月12日公开的wo 2016073433中所述的，可以用细胞穿透肽(cpp)促进内切核酸酶和/或指导多核苷酸摄入进细胞。
[0082]
除通过双链断裂技术进行修饰之外，无此类双链断裂的-种或多种碱基的修饰使用碱基编辑技术实现，参见例如，gaudelli等人，(2017)programmable base editing of a*t to g*c in genomic dna without dna cleavage.[在无dna切割时基因组dna中a*t至g*c的可编程碱基编辑]nature[自然]551(7681)：464-471；komor等人，(2016)programmable editing of a target base in genomic dna without double-stranded dna cleavage[在无双链dna切割时基因组dna中靶碱基的可编程编辑]，nature[自然]533(7603)：420-4。
[0083]
这些融合物含有dcas9或cas9切口酶和合适的脱氨酶，并且它们例如可以将胞嘧
啶转化为尿嘧啶而不引起靶dna的双链断裂。然后尿嘧啶通过dna复制或修复被转化为胸腺嘧啶。具有靶向灵活性和特异性的改善的碱基编辑器被用于编辑内源性基因座以产生靶标变异并且提高谷物产量。类似地，腺嘌呤碱基编辑器能使腺嘌呤向肌苷变化，然后通过修复或复制将其转化为鸟嘌呤。因此，使用适当的位点特异性碱基编辑器在一个多个位置上进行靶向性碱基改变，即，c
·
g至t
·
a转化和a
·
t至g
·
c转化。
[0084]
在一个实施例中，碱基编辑是基因组编辑方法，其可在靶基因组基因座上将一个碱基对直接转化为另一个碱基对，而无需双链dna断裂(dsb)、同源定向修复(hdr)过程、或外部供体dna模板。在一个实施例中，碱基编辑器包括(i)催化受损的crispr-cas9突变体，其是突变的，这样使得其核酸酶结构域中的一个无法产生dsb；(ii)单链特异性胞苷/腺嘌呤脱氨酶，其可在通过cas9产生的单链dna气泡中的适当核苷酸窗口内将c转化成u或将a转化成g；(iii)尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)，其阻止尿嘧啶切除以及降低碱基编辑效率和产物纯度的下游过程；以及(iv)切口酶活性以切割未编辑的dna链，然后细胞dna修复过程以替代含g的dna链。
[0085]
如本文所用，“基因组区域”是存在于靶位点任一侧上的细胞的基因组中的染色体的区段，或者可替代地，还包含靶位点的一部分。基因组区域可以包含至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800。5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，这样使得基因组区域具有足够的同源性以与相应的同源区域进行同源重组。
[0086]
tal效应子核酸酶(talen)是一类序列特异性核酸酶，其可以被用于在植物或其他生物体的基因组中特异性靶序列处造成双链断裂。(miller等人(2011)nature biotechnology[自然生物技术]29：143-148)。
[0087]
内切核酸酶是在多核苷酸链内切割磷酸二酯键的酶。内切核酸酶包括限制性内切核酸酶，其在特异性位点处切割dna而不损坏碱基；并且包括大范围核酸酶，也称为归巢内切核酸酶(he酶)，其相似于限制性内切核酸酶，在特异性识别位点处结合并且切割，然而对于大范围核酸酶，识别位点典型地更长，约18bp或更长(于2012年3月22日提交的专利申请pct/us12/30061)。基于保守的序列基序将大范围核酸酶分类为四个家族，这些家族是laglidadg、giy-yig、h-n-h、和his-cys box家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。he酶的显著之处在于它们的长识别位点，并且还在于耐受其dna底物中的一些序列多态性。对于大范围核酸酶的命名约定相似于对其他限制性内切核酸酶的约定。大范围核酸酶还分别表征为针对由独立的orf、内含子、和内含肽编码的酶的前缀f-、i-、或pi-。在重组过程中的一个步骤涉及在识别位点处或在该识别位点附近的多核苷酸切割。可以将切割活性用于产生双链断裂。对于位点特异性重组酶和它们的识别位点的综述，参见sauer(1994)curr op biotechnol[生物技术新见]5：521-7；以及sadowski(1993)faseb[美国实验生物学学会联合会杂志]7：760-7。在一些实例中，重组酶来自整合酶(integrase)或解离酶(resolvase)家族。
[0088]
锌指核酸酶(zfn)是由锌指dna结合结构域和双链-断裂-诱导剂结构域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性由锌指结构域赋予，该锌指结构域典型地包含两个、
三个、或四个锌指，例如具有c2h2结构，然而其他锌指结构是已知的并且已经被工程化。锌指结构域适于设计特异性结合所选择的多核苷酸识别序列的多肽。zfn包括连接至非特异性内切核酸酶结构域(例如来自iis型内切核酸酶例如foki的核酸酶结构域)的工程化dna结合锌指结构域。额外的功能性可以融合到锌指结合结构域中，这些额外的功能性包括转录激活子结构域、转录阻遏物结构域、和甲基化酶。在一些实例中，核酸酶结构域的二聚化是切割活性所需的。每个锌指在靶dna中识别三个连续的碱基对。例如，3指结构域识别9个连续核苷酸的序列，由于核酸酶的二聚化需要，因此两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。
[0089]
例如在2015年3月19日公开的美国专利申请us 2015-0082478 a1、2015年2月26日公开的wo 2015/026886 a1、2016年1月14日公开的wo 2016007347以及2016年2月18日公开的wo 201625131(其全部通过援引并入本文)中已经描述了使用dsb诱导剂(例如cas9-grna复合物)进行的基因组编辑。
[0090]
本文中术语“cas基因”是指在细菌系统中通常与侧翼crispr基因座偶联、缔合或接近或在邻近处的基因。术语“cas基因”，“crispr相关的(cas)基因”在本文中可互换地使用。本文的术语“cas内切核酸酶”是指由cas基因编码的蛋白。当与适合的多核苷酸组分复合时，本文的cas内切核酸酶能够识别、结合特异性dna靶序列的全部或部分、并任选地使特异性dna靶序列的全部或部分产生切口或切割特异性dna靶序列的全部或部分。本文描述的cas内切核酸酶包含一个或多个核酸酶结构域。本披露的cas内切核酸酶包括具有hnh或hnh-样核酸酶结构域和/或ruvc或ruvc-样核酸酶结构域的那些。本披露的cas内切核酸酶包括cas9蛋白、cpf1蛋白、c2c1蛋白、c2c2蛋白、c2c3蛋白、cas3、cas 5、cas7、cas8、cas10或这些的复合物。
[0091]
如本文所用，术语“指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物”、“指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统”、“指导多核苷酸/cas复合物”、“指导多核苷酸/cas系统”、“指导性cas系统”在本文中可互换地使用，并且是指能够形成复合物的至少一种指导多核苷酸和至少一种cas内切核酸酶，其中所述指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以将cas内切核酸酶引导至dna靶位点，使cas内切核酸酶能够识别、结合到、并任选地使dna靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)dna靶位点。本文中指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以包含四种已知的crispr系统(horvath和barrangou，2010，science[科学]327：167-170)(诸如i型、ii型或iii型crispr系统)中任一种的一种或多种cas蛋白和一种或多种合适的多核苷酸组分。cas内切核酸酶在靶序列处解开dna双链体并任选地切割至少一条dna链，如通过由与cas蛋白复合的多核苷酸(例如但不限于crrna或指导rna)识别靶序列所介导的。如果正确的前间隔序列邻近基序(pam)位于或相邻于dna靶序列的3
′
末端，则通过cas内切核酸酶对靶序列进行的此类识别和切割典型地会发生。替代性地，本文中的cas蛋白可能缺乏dna切割或切口活性，但是当与合适的rna组分复合时，仍然可以特异性结合dna靶序列。(还参见于2015年3月19日公开的美国专利申请us 2015-0082478 a1和于2015年2月26日公开的us 2015-0059010 a1，两者均通过援引以其全文特此并入)。
[0092]
指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以切割dna靶序列的一条或两条链。可以切割dna靶序列的两条链的指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物典型地包含具有处于功能状态的所有其内切核酸酶结构域的cas蛋白(例如野生型内切核酸酶结构域或其变体在每
rna)与tracrrna(反式激活crispr rna)融合。单指导rna可以包含可与ii型cas内切核酸酶形成复合物的ii型crispr/cas系统的crrna或crrna片段和tracrrna或tracrrna片段，其中所述指导rna/cas内切核酸酶复合物可以将cas内切核酸酶引导至dna靶位点，使得cas内切核酸酶能够识别、结合dna靶位点、并任选地使dna靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)dna靶位点。
[0099]
术语“指导rna/cas内切核酸酶复合物”、“指导rna/cas内切核酸酶系统”、“指导rna/cas复合物”、“指导rna/cas系统”、“grna/cas复合物”、“grna/cas系统”、“rna-指导的内切核酸酶”，“rgen”在本文中可互换地使用并且意指至少一种rna组分和至少一种能够形成复合物的cas内切核酸酶，其中所述指导rna/cas内切核酸酶复合物可以将cas内切核酸酶引导至dna靶位点，使cas内切核酸酶能够识别、结合dna靶位点并任选地使dna靶位点产生切口或切割(引入单链或双链断裂)dna靶位点。本文中的指导rna/cas内切核酸酶复合物可以包含四种已知的crispr系统(horvath和barrangou，2010，science[科学]327：167-170)(诸如i型、ii型或iii型crispr系统)中任一种的一种或多种cas蛋白和一种或多种合适的rna组分。指导rna/cas内切核酸酶复合物可以包括ii型cas9内切核酸酶和至少一种rna组分(例如，crrna和tracrrna、或grna)。(还参见于2015年3月19日公开的美国专利申请us 2015-0082478 a1和于2015年2月26日公开的us 2015-0059010 a1，两者均通过援引以其全文特此并入)。
[0100]
本文描述的方法和组合物的指导多核苷酸可以是靶向植物细胞的基因组基因座的任何多核苷酸序列，该基因组基因座包含编码与选自由seq id no：9-16组成的组的序列至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％)同一的氨基酸序列的多核苷酸。在某些实施例中，指导多核苷酸是指导rna。指导多核苷酸也可以存在于重组dna构建体中。
[0101]
使用在本领域已知的任何方法(例如，但不限于，粒子轰击、农杆菌转化或局部施用)，可以将作为单链多核苷酸或双链多核苷酸的指导多核苷酸瞬时地引入细胞。指导多核苷酸还可以通过引入(通过，诸如但不限于粒子轰击或农杆菌转化等方法)包含编码指导多核苷酸的异源核酸片段的重组dna分子被间接引入细胞，该重组dna分子可操作地连接到能够在所述细胞转录指导rna的特异性启动子。特异性启动子可以是但不限于rna聚合酶iii启动子，其允许具有精确定义的未修饰的5
′‑
和3
′‑
末端的rna转录(dicarlo等人，nucleic acids res.[核酸研究]41：4336-4343；ma等人，mol.ther.nucleic acids[分子治疗-核酸]3：e161)，如2016年2月18日公开的wo 2016025131中所述，其通过援引以其全文并入本文。
[0102]
术语“靶位点”、“靶序列”、“靶位点序列”、“靶dna”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、“基因组靶基因座”和“前间隔序列”在本文中可互换地使用，并且意指多核苷酸序列，例如，但不限于，在细胞的染色体、附加体，或基因组中的任何其他dna分子(包括染色体dna、叶绿体dna、线粒体dna、质粒dna)上的核苷酸序列，在所述序列处指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以进行识别、结合并任选地产生切口或进行切割。靶位点可以是细胞的基因组中的内源位点，或者可替代地，靶位点对于该细胞可以是异源的并且从而不是天然存在于细胞的基因组中，或者与在自然界发生的位置相比，可以在异质基因组位置中找到靶位点。如本文所用，术语“内源靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换使用，是指对细胞基因组来说是内源的或天然的、并且位于细胞的基因组中该靶序列的内源或天然
位置处的靶序列。细胞包括但不限于人、非人、动物、细菌、真菌、昆虫、酵母、非常规酵母和植物细胞，以及通过本文所述的方法产生的植物和种子。“人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换使用，并且是指已经引入细胞的基因组中的靶序列。这种人工靶序列可以在序列上与细胞的基因组中的内源或天然靶序列同一，但是位于细胞的基因组中的不同位置(即，非内源的或非天然的位置)处。
[0103]“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”、“修饰的靶序列”在本文中可互换使用，并且是指如本文披露的靶序列，当与非改变的靶序列相比时，该靶序列包含至少一个改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
[0104]
用于“修饰靶位点”和“改变靶位点”的方法在本文中可互换使用，并且是指用于产生改变的靶位点的方法。
[0105]
靶dna序列(靶位点)的长度可以变化，并且包括例如为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸长度的靶位点。还有可能靶位点可以是回文的，即，一条链上的序列与在互补链上以相反方向的读取相同。切口/切割位点可以在靶序列内，或者切口/切割位点可以在靶序列之外。在另一种变异中，切割可以发生在彼此正好相对的核苷酸位置处，以产生平端切割，或者在其他情况下，切口可以交错以产生单链突出端，也称为“粘性端”，其可以是5
′
突出端抑或3
′
突出端。还可以使用基因组靶位点的活性变体。此类活性变体可以包含与给定靶位点至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中这些活性变体保留生物活性，因此能够被cas内切核酸酶识别和切割。测量由内切核酸酶引起的靶位点的单链或双链断裂的测定是本领域已知的，并且通常测量试剂在含有识别位点的dna底物上的总体活性和特异性。
[0106]
本文中的“前间隔序列邻近基序”(pam)指与由本文所述的指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统识别的(靶向的)靶序列(前间隔序列)邻近的短核苷酸序列。如果靶dna序列后面不是pam序列，则cas内切核酸酶可能无法成功识别该靶dna序列。本文中的pam的序列和长度可以取决于所使用的cas蛋白或cas蛋白复合物而不同。pam序列可以是任何长度，但典型地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸长度。
[0107]
术语“靶向”、“基因靶向”和“dna靶向”在本文中可互换地使用。本文中的dna靶向可能是在特异性的dna序列(例如细胞的染色体或质粒)中特异性引入敲除、编辑、或敲入。通常，本文中可以通过在具有与合适的多核苷酸组分缔合的内切核酸酶的细胞中的特异性dna序列处切割一条或两条链来进行dna靶向。这种dna切割，如果是双链断裂(dsb)，可以促进nhej或hdr过程，这可能导致靶位点处的修饰。
[0108]
本文的靶向方法能以例如在该方法中靶向两个或更多个dna靶位点的这样的方式进行。这种方法可以任选地被表征为多重方法。在某些实施例中，可以同时靶向两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个靶位点。多重方法典型地通过本文的靶向方法进行，其中提供了多个不同的rna组分，每一个被设计成将指导多核苷酸/cas内切核酸酶复合物引导到唯一的dna靶位点。
[0109]
指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统可以与共同递送的多核苷酸修饰模板组合使用以允许编辑(修饰)目的基因组核苷酸序列。(还参见于2015年3月19日公开的美国专利申
请us 2015-0082478 a1和2015年2月26日公开的wo 2015/026886 a1，两者均通过援引以其全文特此并入)。
[0110]
可以采用不同方法和组合物来获得细胞或生物体，该细胞或生物体具有插入针对cas内切核酸酶的靶位点中的目的多核苷酸。此类方法可以采用同源重组以提供目的多核苷酸在靶位点处的整合。在提供的一种方法中，在供体dna构建体中将目的多核苷酸提供至生物细胞。如本文所用，“供体dna”是包含待插入到cas内切核酸酶的靶位点的目的多核苷酸的dna构建体。供体dna构建体进一步包含位于目的多核苷酸侧翼的同源的第一区域和第二区域。供体dna的同源的第一区域和第二区域分别与存在于细胞或生物基因组的靶位点中或位于该靶位点侧翼的第一和第二基因组区域具有同源性。“同源”意指dna序列是相似的。例如，在供体dna上发现的“与基因组区域同源的区域”是与细胞或生物体基因组中给定的“基因组序列”具有类似序列的dna的区域。同源的区域可以具有足以促进在切割的靶位点处的同源重组的任何长度。例如，同源的区域的长度可以包括至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，这样使得同源的区域具有足够的同源性以与相应的基因组区域进行同源重组。“足够的同源性”表示两个多核苷酸序列具有足够的结构相似性以充当同源重组反应的底物。结构相似性包括每个多核苷酸片段的总长度以及多核苷酸的序列相似性。序列相似性可以通过在序列的整个长度上的百分比序列同一性和/或通过包含局部相似性(例如具有100％序列同一性的连续核苷酸)的保守区域以及在序列长度的一部分上的百分比序列同一性来描述。
[0111]
靶标和供体多核苷酸具有的序列同一性的量可以变化，并且包括总长度和/或在约1-20bp、20-50bp、50-100bp、75-150bp、100-250bp、150-300bp、200-400bp、250-500bp、300-600bp、350-750bp、400-800bp、450-900bp、500-1000bp、600-1250bp、700-1500bp、800-1750bp、900-2000bp、1-2.5kb、1.5-3kb、2-4kb、2.5-5kb、3-6kb、3.5-7kb、4-8kb、5-10kb，或多达并包括靶位点的总长度的范围内具有单位整数值的区域。这些范围包括范围内的每个整数，例如1-20bp的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20bp。同源性的量也可以通过在两个多核苷酸的完整比对长度上的百分比序列同一性来描述，其包括约至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的百分比序列同一性。足够的同源性包括多核苷酸长度、总体百分比序列同一性，和任选地连续核苷酸的保守区域或局部百分比序列同一性的任何组合，例如，足够的同源性可以被描述为与靶基因座的区域具有至少80％序列同一性的75-150bp的区域。足够的同源性也可以通过预测的两个多核苷酸在高严格条件下特异性杂交的能力来描述，参见例如sambrook等人，(1989)molecular cloning：a laboratory manual[分子克隆：实验室手册]，(cold spring harbor laboratory press，ny[纽约州冷泉港实验室出版社])；current protocols in molecular biology[分子生物学实验指南]，ausubel等人编辑(1994)current protocols[实验室指南]，(greene publishing associates，inc.[格林出版联合公司]和john wiley&sons，inc.[约翰威利父
子公司])；以及tijssen(1993)laboratory techniques in biochemistry and molecular biology
‑‑
hybridization with nucleic acid probes[生物化学与分子生物学实验技术-与核酸探针杂交]，(elsevier，new york[纽约爱思唯尔公司])。
[0112]
在给定的基因组区域和在供体dna上发现的相应的同源的区域之间的结构相似性可以是允许同源重组发生的任何程度的序列同一性。例如，由供体dna的“同源的区域”和生物体基因组的“基因组区域”共享的同源性或序列同一性的量可以是至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，这样使得序列进行同源重组
[0113]
供体dna上的同源的区域可以与靶位点侧翼的任何序列具有同源性。虽然在一些实施例中，同源的区域与紧邻靶位点侧翼的基因组序列共享显著的序列同源性，但是应当认识到同源的区域可以被设计为与可能更靠近靶位点的5
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或3
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的区域具有足够的同源性。在又其他实施例中，同源的区域还可以与靶位点的片段以及下游基因组区域具有同源性。在一个实施例中，第一同源的区域进一步包含靶位点中的第一片段，并且第二同源的区域包含靶位点中的第二片段，其中第一片段和第二片段不同。
[0114]
如本文所用，“同源重组”包括在同源的位点处的两个dna分子之间的dna片段的交换。
[0115]
已经描述了指导rna/cas内切核酸酶系统的其他用途(参见2015年3月19日公开的美国专利申请us 2015-0082478 a1、2015年2月26日公开的wo 2015/026886 a1、2015年2月26日公开的us 2015-0059010 a1、2014年7月07日提交的美国申请62/023246和2014年8月13日提交的美国申请62/036,652，其全部通过援引并入本文)，并且这些用途包括但不限于修饰或取代目的核苷酸序列(诸如调节元件)、目的多核苷酸的插入、基因敲除、基因敲入、剪接位点的修饰和/或引入交替剪接位点、编码目的蛋白的核苷酸序列的修饰、氨基酸和/或蛋白融合物以及通过在目的基因中表达反向重复序列引起的基因沉默。
[0116]
已经公开了主要通过使用根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)来转化双子叶植物并获得转基因植物的方法，尤其是对于棉花(美国专利号5,004,863、美国专利号5,159,135)；大豆(美国专利号5,569,834、美国专利号5,416,011)；芸苔属(美国专利号5,463,174)；花生(cheng等人，plant cell rep.[植物细胞报告]15：653657(1996)，mckently等人，plant cell rep.[植物细胞报告]14：699 703(1995))；木瓜(ling等人，bio/technology[生物/技术]9：752 758(1991))；和豌豆(grant等人，plant cell rep.[植物细胞报告]15：254 258(1995))。对于其他常用的植物转化方法的综述参见如下文献：newell，c.a.，mol.biotechnol.[分子生物技术]16：53 65(2000)。这些转化方法之一使用发根土壤杆菌(agrobacterium rhizogenes)(tepfler，m.和casse-delbart，f.，microbiol.sci.[微生物科学]4：2428(1987))。已经公开了使用peg融合(pct公开号wo 92/17598)、电穿孔(chowrira等人，mol.biotechnol.[分子生物学]3：1723(1995)；christou等人，proc.natl.acad.sci.u.s.a.[美国科学院院报]84：3962 3966(1987))、显微注射或粒子轰击(mccabe等人，biotechnology[生物技术]6：923-926(1988)；christou等人，plant physiol.[植物生理学]87：671674(1988))直接递送dna来转化大豆。
[0117]
有各种各样的方法用于从植物组织再生植物。特定的再生方法将取决于起始植物
组织和待再生的特定植物种类。来自单一植物原生质体转化体或来自各种转化的外植体的植物的再生、发育和培养是本领域所熟知的(weissbach和weissbach编辑；methods for plant molecular biology[植物分子生物学方法]；academic press，inc.[学术出版社有限公司]：san diego，ca[加利福尼亚州圣地亚哥]，1988)。这种再生和生长过程典型地包括如下步骤：选择转化的细胞，通过胚性发育的通常阶段或通过生根苗阶段培养那些个体化细胞。以同样的方式再生转基因胚和种子。然后将所得的转基因生根芽苗种植在合适的植物生长培养基(如土壤)中。优选地，再生植物自花授粉以提供纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植物进行杂交。相反地，将来自这些重要品系的植物的花粉用于给再生植物授粉。使用本领域技术人员熟知的方法培养含有所需多肽的本披露的转基因植物。
[0118]
除非另有指定，否则权利要求书和说明书中使用的术语如下文阐述定义。必须注意，除非上下文另外清楚地指明，否则如本说明书及所附权利要求书中所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数指示物。出于所有目的，在本技术中提到的所有引用的专利和出版物通过援引以其全文并入本文，其程度如同它们各自单独和特别地通过援引并入。
[0119]
以下是本发明一些方面的具体实施例的实例。提供这些实例仅出于说明目的而无意以任何方式限制本发明的范围。
[0120]
实例1
[0121]
本实例展示引入内源性微小rna识别序列以降低目的基因的表达。
[0122]
八氢番茄红素去饱和酶(pds)基因编码将15-顺式-八氢番茄红素转化为ζ-胡萝卜素的必需植物类胡萝卜素生物合成酶。pds沉默的植物在叶片中显示光漂白表型。为了测试通过微小rna靶向下调pds的表达是否可以通过在pds的表达转录物中放置微小rna靶位点来实现，将mir1 56b靶位点引入pds基因的3
′
utr中。
[0123]
利用经由crispr-cas9进行的基因编辑将mir156b靶位点(seq id no：555)放置到玉米自交系中玉蜀黍pds基因(seq id no：556)的3
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非翻译区(3
′
utr)中。指导rna zm-pds-cr2(seq id no：557)在玉米基因组内产生双链断裂，并且使用200-bp寡核苷酸模板(seq id no：558)进行同源定向修复(hdr)将mir156b靶位点插入玉米pds 3
′
utr中。通过对样本进行下一代测序确认所需的基因编辑。
[0124]
五个组织培养样本显示早期叶组织的强烈萎黄病，并且发现所有样本都具有在两条dna链上含有mir156b靶位点的hdr编辑，尽管并非所有编辑都具有与模板匹配的完美hdr。图1提供了显示与对照非编辑植物相比，双等位基因hdr植物中早期叶组织的萎黄病的代表性实例。这些hdr编辑的样本在没有pds功能水平的情况下如预期的那样快速死亡。然而，其他编辑的植物幼苗从组织培养发展到温室。
[0125]
对进入温室的编辑的幼苗进一步进行测序分析表明，七株植株具有一个插入mir156b靶位点的hdr等位基因，一株植株具有两个编辑的等位基因；然而，如预计的，该幼苗在温室中几天后死亡。据信植物的早期存活是由于在早期组织培养和营养阶段mir156表达的水平异常低，从而允许在萎黄病发生之前进行一些生长。其他七株鉴定的hdr编辑的植物具有野生型(wt)等位基因或涉及简单snp的第二编辑。所有都仍然具有一个没有mir156调节的功能性pds等位基因，从而允许正常的植物生长和存活。
[0126]
pds转录物内的其他位置可用于mir156b靶位点的基因编辑插入，包括5
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非翻译区(5
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utr)、编码序列和3
′
utr内的其他位置。预计所有都会通过mir156的调节降低pds表达。此外，还考虑了其他mirna诸如mir172对pds的调节。与mir156相比，mir172具有互补的表达模式。其表达在成熟组织中最高，在早期营养组织中最低。预计将mir172靶位点插入pds转录物会引起正常生长，直到成年阶段，此时预计会发生组织萎黄病。
[0127]
总之，这些结果表明，在目的基因中引入内源性mirna识别序列会导致该基因的表达降低。
[0128]
实例2
[0129]
玉米无雄穗1(zm-tsl1)基因在下调时减小玉米雄穗的大小和外观。在整个植物的生长周期中，多个组织中基因的下调对植物发育具有负面的多效性影响。因此，我们测试了在zm-tsl1基因中引入雄穗优选微小rna识别序列是否会减小雄穗大小，同时消除其他负面影响。
[0130]
利用经由crispr-cas9进行的基因编辑将雄穗特异性mir529靶位点(seq id no：559)放置到玉米自交系中玉蜀黍tsl1(seq id no：560)的3
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非翻译区(3
′
utr)中。指导rna zm-tsl1-cr8(seq id no：561)在玉米基因组内产生双链断裂，并且使用200-bp寡核苷酸模板(seq id no：563)进行同源定向修复(hdr)将mir529靶位点插入玉米tsl1 3
′
utr中。该模板被设计成当与内源性zm-tsl1序列相比时产生尽可能少的改变，同时允许3
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utr内存在21bp mir529靶位点。该设计还改变了模板内pam基序中的一个碱基，以防止任何经编辑的植物内的进一步双链断裂。通过对样本进行下一代测序在二十株t0幼苗中确认所需的基因编辑。这些样本中有十五株结了种子，产生的子代仍有待进行分析和表型分析。
[0131]
zm-tsl1转录物内的其他位置可用于通过基因编辑将mir529靶位点插入，包括5
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非翻译区(5
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utr)、编码序列和3
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utr内的其他位置。例如，指导rna zm-tls1-cr9(seq id no：562)在3
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utr内也是可用的，其提供用于mir529靶位点插入的指导rna位点。预计在所表达的zm-tsl1基因内的任何mir529靶位点插入均会降低雄穗中的tsl1表达而不影响果穗生长。
[0132]
实例3
[0133]
玉米nac7(zm-nac7)基因是一个控制功能性保持绿色的新qtl，它是在来自伊利诺斯高蛋白1(ihp1)和伊利诺斯低蛋白1(ilp1)品系的作图群体中发现的，这些品系显示出非常不同的叶片衰老速率。通过rnai下调了zm-nac7的转基因玉米品系显示出衰老延迟以及营养组织中的生物量和氮积累增加，这表明nac7作为保持绿色性状的负调节子发挥作用(j zhang等人，plant biotechnol j.[植物生物技术杂志]201917(12)：2272-2285)。本实例展示利用mir156e识别序列以调节内源性zm-nac7的表达。
[0134]
在拟南芥的早期发育期间，mir156的表达最初较高，然后随着植物成熟稳定地降低(g wu等人，cell[细胞]，2009，138(4)：第750-759页)。因此，将mirna156识别序列插入到zm-nac7的3
′
utr中应降低zm-nac7在营养阶段的表达并增加光合作用，同时在玉米后期发育阶段保持一定的内源性zm-nac7表达以加速衰老和使谷物变干。
[0135]
为了将mirna156e识别序列插入zm-nac7中，指导rna(seq id no：566)被设计成靶向玉米自交系中zm-nac7基因(seq id no：565)的3
′‑
utr中的序列。单个指导rna将在zm-nac7基因组dna中产生双链断裂。使用含有mir156e识别序列的寡核苷酸模板进行同源定向
修复将插入mir156e的靶位点(seq id no：63)。将通过对样本进行下一代测序确认所需的基因编辑。将对阳性样本进行分析和表型分析。