人类CYP2C19基因多态性检测用标准品产品及其制备方法与流程

人类cyp2c19基因多态性检测用标准品产品及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及基因检测领域，尤其涉一种人类cyp2c19基因多态性检测用标准品产品及其制备方法。


背景技术：

2.氯吡格雷主要用于治疗急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，acs)和经皮冠状动脉支架植入术(percutaneous coronary stent implantation，pci)后患者，而且能明显降低acs非血运重建患者的病死率及其他心血管事件的发生率。
3.氯吡格雷在经皮冠状动脉介入治疗(pci)术后的应用可明显降低支架血栓的发生率，显著改善冠心病患者的预后，现已做为pci术后标准抗血小板治疗的重要药物之一。但由于不同个体对氯吡格雷反应性的差异导致4％-30％的患者并未达到预期的抗血小板效果，应用氯吡格雷后血小板反应性仍然较高，这种对氯吡格雷呈现低应答(clopidogrel low-responder，clr)或者无应答(clopidogrel non-response，cnr)的现象称为氯吡格雷低反应或氯吡格雷无反应，统称为氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance，cr)。目前学者们将临床上患者对氯吡格雷呈现出不同应答状态的现象称之为氯吡格雷反应多样性(clopidogrel response diversity，crd)。氯吡格雷抵抗的患者支架血栓以及主要心血管不良事件(major adverse cardiovascular events，mace)事件的发生率相对较高。因此，氯吡格雷反应多样性已成为临床关注的焦点。美国fda提出“黑框警告”，建议服用氯吡格雷的患者需要进行cyp2c19基因型检测，识别患者对氯吡格雷代谢的差异，预测不良临床事件的风险。
4.基因多态性检测的主要方法有：限制性片段长度多态性(rflp)检测、生物质谱检测、测序法检测、taqman探针检测、基因芯片检测等方法。而这些方法在其特异性和灵敏度方面有很大差异。目前实时荧光定量pcr检测法相比普通pcr具有更高的灵敏度和特异性，被广泛应用。本项目标准品可贯穿基于荧光定量pcr基因检测的整个过程，建立从核酸提取到pcr扩增等流程的质量控制。对实验室内检测结果的失控状况及失控原因、了解不同医疗单位之间检验结果的差距具有十分重要的意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种人类cyp2c19基因多态性检测用标准品产品及其制备方法，该方法获得的标准品准确度高。
6.本发明首次建立了人类cyp2c19基因多态性检测用标准品产品及其制备方法，达到了上述发明目的。
7.本发明的技术方案如下：
8.(1)提取含有cyp2c19基因*2、*3、*17三位点纯合野生、杂合突变型以及*2、*17位点纯合突变型的细胞系基因组dna作为模板，通过sanger测序对多态性位点进行验证；
9.(2)cyp2c19基因*2、*3、*17三位点纯合野生、杂合突变型以及*2、*17位点纯合突
变型的细胞系基因组dna定量测定；
10.(3)量值测定通过测定标准物质核酸吸光度值，荧光pcr法以及sanger测序法，采用实验内部多人员、多种方法进行定值。采用荧光定量pcr法进行基因分型验证，标准品均匀性验证。
11.其具体方法为：
12.采用sanger测序方法以上述各基因型位点细胞系基因组dna作为模板进行确认。测序结果见表1。提取dna的纯度见表2。
13.表1 sanger测序法验证结果
[0014][0015]
表2提取dna的纯度
[0016]
样本核酸浓度od260/od280gm1720412.271.92gm1665412.161.95gm1728911.781.95gm1668811.781.89gm1724011.811.78gm1724811.431.72
[0017]
本发明的原理和有益效果在于：
[0018]
提供了一种人类cyp2c19基因多态性检测标准品的制备方法，细胞系质控品接近于临床样本，更好的模拟临检测，优于现有方法标准品，重组质粒由于不同实验室间存在序列选取差异，不能适用于市场上所有试剂盒，且无法准确对市场上所有个体化用药基因检测试剂盒进行鉴别。
[0019]
定值精密度好。
附图说明
[0020]
图1为sanger测序法对cyp2c19*2位点cyp2c19*1/*1型的测序图。
[0021]
图2为sanger测序法对cyp2c19*3位点cyp2c19*1/*1型的测序图。
[0022]
图3为sanger测序法对cyp2c19*17位点cyp2c19*1/*1型的测序图。
[0023]
图4为sanger测序法对cyp2c19*2位点cyp2c19*1/*2型的测序图。
[0024]
图5为sanger测序法对cyp2c19*2位点cyp2c19*2/*2型的测序图。
[0025]
图6为sanger测序法对cyp2c19*3位点cyp2c19*1/*3型的测序图。
[0026]
图7为sanger测序法对cyp2c19*17位点cyp2c19*1/*17型的测序图。
[0027]
图8为sanger测序法对cyp2c19*17位点cyp2c19*17/*17型的测序图。
具体实施方式
[0028]
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
[0029]
实施例1-cyp2c19基因多态性标准品的制备
[0030]
1.细胞系和培养基
[0031]
细胞系gm17204、gm16654、gm17289、gm16688、gm17240、gm17248细胞系购自美国卡瑞尔细胞库(coriell institute)，所需的培养基及培养条件均参照说明书进行。培养基为1640+10％fbs，5％co2，37℃度培养。
[0032]
2.dna提取及sanger测序验证
[0033]
采用江苏百世诺医疗科技有限公司的基因组纯化试剂盒提取6株细胞系的基因组dna，采用sanger测序对基因组dna进行验证。
[0034]
3.基因组纯度验证及定量
[0035]
采用nanodrop法微量紫外分光光度计测定基因组在260nm、280nm和230nm处的吸光值，用te作为空白进行blank，然后取2μl样品进行测定。并根据浓度计算基因组拷贝数对标准品进行定量。
[0036]
4.荧光定量pcr法进行基因分型验证
[0037]
以步骤2中6株细胞系的基因组dna为模板进行pcr扩增。pcr扩增体系25μl，组分见下表3-5。扩增程序见表6。
[0038]
表3 cyp2c19*2反应液组分表
[0039]
组份规格用量masterbuffer2
×
12.5μl上游引物10μm1.0μl下游引物10μm1.0μl内参上游引物10μm1.0μl内参下游引物10μm1.0μlfam探针10μm0.3μlhex探针10μm0.5μl酶混合液-0.5μldepc水 补齐至20μl
[0040]
表4 cyp2c19*3反应液组分表
[0041]
组份规格用量masterbuffer2
×
12.5μl上游引物10μm1.0μl下游引物10μm1.0μl内参上游引物10μm1.0μl内参下游引物10μm1.0μlfam探针10μm0.3μl
hex探针10μm0.5μl酶混合液 0.5μldepc水 补齐至20μl
[0042]
表5 cyp2c19*17反应液组分表
[0043]
组份规格用量masterbuffer2
×
12.5μl上游引物10μm1.0μl下游引物10μm1.0μl内参上游引物10μm1.0μl内参下游引物10μm1.0μlfam探针10μm0.3μlhex探针10μm0.5μl酶混合液-0.5μldepc水 补齐至20μl
[0044]
表6扩增程序
[0045][0046]
对均匀性检验中的试验结果进行f检验
[0047]
对样品随机选取15管，每管取样三次，因此共45份样品。取样量为200μl/次，通过人类全血基因组dna提取试剂盒(江苏百世诺医疗科技有限公司)提取dna后，利用测定核酸吸光度值方法进行分析，检测样品在瓶内以及瓶间的均匀性情况。
[0048]
单元内方差的计算公式如下：
[0049][0050]
单元间方差的计算公式如下：
[0051][0052]
计算统计量f计算公式如下：
[0053][0054]
二、结果
[0055]
1.dna提取及sanger测序验证结果
[0056]
cyp2c19基因*2、*3、*17三位点纯合野生、杂合突变型以及*2、*17位点纯合突变型sanger测序鉴定结果见图1-8。检测结果为对应基因型。
[0057]
2.基因组纯度验证及定量结果
[0058]
提取后基因组在od260/od280在1.7～2.0之间。定值结果统计见表7，由不同人员进行定值，每人测定5管，每管重复测定3次，汇总的到全部原始数据，最终以共同测定数据经数理统计后的总均值12.41ng/μl为标准值。标准物质定值过程中带来的不确定度，计算为0.66。
[0059]
表7定值结果统计
[0060][0061][0062]
3.荧光定量pcr法进行基因分型验证
[0063]
cyp2c19基因*2、*3、*17三位点纯合野生、杂合突变型以及*2、*17位点纯合突变型标准品编号见下表，采用不同荧光定量pcr仪方法进行定性检测，cv值小于5.0％，结果见下表8-10。
[0064]
表8 abi7500荧光pcr仪检测结果
[0065][0066]
表9 roche480荧光pcr仪检测结果
[0067][0068][0069]
表10 mx3000p荧光pcr仪检测结果
[0070][0071]
4.对均匀性检验结果
[0072]
利用方差分析法对瓶内以及瓶间的均匀性进行分析，均匀性检验结果见表11。均匀性方差检验结果表明，统计量f＜f0.05，(m-1)，m(n-1)样品在瓶内和瓶间无显著差异，样品均匀。
[0073]
表11均匀性检验结果
[0074]
[0075]