用于视网膜及CNS基因疗法的AAV载体的制作方法

用于视网膜及cns基因疗法的aav载体
1.本发明申请是基于申请日为2015年05月02日，申请号为201580035996.2(国际申请号为pct/us2015/028966)、名称为“用于视网膜及cns基因疗法的aav载体”的发明专利申请的分案申请。
2.相关申请的交叉引用
3.本技术要求2014年5月2日提交的美国临时申请序号61/988,131和2015年2月10日提交的美国临时申请序号62/114,575的优先权权益，其各自通过提述以其整体并入本文。
4.ascii文本文件上的序列表的提交
5.ascii文本文件上的如下提交的内容通过提述以其整体并入本文：计算机可读形式(crf)的序列表(文件名：159792010440seqlist.txt，记录日期：2015年4月29日，大小：85kb)。
发明领域
6.本发明涉及变体重组腺相关病毒(raav)载体，其用于改进对眼部和中枢神经系统的递送；例如用于改进的视网膜基因治疗和改进的cns基因治疗。
7.发明概述
8.视网膜退化性疾病对于腺相关载体(aav)介导的基因治疗是很有前景的焦点。aav载体能介导视网膜中的长期基因表达和引发最小免疫响应，使得这些载体对于向眼睛的基因递送而言成为了吸引人的选择。视网膜是眼睛的后部的光敏感性组织，其由多种细胞类型(包括感光细胞、视网膜色素上皮细胞和视网膜神经节细胞)组成。aav基因治疗载体的靶细胞类型和载体递送途径取决于疾病指征。例如，年龄相关性黄斑变性的i期临床试验采用载体的玻璃体内(intravitreally)递送以实现视网膜神经节细胞的转导，而用于治疗患有leber氏先天性黑矇2型(一种形式的视网膜色素变性)的患者的一项最近的临床试验使用rpe65基因的视网膜下递送以转导视网膜色素上皮细胞。
9.鉴于这样的效用，需要开发用于改进aav至眼部递送的新的药剂和方法。
10.基于腺相关病毒(aav)的载体也已成为用于神经基因治疗的优选载体系统，在多个临床试验中具有优异的安全记录((kaplitt,m.g等(2007)lancet369:2097-2105；eberling,j.l等(2008)neurology 70:1980-1983；fiandaca,m.s等(2009)neuroimage.47suppl 2:t27-35)。然而，神经系统病症的有效治疗已经在很大程度上受到与将aav载体递送至受影响的细胞群体相关的问题的阻碍。此递送问题对于涉及中枢神经系统(cns)的病症是特别成问题的。因此，进一步需要增强对cns的aav递送。
11.在一些方面中，本发明提供用于将异源核酸递送至个体的眼部的方法，其包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于个体的视网膜下，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型2(aav2)衣壳。在一些
实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代降低raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代增加raav颗粒对眼部或cns中细胞的转导效率。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代增加raav颗粒对眼部或cns中细胞的转导效率，例如与包含野生型aav衣壳蛋白的参考raav衣壳相比增加约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。在一些实施方案中，所述眼部的细胞是视网膜细胞、感光细胞、视网膜色素上皮细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、muller细胞和/或神经节细胞。在一些实施方案中，所述cns的细胞是少突胶质细胞(oligodendrocyte)、星形胶质细胞(astrocyte)、神经元(neuron)、脑实质细胞(brain parenchyma cell)、小胶质细胞(microglial cell)、室管膜细胞(ependemal cell)，和/或浦肯野细胞(purkinje cell)。
12.在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置484、487、527、532、585或588处，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，编号基于包含seq id no:1的氨基酸序列的aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与seq id no:2、4和/或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r532处的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484和r487处或位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a取代或r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1。在进一步的实施方案中，所述aav衣壳包含氨基酸取代r585a和r588a，编号基于aav-2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳或aavrh10衣壳。
13.在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置485、488、528、533、586或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在其他实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。在
一些实施方案中，用带正电荷的氨基酸残基取代疏水性氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括丙氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述氨基酸取代包括位置r485、r488、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含seq id no:11的raav衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个氨基酸取代包括r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。
14.在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav1、aav6或aav9衣壳，且其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528、533、586和/或589处，编号基于aav1、aav6或aav9的vp1编号；和/或其中所述raav颗粒包含aav8或aavrh10衣壳，且其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置487、490、535、588和/或591处，编号基于aav8或aavrh10的vp1编号。
15.在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含含有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变与hspg的结合(例如降低或去除与hspg的结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置，编号基于aav2的vp1编号；和raav载体，其包含编码治疗性多肽或治疗性核酸的异源核酸。在一些实施方案中，所述异源核酸编码选自下组的多肽：抗氧化剂、神经营养因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。在进一步的实施方案中，所述异源核酸编码选自下组的多肽：prph2、rpe65、aipl1、gucy2d、lca5、crx、cep290、myo 7a、clarin、abca4、rdh12、impdh1、crb1、lrat、nmnat1、tulp1、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3、gnat2、gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo、bcl2、bcl-x、nfκb、内皮他汀(endostatin)、血管他汀(angiostatin)、sflt、spdgf-r、il10、抗-il17、sil17r、il1-ra、抗-tgfβ、stnf-r i、stnf-r ii和il4。在其他实施方案中，所述异源核酸编码治疗性核酸。在进一步的实施方案中，所述治疗性核酸是sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核酶或脱氧核酶。在一些实施方案中，所述raav载体是自身互补的raav载体。
16.在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含含有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变与hspg的结合(例如降低或去除与hspg的结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置，编号基于aav2的vp1编号；和编码治疗性多肽或治疗性核酸的异源核酸，其中所述异源核酸处于在视网膜中表达的启动子序列的控制下。在一些实施方案中，所述异源核酸可操作地连接至适于所述治疗性多肽或治疗性核酸在一个或多个视网膜细胞类型中表达的启动子。在一些实施方案中，所述视网膜细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、muller细胞和/或神经节细胞。在一些实施方案中，所述启动子为视紫红激酶(rk)启动子、视蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。
17.在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含含有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所
述氨基酸取代改变与hspg的结合(例如，降低或去除与hspg的结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置，编号基于aav2的vp1编号；和异源核酸，用于将所述异源核酸递送至个体的视网膜。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述异源核酸用于治疗选自下组的眼部病症：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(autosomal recessive severe early-onset retinal degeneration)(leber氏先天性黑矇(leber’s congenital amaurosis))、先天性全色盲、斯塔加特氏病(stargardt’s disease)、贝斯特氏病(best’s disease)、doyne氏病(doyne’s disease)、锥体营养不良(cone dystrophy)、视网膜色素变性(retinitis pigmentosa)、x连锁视网膜劈裂症(x-linked retinoschisis)、usher氏综合征(usher’s syndrome)、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性amd、糖尿病性黄斑病变、增生性糖尿病性视网膜病(proliferative diabetic retinopathy)(pdr)、囊样黄斑水肿(cystoid macular oedema)、中心性浆液性视网膜病(central serous retinopathy)、视网膜脱落、眼内炎、青光眼和后葡萄膜炎。
18.在一些方面中，本发明提供在将raav颗粒视网膜下递送至个体的眼部后与用包含野生型衣壳的raav转导细胞相比改进细胞的raav转导的方法，该方法包括在aav衣壳蛋白中并入一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号；其中所述raav颗粒包含raav衣壳蛋白和raav载体，所述raav载体包含所述异源核酸和至少一个aav末端重复。
19.在其他方面中，本发明提供在将raav颗粒视网膜下递送至个体的眼部后改进异源核酸的表达的方法，所述方法包括在aav衣壳蛋白中并入一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号；其中所述raav颗粒包含raav衣壳蛋白和raav载体，所述raav载体包含所述异源核酸和至少一个aav末端重复。
20.在一些实施方案中，具有改进的转导和/或改进的异源核酸表达的raav颗粒包含aav血清型2(aav2)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代降低所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％或约至少100％。
21.在一些实施方案中，具有改进的转导和/或改进的异源核酸表达的raav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置484、487、527、532、585或588处，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:1的氨基酸序列的aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:2、4和/
或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484和r487处或位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a取代或r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1。在进一步的实施方案中，所述aav衣壳包含氨基酸取代r585a和r588a，编号基于aav-2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳或aavrh10衣壳。
22.在一些实施方案中，具有改进的转导和/或改进的异源核酸表达的raav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置485、488、528、533、586或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在其他实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用带正电荷的氨基酸残基取代疏水性氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括丙氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基取代丙氨酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述氨基酸取代包括位置r485、r488、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含seq id no:11的raav衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个氨基酸取代包括r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。
23.在一些实施方案中，具有改进的转导和/或改进的异源核酸表达的raav颗粒包含含有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变与hspg的结合(例如降低或去除与hspg的结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号；和raav载体，其包含编码治疗性多肽或治疗性核酸的异源核酸。在一些实施方案中，所述异源核酸编码选自下组的多肽：抗氧化剂、神经营养因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。在进一步的实施方案中，所述异源核酸编码选自下组的多肽：prph2、rpe65、aipl1、gucy2d、lca5、crx、cep290、myo7a、clarin、abca4、rdh12、impdh1、crb1、lrat、nmnat1、tulp1、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3、gnat2、gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo、bcl2、bcl-x、nfκb、内皮他汀、血管他汀、sflt、spdgf-r、il10、抗-il17、
sil17r、il1-ra、抗-tgfβ、stnf-r i、stnf-r ii和il4。在其他实施方案中，所述异源核酸编码治疗性核酸。在进一步的实施方案中，所述治疗性核酸是sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核酶或脱氧核酶。在一些实施方案中，所述raav载体是自身互补的raav载体。
24.在一些实施方案中，具有改进的转导和/或改进的异源核酸表达的raav颗粒包含含有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变与hspg的结合(例如降低或去除与hspg的结合)或位于对应于氨基酸484、487、532、585或588的一个或多个位置，编号基于aav2的vp1编号；和编码治疗性多肽或治疗性核酸的异源核酸，所述异源核酸处于在视网膜中表达的启动子序列的控制下。在一些实施方案中，其中所述异源核酸可操作地连接至适于所述治疗性多肽或治疗性核酸在一个或多个视网膜细胞类型中表达的启动子。在一些实施方案中，所述视网膜细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞和/或神经节细胞。在一些实施方案中，所述启动子是视紫红激酶(rk)启动子、视蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。
25.在一些实施方案中，具有改进的转导和/或改进的异源核酸表达的raav颗粒包含含有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变与hspg的结合(例如降低或去除与hspg的结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置，编号基于aav2的vp1编号；和异源核酸，用于将所述异源核酸递送至个体的视网膜。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述异源核酸用于治疗选自下组的眼部病症：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇)、先天性全色盲、斯塔加特氏病、贝斯特氏病、doyne氏病、锥体营养不良、视网膜色素变性、x连锁视网膜劈裂症、usher氏综合征、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性amd、糖尿病性黄斑病变、增生性糖尿病性视网膜病(pdr)、囊样黄斑水肿、中心性浆液性视网膜病、视网膜脱落、眼内炎、青光眼和后葡萄膜炎。
26.在一些方面，本发明提供治疗个体(例如人)中的眼部病症的方法，其包括将包含raav颗粒的组合物递送至个体的视网膜，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含所述异源核酸和至少一个aav末端重复。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型2(aav2)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代降低所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。
27.在一些实施方案中，所述方法包括视网膜下递送包含编码异源核酸的raav载体的raav颗粒，其用于治疗个体(例如人)中的眼部病症，其中所述raav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置484、487、527、532、585或588处，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:1的氨基酸序列的aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代
精氨酸或赖氨酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:2、4和/或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484和r487处或位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a取代或r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1。在进一步的实施方案中，所述aav衣壳包含氨基酸取代r585a和r588a，编号基于aav-2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳、或aavrh10衣壳。
28.在一些实施方案中，所述方法包括视网膜下递送包含编码异源核酸的raav载体的raav颗粒，其用于治疗个体(例如人)中的眼部病症，其中所述raav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置485、488、528、533、586或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在其他实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用带正电荷的氨基酸残基取代疏水性氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括丙氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基取代丙氨酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述氨基酸取代包括位置r485、r488、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含seq id no:11的raav衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个氨基酸取代包括r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。
29.在一些实施方案中，所述方法包括视网膜下递送包含编码异源核酸的raav载体的raav颗粒，其用于治疗个体(例如人)中的眼部病症；和包含一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变与hspg的结合(例如降低或去除与hspg的结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，所述异源核酸编码选自下组的多肽：抗氧化剂、神经营养因子、抗凋亡因子、抗血管生成
因子和抗炎因子。在进一步的实施方案中，所述异源核酸编码选自下组的多肽：prph2、rpe65、aipl1、gucy2d、lca5、crx、cep290、myo7a、clarin、abca4、rdh12、impdh1、crb1、lrat、nmnat1、tulp1、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3、gnat2、gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo、bcl2、bcl-x、nfκb、内皮他汀、血管他汀、sflt、spdgf-r、il10、抗-il17、sil17r、il1-ra、抗-tgfβ、stnf-r i、stnf-r ii和il4。在其他实施方案中，所述异源核酸编码治疗性核酸。在进一步的实施方案中，所述治疗性核酸是sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核酶或脱氧核酶。在一些实施方案中，所述raav载体是自身互补的raav载体。
30.在一些实施方案中，所述方法包括视网膜下递送包含编码异源核酸的raav载体的raav颗粒，其用于治疗个体(例如人)中的眼部病症；和包含一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变与hspg的结合(例如降低或去除与hspg的结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置，编号基于aav2的vp1编号，其中所述异源核酸处于在视网膜中表达的启动子序列的控制下。在一些实施方案中，所述异源核酸可操作地连接至适于所述治疗性多肽或治疗性核酸在一个或多个视网膜细胞类型中表达的启动子。在一些实施方案中，所述视网膜细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞和/或神经节细胞。在一些实施方案中，所述启动子是视紫红激酶(rk)启动子、视蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。
31.在一些实施方案中，所述方法包括视网膜下递送包含编码异源核酸的raav载体的raav颗粒，其用于治疗个体(例如人)中的眼部病症；和包含一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变与hspg的结合(例如降低或去除与hspg的结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置，编号基于aav2的vp1编号，其中所述眼部病症选自下列组成群组：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇)、先天性全色盲、斯塔加特氏病、贝斯特氏病、doyne氏病、锥体营养不良、视网膜色素变性、x连锁视网膜劈裂症、usher氏综合征、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性amd、糖尿病性黄斑病变、增生性糖尿病性视网膜病(pdr)、囊样黄斑水肿、中心性浆液性视网膜病、视网膜脱落、眼内炎、青光眼和后葡萄膜炎。
32.在一些实施方案中，所述方法包括视网膜下递送包含raav颗粒的组合物，其中所述raav颗粒包含编码异源核酸的raav载体，其用于治疗个体(例如人)中的眼部病症；和包含一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变与hspg的结合(例如降低或去除与hspg的结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，所述组合物中颗粒的浓度为约1x 106drp/ml至约1x 10
14
drp/ml。在一些实施方案中，所述raav颗粒的组合物对于治疗个体的视觉功能是有效的。在一些实施方案中，视觉功能通过微视野检查法、暗适应视野检查法、视觉活动性评估、视敏度、erg或阅读评估来评价。在一些实施方案中，所述方法导致个体的视觉功能的改进。在一些实施方案中，所述方法导致预防由于眼部病症的进展所致的人的视觉功能衰退或是减缓所述衰退的进展。
33.在一些方面，本发明提供用于将载体视网膜下递送至个体的眼的系统，其包含a)含有有效量的raav颗粒的组合物，其中i)所述raav颗粒的衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和
ii)所述载体包含编码治疗性多肽或治疗性rna的异源核酸和至少一个aav末端重复；和b)用于视网膜递送所述raav的装置。在一些实施方案中，所述装置包含细孔套管和注射器，其中所述细孔套管为27至45号(gauge)。在一些实施方案中，所述raav颗粒的组合物容纳于注射器内。在一些实施方案中，所述套管附接于注射器。在一些实施方案中，所述组合物中颗粒的浓度为约1x 106drp/ml至约1x 10
14
drp/ml。
34.在一些实施方案中，所述系统的raav颗粒包含含有一个或多个氨基酸取代的aav2衣壳，所述氨基酸取代改变hspg结合(例如降低或去除结合)。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代降低所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代增加raav颗粒对眼部或cns中细胞的转导效率。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代增加raav颗粒对眼或cns中细胞的转导效率，例如与包含野生型aav衣壳蛋白的参考raav衣壳相比增加约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。在一些实施方案中，眼的细胞是视网膜细胞、感光细胞、视网膜色素上皮细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、muller细胞和/或神经节细胞。在一些实施方案中，所述cns的细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。
35.在一些实施方案中，所述系统的raav颗粒包含含有一个或多个氨基酸取代的aav2衣壳，所述氨基酸取代改变hspg结合(例如降低或去除结合)。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置484、487、527、532、585或588处，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:1的氨基酸序列的aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:2、4和/或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484和r487处或位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a取代或r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1。在进一步的实施方案中，所述aav衣壳包括氨基酸取代r585a和r588a，编号基于aav-2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳或aavrh10衣壳。
36.在一些实施方案中，所述系统的raav颗粒包含含有一个或多个氨基酸取代的aav2衣壳，所述氨基酸取代改变hspg结合(例如降低或去除结合)。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528、533、586或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些
实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在其他实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用带正电荷的氨基酸残基取代疏水性氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括丙氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基取代丙氨酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述氨基酸取代包括位置r485、r488、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含seq id no:11的raav衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个氨基酸取代包括r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。
37.在一些实施方案中，所述系统的raav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变hspg结合(例如降低或去除结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号；和包含异源核酸的raav载体。在一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。在一些实施方案中，所述异源核酸编码选自下组的多肽：抗氧化剂、神经营养因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。在进一步的实施方案中，所述异源核酸编码选自下组的多肽：prph2、rpe65、aipl1、gucy2d、lca5、crx、cep290、myo 7a、clarin、abca4、rdh12、impdh1、crb1、lrat、nmnat1、tulp1、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3、gnat2、gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo、bcl2、bcl-x、nfκb、内皮他汀、血管他汀、sflt、spdgf-r、il10、抗-il17、sil17r、il1-ra、抗-tgfβ、stnf-r i、stnf-r ii和il4。在其他实施方案中，所述异源核酸编码治疗性核酸。在进一步的实施方案中，所述治疗性核酸是sirna、rnai、mirna、反义rna、核酶或脱氧核酶。在一些实施方案中，所述raav载体是自身互补的raav载体。
38.在一些实施方案中，所述系统的raav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变hspg结合(例如降低或去除结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号；和包含异源核酸的raav载体，其中所述异源核酸处于在视网膜中表达的启动子序列的控制下。在一些实施方案中，所述异源核酸可操作地连接至适于所述治疗性多肽或治疗性核酸在一个或多个视网膜细胞类型中表达的启动子。在一些实施方案中，所述视网膜细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞和/或神经节细胞。在一些实施方案中，所述启动子是视紫红激酶(rk)启动子、视蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。
39.在一些实施方案中，所述系统的raav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变hspg结合(例如降低或去除结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号；和包含异源核酸的raav
载体，其用于将所述异源核酸递送至个体的视网膜。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述异源核酸用于治疗选自下组的眼部病症：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇)、先天性全色盲、斯塔加特氏病、贝斯特氏病、doyne氏病、锥体营养不良、视网膜色素变性、x连锁视网膜劈裂症、usher氏综合征、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性amd、糖尿病性黄斑病变、增生性糖尿病性视网膜病(pdr)、囊样黄斑水肿、中心性浆液性视网膜病、视网膜脱落、眼内炎、青光眼和后葡萄膜炎。
40.在一些方面，本发明提供用于将异源核酸递送至个体的中枢神经系统(cns)的方法，其包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于个体的cns，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。在一些方面，本发明提供一种与用包含野生型衣壳的raav转导细胞相比改进对个体的中枢神经系统(cns)中细胞的raav转导的方法，该方法包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于所述个体的cns，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。在进一步的方面，本发明提供一种改进异源核酸在个体的中枢神经系统(cns)中表达的方法，所述方法包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于所述个体的cns，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。在更进一步的方面中，本发明提供一种治疗个体的中枢神经系统(cns)的病症的方法，其包括将有效量的包含raav颗粒的组合物施用于所述个体的cns，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复。
41.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述异源核酸以增加的表达水平表达，所述增加是与包含参考raav衣壳的raav颗粒的异源核酸的表达水平相比。在一些实施方案中，将所述核酸的表达增加至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约100％。在一些实施方案中，所述raav颗粒导致与包含参考raav衣壳的raav颗粒相比降低的神经性炎症(neuroinflammation)。在一些实施方案中，将神经性炎症减少至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约100％。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型2(aav2)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代降低所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，与包含参考raav衣壳的raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合相比，所述一个或多个氨基酸取代降低raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将raav
颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。在一些实施方案中，与包含参考衣壳的raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合相比，所述一个或多个氨基酸取代将raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％或约至少100％。在一些实施方案中，参考raav衣壳包含野生型raav衣壳或衣壳蛋白。在一些实施方案中，参考raav衣壳包含缺乏一个或多个氨基酸取代的raav衣壳或衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代增加raav颗粒对眼或cns中细胞的转导效率。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将raav颗粒对眼或cns中细胞的转导效率增加约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％或约至少100％，例如与包含野生型aav衣壳蛋白的参考raav衣壳相比。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳或aavrh10衣壳。
42.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述施用包含直接脊髓注射和/或脑内施用。在一些实施方案中，所述脑内施用位于选自下组的部位：大脑、髓质、脑桥(pons)、小脑、颅内腔、围绕脑的脑膜、硬脑膜(dura mater)、蛛网膜(arachnoid mater)、软脑膜(pia mater)、围绕脑的蛛网膜下腔的脑脊液(csf)、小脑的深部小脑核、大脑的脑室系统、蛛网膜下腔、纹状体(striatum)、皮层、隔膜(septum)、丘脑、下丘脑和脑的实质(parenchyma of the brain)。在一些实施方案中，所述施用是脑室内注射入至少一个大脑侧脑室。在一些实施方案中，所述施用是鞘内注射于颈(cervical)、胸和/或腰部中。在一些实施方案中，所述施用是纹状体内注射。在一些实施方案中，所述施用是丘脑内注射。在一些实施方案中，所述施用是(脑)实质内注射。在一些实施方案中，所述施用包含直接脊髓注射、颅内和/或脑内施用。在一些实施方案中，所述raav颗粒在单一部位施用。
43.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述raav颗粒通过立体定向递送(stereotactic delivery)来递送。在一些实施方案中，所述raav颗粒通过对流增强递送(convection enhanced delivery)来递送。在一些实施方案中，使用ced递送系统来施用所述raav颗粒。在一些实施方案中，ced递送系统包含套管和/或泵。在一些实施方案中，所述套管是抗回流套管或阶梯式套管。在一些实施方案中，泵是手动泵。在一些实施方案中，泵是渗透泵。在一些实施方案中，泵是输液泵。
44.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在cns的一种或多种细胞上表达。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。在一些实施方案中，所述硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在神经元上表达。
45.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述异源核酸在cns的一种或多种细胞中表达。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。在一些实施方案中，所述异源核酸在神经元中表达。在一些实施方案中，所述异源核酸仅在神经元中表达。
46.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于448、451、484、487、527、532、585和/或588处，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置484、487、527、532、585或588处，编号基于aav2的vp1编号。
在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:1的氨基酸序列的aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r347、r350、k390、k395、r448、r451、r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:2、4和/或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包含r347a、r350a、k390a、k395a、r448a、r451a、r484a、r487a、k527a、k532a、r585a和/或r588a取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484和r487处或位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a取代或r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳包含氨基酸取代r585a和r588a，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳包含氨基酸取代k532a，编号基于aav2的vp1。
47.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528、533、586或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在其他实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用带正电荷的氨基酸残基取代疏水性氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括丙氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基取代丙氨酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述氨基酸取代包括位置r485、r488、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含seq id no:11的raav衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个氨基酸取代包括r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。
48.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。在一些实施方案中，所述异源核酸编码cns相关的基因。在一些实施方案中，所述异
源核酸编码选自下组的多肽：酶、神经营养因子、在患有cns相关的病症的个体中缺乏或突变的多肽、抗氧化剂、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子、α-突触核蛋白、酸性β-葡糖苷酶(gba)、β-半乳糖苷酶-1(glb1)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(ids)、半乳糖基神经酰胺酶(galc)、甘露糖苷酶、α-d-甘露糖苷酶(man2b1)、β-甘露糖苷酶(manba)、假芳基硫酸酯酶a(arsa)、n-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(gnptab)、酸性鞘磷脂酶(asm)、尼曼-皮克c蛋白(npc1)、酸性α-1,4-葡糖苷酶(gaa)、己糖胺酶β亚基、hexb、n-磺基葡糖胺磺基水解酶(mps3a)、n-α-乙酰葡糖胺酶(naglu)、肝素乙酰-coa、α-葡糖胺酶n-乙酰转移酶(mps3c)、n-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶(gns)、α-n-乙酰半乳糖胺酶(naga)、β-葡糖醛酸酶(gusb)、己糖胺酶α亚基(hexa)、亨廷顿蛋白(htt)、溶酶体酸性脂肪酶(lipa)、天冬氨酰葡糖胺酶、α-半乳糖苷酶a、棕榈酰蛋白硫酯酶、三肽基肽酶、溶酶体跨膜蛋白、半胱氨酸转运蛋白、酸性神经酰胺酶、酸性α-l-岩藻糖苷酶、组织蛋白酶a、α-l-艾杜糖醛酸糖苷酶、芳基硫酸酯酶b、芳基硫酸酯酶a、n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯、酸性β-半乳糖苷酶或α-神经酰胺酶。在一些实施方案中，所述异源核酸编码选自下组的多肽：神经元细胞凋亡抑制蛋白(naip)、神经生长因子(ngf)、神经胶质来源的生长因子(gdnf)、脑源性生长因子(bdnf)、睫状神经营养因子(cntf)、酪氨酸羟化酶(th)、gtp环化水解酶(gtpch)、氨基酸脱羧酶(aadc)、抗氧化剂，抗血管生成多肽、抗炎多肽，和天冬氨酸酰基酶(aspartoacylase,aspa)。在一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性核酸。在一些实施方案中，所述治疗性核酸是sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核酶或脱氧核酶。在一些实施方案中，所述异源核酸处于在cns的一种或多种细胞中表达的启动子序列的控制下。在一些实施方案中，所述异源核酸处于选自下组的启动子序列的控制下：巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子，rsv ltr，momlv ltr，磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子，猿猴病毒40(sv40)启动子，ck6启动子，甲状腺素转运蛋白启动子(ttr)，tk启动子，四环素响应性启动子(tre)，hbv启动子，haat启动子，lsp启动子，嵌合肝特异性启动子(lsp)，e2f启动子，端粒酶(htert)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β球蛋白启动子(cag)启动子，延伸因子1-α启动子(ef1-α)启动子，人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子，鸡β-肌动蛋白(cba)启动子，逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(rsv)ltr启动子，二氢叶酸还原酶启动子，和13-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述异源核酸可操作地连接至适于治疗性多肽或治疗性核酸在cns的一种或多种细胞中表达的启动子。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞包含脑的一种或多种细胞。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。在一些实施方案中，所述脑细胞是神经元。
49.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述raav载体是自身互补的raav载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码所述异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。
50.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述个体是人。
51.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述异源核酸编码用于治疗cns的病症的治疗性多肽或治疗性核酸。在一些实施方案中，所述cns的病症为溶酶体贮积病(lsd)、亨廷顿氏病、癫痫、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、皮质基底节变性(cbd)、皮质基底神
经节变性(cbgd)、额颞叶痴呆(ftd)、多系统萎缩症(msa)、进行性核上麻痹(psp)或脑癌。在一些实施方案中，所述病症为选自下组的溶酶体贮积病：天冬氨酰葡糖胺尿症(aspartylglusoaminuria)、法布里病(fabry)、婴儿巴藤病(cnl1)、经典婴儿后期巴藤病(cnl2)、幼年巴藤病(cnl3)、巴藤病形式cnl4、巴藤病形式cnl5、巴藤病形式cnl6、巴藤病形式cnl7、巴藤病形式cnl8、胱氨酸贮积症、法伯氏病、岩藻糖苷贮积症、半乳糖苷贮积症(galactosidosialidosis)、戈谢病(gaucher disease)1型、戈谢病2型、戈谢病3型、gm1神经节苷脂贮积症、亨特病(hunter disease)、克拉伯病(krabbe disease)、α甘露糖苷贮积症、β甘露糖苷贮积症、马-拉病(maroteaux-lamy)、异染性脑白质营养不良症、穆尔丘病(morquio)a、穆尔丘病b、粘脂贮积病ii/iii、尼曼-皮克病(niemann-pick)a、尼曼-皮克病b、尼曼-皮克病c、蓬佩病(pompe disease)、桑德霍夫病(sandhoff disease)、圣菲利柏氏症(sanfillipo)a、圣菲利柏氏症b、圣菲利柏氏症c、圣菲利柏氏症d、辛德勒病(schindler disease)、辛德勒-神崎病(schindler-kanzaki)、涎酸贮积症、史莱氏症(sly disease)、泰-萨二氏病(tay-sachs disease)和沃尔曼病(wolman disease)。在一些实施方案中，所述cns的病症是亨廷顿氏病或帕金森氏病。
52.在一些方面，本发明提供在个体中治疗亨廷顿氏病的方法，其包括将有效量的包含重组腺相关病毒(raav)颗粒的组合物施用于个体的纹状体，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复。在一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。在一些实施方案中，所述治疗性多肽是亨廷顿蛋白多肽或其片段。在一些实施方案中，所述亨廷顿蛋白多肽或其片段是功能性亨廷顿蛋白多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述治疗性核酸包含针对亨廷顿蛋白的rnai。在一些实施方案中，所述rnai是mirna。
53.在一些方面，本发明提供治疗个体中的帕金森氏病的方法，其包括将有效量的包含重组腺相关病毒(raav)颗粒的组合物施用于个体的纹状体，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复。在一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。在一些实施方案中，所述治疗性多肽是th、gtpcii、gdnf、bdnf和/或aadc；或其片段。在一些实施方案中，所述治疗性多肽是aadc或其片段。
54.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述异源核酸以增加的表达水平表达，所述增加是与包含参考raav衣壳的raav颗粒的异源核酸的表达水平相比。在一些实施方案中，所述raav颗粒导致与包含参考raav衣壳的raav颗粒相比降低的神经性炎症。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型2(aav2)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代降低所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，与包含参考raav衣壳的raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合相比，所述一个或多个氨基酸取代降低所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低约至少10％、约
至少25％、约至少50％、约至少75％或、约至少100％。在一些实施方案中，与包含参考衣壳的raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合相比，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。在一些实施方案中，参考raav衣壳包含野生型raav衣壳或衣壳蛋白。在一些实施方案中，参考raav衣壳包含缺乏一个或多个氨基酸取代的raav衣壳或衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置。
55.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述raav颗粒通过立体定向递送来递送。在一些实施方案中，所述raav颗粒通过对流增强递送来递送。在一些实施方案中，使用ced递送系统来施用所述raav颗粒。在一些实施方案中，所述套管是抗回流套管或阶梯式套管。在一些实施方案中，所述ced递送系统包含套管和/或泵。在一些实施方案中，使用ced递送系统施用所述raav颗粒。在一些实施方案中，所述泵是手动泵。在一些实施方案中，所述泵是渗透泵。在一些实施方案中，所述泵是输液泵。
56.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在cns的一种或多种细胞上表达。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。在一些实施方案中，所述硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在神经元上表达。
57.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述异源核酸在cns的一种或多种细胞中表达。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。在一些实施方案中，所述异源核酸在神经元中表达。在一些实施方案中，所述异源核酸仅(exclusively)在神经元中表达。
58.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置484、487、527、532、585或588处，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:1的氨基酸序列的aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r347、r350、k390、k395、r448、r451、r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:2、4和/或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括r347a、r350a、k390a、k395a、r448a、r451a、r484a、r487a、k527a、k532a、r585a和/或r588a取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484和r487处或位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a取代或r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳包括氨基酸取代r585a和
r588a，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳包括氨基酸取代k532a，编号基于aav2的vp1。
59.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在位置485、488、528、533、586或589，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在其他实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用带正电荷的氨基酸残基取代疏水性氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括丙氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基取代丙氨酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述氨基酸取代包括位置r485、r488、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含seq id no:11的raav衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个氨基酸取代包括r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳、或aavrh10衣壳。
60.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述异源核酸处于在cns的一种或多种细胞中表达的启动子序列的控制下。在一些实施方案中，所述异源核酸处于选自下组的启动子序列的控制下：巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子，rsvltr，momlv ltr，磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子，猿猴病毒40(sv40)启动子，ck6启动子，甲状腺素转运蛋白启动子(ttr)，tk启动子，四环素响应性启动子(tre)，hbv启动子，haat启动子，lsp启动子，嵌合肝特异性启动子(lsp)，e2f启动子，端粒酶(htert)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β球蛋白启动子(cag)启动子，延伸因子1-α启动子(ef1-α)启动子，人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子，鸡β-肌动蛋白(cba)启动子，逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(rsv)ltr启动子，二氢叶酸还原酶启动子，和13-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述异源核酸可操作地连接至适于治疗性多肽或治疗性核酸在cns的一种或多种细胞中表达的启动子。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞包含脑的一种或多种细胞。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。在一些实施方案中，所述脑细胞是神经元。
61.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述raav载体是自身互补的raav载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码所述异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的
互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。
62.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述个体是人。
63.在一些方面，本发明提供用于任何上述具体实施方案的试剂盒，其包含重组腺相关病毒(raav)颗粒，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。在一些方面，本发明提供用于将异源核酸递送至个体的中枢神经系统(cns)的试剂盒，其包含含有重组腺相关病毒(raav)颗粒的组合物，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。在一些方面，本发明提供用于治疗个体中的中枢神经系统(cns)病症的试剂盒，其包含含有重组腺相关病毒(raav)颗粒的组合物，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和b)raav载体，其包含用于治疗cns病症的异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
64.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述cns病症是亨廷顿氏病。在一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。在一些实施方案中，所述治疗性多肽是亨廷顿蛋白多肽或其片段。在一些实施方案中，所述亨廷顿蛋白多肽或其片段是功能性亨廷顿蛋白多肽或其功能片段。在一些实施方案中，所述治疗性核酸包含针对亨廷顿蛋白的rnai。在一些实施方案中，所述rnai是mirna。在一些实施方案中，所述cns病症是帕金森氏病。
65.在一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。在一些实施方案中，所述治疗性多肽是th、gtpcii、gdnf、bdnf和/或aadc；或其片段。在一些实施方案中，所述治疗性多肽是aadc或其片段。
66.在一些方面，本发明提供重组腺相关病毒(raav)颗粒，其用于在任何上述实施方案中使用。在一些方面，本发明提供重组腺相关病毒(raav)颗粒，其用于将异源核酸递送至个体的中枢神经系统(cns)，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。在一些方面，本发明提供重组腺相关病毒(raav)颗粒，其用于治疗个体的中枢神经系统(cns)的病症，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复。在一些方面，本发明提供用于治疗个体中的亨廷顿氏病的重组腺相关病毒(raav)颗粒，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其
包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复，其中所述raav颗粒经配制用于递送至纹状体。在一些方面，本发明提供用于治疗个体中的帕金森氏病的重组腺相关病毒(raav)颗粒，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复，其中所述raav颗粒经配制用于递送至纹状体。在一些方面，本发明提供用于治疗个体中的亨廷顿氏病的重组腺相关病毒(raav)颗粒，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复，其中所述raav颗粒经配制用于单一部位递送(例如至个体的cns)。在一些方面，本发明提供用于治疗个体中的帕金森氏病的重组腺相关病毒(raav)颗粒，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复，其中所述raav颗粒经配制用于单一部位递送(例如至个体的cns)。
67.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述异源核酸以增加的表达水平表达，所述增加是与包含参考raav衣壳的raav颗粒的异源核酸的表达水平相比。在一些实施方案中，与包含含有参考衣壳的raav衣壳的raav颗粒相比，所述raav颗粒导致降低的神经性炎症。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型2(aav2)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代降低所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，与包含参考raav衣壳的raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合相比，所述一个或多个氨基酸取代降低所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％或约至少100％。在一些实施方案中，与包含参考衣壳的raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合相比，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。在一些实施方案中，参考raav衣壳包含野生型raav衣壳或衣壳蛋白。在一些实施方案中，参考raav衣壳包含缺乏一个或多个氨基酸取代的raav衣壳或衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。
68.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在cns的一种或多种细胞上表达。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞为是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。在一些实施方案中，所述硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在神经元上表达。
69.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述异源核酸在cns的一种或多种细胞中表达。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。在一些实施方案中，所述异源核酸在神经元中表达。在一些实施方案中，所述异源核酸仅在神经元中表达。
70.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置484、487、527、532、585或588处，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r347、r350、k390、k395、r448、r451、r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:2、4和/或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包含r347a、r350a、k390a、k395a、r448a、r451a、r484a、r487a、k527a、k532a、r585a和/或r588a取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484和r487处或位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a取代或r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳包括氨基酸取代r585a和r588a，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳包括氨基酸取代k532a，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳或aavrh10衣壳。
71.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528、533、586或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在其他实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用带正电荷的氨基酸残基取代疏水性氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括丙氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基取代丙氨酸残基。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于aavrh8r的vp1，所述aavrh8r包含seq id no:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸取代包括位置r485、r488、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含seq id no:11的raav衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。在一些实施方案中，所述一个氨基酸取代包括r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。
72.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述异源核酸处于在cns的一种或多种细胞中表达的启动子序列的控制下。在一些实施方案中，所述异源核酸处于选自下组的启动子序列的控制下：巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子，rsv ltr，momlv ltr，磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子，猿猴病毒40(sv40)启动子，ck6启动子，甲状腺素转运蛋白启动子(ttr)，tk启动子，四环素响应性启动子(tre)，hbv启动子，haat启动子，lsp启动子，嵌合肝特异性启动子(lsp)，e2f启动子，端粒酶(htert)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β球蛋白启动子(cag)启动子，延伸因子1-α启动子(ef1-α)启动子，人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子，鸡β-肌动蛋白(cba)启动子，逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(rsv)ltr启动子，二氢叶酸还原酶启动子，和13-肌动蛋白启动子。在一些实施方案中，所述异源核酸可操作地连接至适于治疗性多肽或治疗性核酸在cns的一种或多种细胞中表达的启动子。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞包含脑的一种或多种细胞。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。
73.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述raav载体是自身互补的raav载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码所述异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。
74.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述个体是人。
75.在上述方面和实施方案的一些实施方案中，所述raav颗粒在组合物中。在一些实施方案中，所述组合物包含缓冲液和/或药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，所述试剂盒或raav颗粒进一步包含用于将所述raav颗粒的组合物递送至cns的说明书。在一些实施方案中，所述试剂盒或raav颗粒进一步包含用于将所述raav颗粒的组合物递送至纹状体的说明书。
76.在一些方面，本发明提供包含aavrh8r衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aavrh8r衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，其中与包含野生型aavrh8r衣壳蛋白的aav颗粒相比，所述一个或多个氨基酸取代增加所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合，或其中所述一个或多个氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合增加约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于位置586处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述氨基酸取代包括位置a586处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述氨基酸取代包括a586r或a586k取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含seq id no:10的raav衣壳蛋白。
77.在一些方面，本发明提供增加包含aavrh8r衣壳蛋白的raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合的方法，其包括将一个或多个氨基酸取代引入衣壳蛋白，其中与包含野生型aavrh8r衣壳蛋白的aav颗粒相比，所述一个或多个氨基酸取代增加所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合增加约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。在一些实施方案中，所述氨基酸取代位于位置586处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述氨基酸取代包括位置a586处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述氨基酸取代包括a586r或a586k取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含seq id no:10的raav衣壳蛋白。
78.在一些方面，本发明提供用于将异源核酸递送至个体的视网膜的方法，其包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒玻璃体内施用于个体，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。在一些方面，本发明提供在将raav颗粒经玻璃体内递送至个体眼部后与用包含野生型衣壳的raav转导细胞相比改进细胞的raav转导的方法，所述方法包括将一个或多个氨基酸取代并入aav衣壳蛋白中，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号；其中所述raav颗粒包含raav衣壳蛋白和raav载体，所述raav载体包含异源核酸和至少一个aav末端重复。在一些方面，本发明提供在将raav颗粒玻璃体内递送至个体眼部后改进异源核酸的表达的方法，所述方法包括将一个或多个氨基酸取代并入aav衣壳蛋白中，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号；其中所述raav颗粒包含raav衣壳蛋白和raav载体，所述raav载体包含异源核酸和至少一个aav末端重复。在一些方面，本发明提供治疗个体中的眼部病症的方法，其包括将包含raav颗粒的组合物玻璃体内递送至个体的视网膜，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复。在一些方面，本发明提供用于将载体玻璃体内递送至个体眼部的系统，其包含a)含有有效量的raav颗粒的组合物，其中i)所述raav颗粒的衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，和ii)载体，其包含编码治疗性多肽或治疗性rna的异源核酸和至少一个aav末端重复；和b)用于玻璃体内递送所述raav的装置。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aavrh8r、aav1、aav6、aav8、aav9或aavrh10血清型衣壳。在一些方面，本发明提供用于治疗眼部病症的试剂盒，其包含a)含有raav颗粒的组合物，其中所述raav颗粒包含i)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个
或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，和ii)raav载体，其包含用于治疗眼部病症的异源核酸和至少一个aav反向末端重复；和b)适于玻璃体内施用的药物赋形剂。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aavrh8r、aav1、aav6、aav8、aav9或aavrh10衣壳。在一些方面，本发明提供包含aav1衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aav1衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，其中与包含野生型aav1衣壳蛋白的aav颗粒相比，所述一个或多个氨基酸取代增加所述raav颗粒至眼中细胞的转导效率，或其中所述一个或多个氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。在一些方面，本发明提供包含aav6衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aav6衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，其中与包含野生型aav6衣壳蛋白的aav颗粒相比，所述一个或多个氨基酸取代增加所述raav颗粒至眼中细胞的转导效率，或其中所述一个或多个氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。在一些方面，本发明提供包含aav8衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aav8衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，其中与包含野生型aav8衣壳蛋白的aav颗粒相比，所述一个或多个氨基酸取代增加所述raav颗粒至眼中细胞的转导效率，或其中所述一个或多个氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。在一些方面，本发明提供包含aav9衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aav9衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，其中与包含野生型aav9衣壳蛋白的aav颗粒相比，所述一个或多个氨基酸取代增加所述raav颗粒至眼中细胞的转导效率，或其中所述一个或多个氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。在一些方面，本发明提供包含aavrh10衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aavrh10衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，其中与包含野生型aavrh10衣壳蛋白的aav颗粒相比，所述一个或多个氨基酸取代增加所述raav颗粒至眼中细胞的转导效率，或其中所述一个或多个氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。在一些方面，本发明提供包含aav3衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aav3衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳、或aavrh10衣壳。在一些实施方案中，所述转导效率增加至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约100％。
79.在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代增加所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合增加约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。在一些实施方案中，与包含野生型aavrh8r衣壳蛋白的aav颗粒相比，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒对于眼部或中枢神经系统中的细胞的转导效率增加约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。在一些实施方案中，眼的细胞是视网膜细胞、感光细胞、视网膜色素上皮细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、muller细胞和/或神经节细胞。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，所述带正电荷的氨
基酸残基代替疏水性氨基酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基取代丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸残基。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型rh8r(aavrh8r)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置a586和/或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括a586r或a586k取代，编号基于aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型1(aav1)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav1的vp1编号。在一些实施方案中，所述aav1的vp1包含seq id no:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或t589处的取代，编号基于aav1的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav1的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aav1的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型6(aav6)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav6的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:13的氨基酸序列的aav6的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或t589处的取代，编号基于aav6的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括s586r取代，编号基于aav6的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aav6的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型8(aav8)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代在位置588和/或591，编号基于aav8的vp1编号。在一些实施方案中，所述aav8的vp1包含seq id no:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置q588和/或t591处的取代，编号基于aav8的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括q588r或q588k取代，编号基于aav8的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包含t591r取代，编号基于aav8的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型9(aav9)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav9的vp1编号。在一些实施方案中，所述aav9的vp1包含seq id no:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或a589处的取代，编号基于aav9的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav9的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括a589r或a589k取代，编号基于aav9的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型rh10(aavrh10)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置588和/或591处，编号基于aavrh10的vp1编号。在一些实施方案中，所述aavrh10的vp1包含seq id no:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置q588和/或a591处的取代，编号基于aavrh10的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括q588r或q588k取代，编号基于aavrh10的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括a591r或a591k取代，编号基于aavrh10的vp1。在一些实施方案中，本发明提供
包含aav3衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aav3衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，与包含野生型aavrh8r衣壳蛋白的aav颗粒相比，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒对于眼或中枢神经系统中细胞的转导效率增加约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳、或aavrh10衣壳。在一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。在一些实施方案中，所述异源核酸编码选自下组的多肽：抗氧化剂、神经营养因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。在进一步的实施方案中，所述异源核酸编码选自下组的多肽：prph2、rpe65、aipl1、gucy2d、lca5、crx、cep290、myo 7a、clarin、abca4、rdh12、impdh1、crb1、lrat、nmnat1、tulp1、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3、gnat2、gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo、bcl2、bcl-x、nfκb、内皮他汀、血管他汀、sflt、spdgf-r、il10、抗-il17、sil17r、il1-ra、抗-tgfβ、stnf-r i、stnf-rii和il4。在其他实施方案中，所述异源核酸编码治疗性核酸。在进一步的实施方案中，所述治疗性核酸是sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核酶或脱氧核酶。在一些实施方案中，所述raav载体是自身互补的raav载体。在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含含有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变与hspg的结合(例如降低或去除与hspg的结合)或位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号；和编码治疗性多肽或治疗性核酸的异源核酸，其中所述异源核酸处于在视网膜中表达的启动子序列的控制下。在一些实施方案中，其中所述异源核酸可操作地连接至适于所述治疗性多肽或治疗性核酸在一个或多个视网膜细胞类型中表达的启动子。在一些实施方案中，所述视网膜细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、muller细胞和/或神经节细胞。在一些实施方案中，所述启动子是视紫红激酶(rk)启动子、视蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述异源核酸用于治疗选自下组的眼部病症：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇)、先天性全色盲、斯塔加特氏病、贝斯特氏病、doyne氏病、锥体营养不良、视网膜色素变性、x连锁视网膜劈裂症、usher氏综合征、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性amd、糖尿病性黄斑病变、增生性糖尿病性视网膜病(pdr)、囊样黄斑水肿、中心性浆液性视网膜病、视网膜脱落、眼内炎、青光眼和后葡萄膜炎。在一些实施方案中，所述raav载体是自身互补的raav载体。在一些实施方案中，所述载体包含编码所述异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。在一些实施方案中，所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，与包含野生型aavrh8r衣壳蛋白的aav颗粒相比，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒对于眼或中枢神经系统中的细胞的转导效率增加约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。
80.本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)通过提述以其整体并入。
81.具体地，本发明涉及如下各项：
82.1.一种用于将异源核酸递送至个体的眼部的方法，其包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于个体的视网膜下，其中所述raav颗粒包含：
83.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycan)相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
84.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
85.2.一种与用包含野生型衣壳的raav转导细胞相比在将raav颗粒经视网膜下递送至个体的眼部后改进细胞的raav转导的方法，该方法包括在aav衣壳蛋白中并入一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置，编号基于aav2的vp1编号；其中所述raav颗粒包含raav衣壳蛋白和raav载体，该raav载体包含异源核酸和至少一个aav末端重复。
86.3.一种将raav颗粒经视网膜下递送至个体的眼部后改进异源核酸的表达的方法，该方法包括在aav衣壳蛋白中并入一个或多个氨基酸取代，该氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置，编号基于aav2的vp1编号；其中该raav颗粒包含raav衣壳蛋白和raav载体，该raav载体包含异源核酸和至少一个aav末端重复。
87.4.一种在个体中治疗眼部病症的方法，其包括将包含raav颗粒的组合物递送至个体的视网膜，其中所述raav颗粒包含
88.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
89.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复。
90.5.项1-4任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代减少所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。
91.6.项5的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代将所示raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合减少约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。
92.7.项1-6任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。
93.8.项7的方法，其中用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。
94.9.项1-8任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。
95.10.项1-9任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。
96.11.项1的方法，其中所述raav颗粒包括aav血清型2(aav2)衣壳。
97.12.项1-11任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置484、487或532，编号基于aav2的vp1编号。
98.13.项12的方法，其中编号基于包含seq id no:1的氨基酸序列的aav2的vp1。
99.14.项1-11和13任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括在位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。
100.15.项1-12任一项的方法，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:2、4和/或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％序列同一性。
101.16.项1-12任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括在位置r484和r487处或在位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。
102.17.项1-12任一项的方法，其中所示一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a取代或r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1。
103.18.项1-12任一项的方法，其中所述aav衣壳包含氨基酸取代r585a和r588a，编号基于aav2的vp1。
104.19.项1-12任一项的方法，其中所示aav衣壳包含氨基酸取代k532a，编号基于aav2的vp1。
105.20.项1-10任一项的方法，其中所述raav颗粒包含aav血清型rh8r(aavrh8r)衣壳。
106.21.项20的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号，或所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。
107.22.项21的方法，其中所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。
108.23.项20-22任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括在位置r485、r488、k528、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号，或所述一个或多个氨基酸取代包括在位置r485、r488、k528或r533处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
109.24.项20-23任一项的方法，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所示raav衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％或100％序列同一性。
110.25.项20-24任一项的方法，其中一个氨基酸取代包括r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。
111.26.项1-25任一项的方法，其中所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。
112.27.项1-26任一项的方法，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：抗氧化剂、神经营养因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。
113.28.项1-27任一项的方法，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：prph2、rpe65、aipl1、gucy2d、lca5、crx、cep290、myo 7a、clarin、abca4、rdh12、impdh1、crb1、lrat、nmnat1、tulp1、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3、gnat2、gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo、bcl2、bcl-x、nfκb、内皮他汀(endostatin)、血管他汀(angiostatin)、sflt、spdgf-r、il10、抗-il17、sil17r、il1-ra、抗-tgfβ、stnf-r i、stnf-r ii和il4。
114.29.项1-26任一项的方法，其中所述异源核酸编码治疗性核酸。
115.30.项29的方法，其中所述治疗性核酸是sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核酶
或脱氧核酶(dnazyme)。
116.31.项1-30任一项的方法，其中所述异源核酸处于在视网膜中表达的启动子序列的控制下。
117.32.项1-31任一项的方法，其中所述异源核酸可操作地连接至适于治疗性多肽或治疗性核酸在一个或多个视网膜细胞类型中表达的启动子。
118.33.项32的方法，其中所述视网膜细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、muller细胞和/或神经节细胞。
119.34.项32或33的方法，其中所述视网膜细胞是感光细胞。
120.35.项31-34任一项的方法，其中所述启动子是视紫红激酶(rk)启动子、视蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。
121.36.项1-35任一项的方法，其中所述个体是人。
122.37.项36的方法，其中所述异源核酸用于治疗选自下组的眼部病症：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇(leber’s congenital amaurosis))、先天性全色盲、斯塔加特氏病(stargardt’s disease)、贝斯特氏病(best’s disease)、doyne氏病、锥体营养不良(cone dystrophy)、视网膜色素变性、x连锁视网膜劈裂症(x-linked retinoschisis)、usher氏综合征(usher’ssyndrome)、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性amd、糖尿病性黄斑病变、增生性糖尿病性视网膜病(pdr)、囊样黄斑水肿(cystoid macular oedema)、中心性浆液性视网膜病(central serous retinopathy)、视网膜脱落、眼内炎、青光眼和后葡萄膜炎。
123.38.项1-37任一项的方法，其中所述raav载体是自身互补的raav载体。
124.39.项38的方法，其中所述载体包含编码异源核酸的第一核酸序列和编码所述核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。
125.40.项39的方法，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。
126.41.项1-40任一项的方法，其中所述raav颗粒在药物组合物中。
127.42.项41的方法，其中所述药物组合物中颗粒的浓度为约1x 106drp/ml至约1x 10
14
drp/ml。
128.43.项41或42的方法，其中所述raav颗粒的药物组合物对治疗个体的视觉功能是有效的。
129.44.项43的方法，其中视觉功能通过微视野检查法、暗适应视野检查法、视觉活动性评估(assessment of visual mobility)、视敏度、erg、或阅读评估来评价。
130.45.项43或44的方法，其中所述方法导致个体视觉功能的改进。
131.46.项1-45任一项的方法，其中所述方法导致预防由于眼部病症的进展所致的人的视觉功能衰退或是减缓所述衰退的进展。
132.47.一种用于将载体视网膜下递送至个体的眼部的系统，其包括
133.a)组合物，其包含有效量的raav颗粒，其中
134.i)raav颗粒的衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585
或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
135.ii)所述载体包含异源核酸，所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性rna和至少一个aav末端重复；和
136.b)用于视网膜下递送raav的装置。
137.48.项47的系统，其中所述装置包含细孔套管和注射器，其中所述细孔套管是27至45号(gauge)。
138.49.项48的系统，其中所述raav颗粒的组合物容纳于该注射器内。
139.50.项48或49的系统，其中所述套管附接至该注射器。
140.51.项47-50任一项的系统，其中所述组合物中的颗粒的浓度为约1x 106drp/ml至约1x 10
14
drp/ml。
141.52.项47-51任一项的系统，其中所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳、或aavrh10衣壳。
142.53.项47-52任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代减少所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。
143.54.项53的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合减少约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。
144.55.项47-54任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。
145.56.项55的系统，其中用疏水性氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。
146.57.项47-56任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。
147.58.项47-57任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。
148.59.项47-58任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置484、487或532处，编号基于aav2的vp1编号。
149.60.项59的系统，其中所述编号基于包含seq id no:1的氨基酸序列的aav2的vp1。
150.61.项47-58和60任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位于位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。
151.62.项47-61任一项的系统，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:2、4和/或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％、或100％序列同一性。
152.63.项47-61任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括在位置r484和r487处或在位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。
153.64.项47-61任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a处取代或r585a和r588a处取代，编号基于aav2的vp1。
154.65.项47-61任一项的系统，其中所述aav衣壳包含氨基酸取代r585a和r588a，编号基于aav2的vp1。
155.66.项47-61任一项的系统，其中所述aav衣壳包含氨基酸取代k532a，编号基于aav2的vp1。
156.67.项47-58任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号，或所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。
157.68.项67的系统，其中所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。
158.69.项67或68的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r485、r488、k528、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号，或所述一个或多个氨基酸取代包括位置r485、r488、k528或r533处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
159.70.项67-69任一项的系统，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。
160.71.项67-70任一项的系统，其中一个氨基酸取代包含r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。
161.72.项47-71任一项的系统，其中所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。
162.73.项47-72任一项的系统，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：抗氧化剂、神经营养因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。
163.74.项47-73任一项的系统，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：prph2、rpe65、aipl1、gucy2d、lca5、crx、cep290、myo 7a、clarin、abca4、rdh12、impdh1、crb1、lrat、nmnat1、tulp1、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3、gnat2、gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo、bcl2、bcl-x、nfκb、内皮他汀、血管他汀、sflt、spdgf-r、il10、抗-il17、sil17r、il1-ra、抗-tgfβ、stnf-r i、stnf-r ii和il4。
164.75.项47-72任一项的系统，其中所述异源核酸编码治疗性核酸。
165.76.项75的系统，其中所述治疗性核酸是sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核酶或脱氧核酶。
166.77.项47-76任一项的系统，其中所述异源核酸处于在视网膜中表达的启动子序列的控制下。
167.78.项47-77任一项的系统，其中所述异源核酸可操作地连接至适于治疗性多肽或治疗性核酸在一个或多个视网膜细胞类型中表达的启动子。
168.79.项78的系统，其中所述视网膜细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、muller细胞和/或神经节细胞。
169.80.项79的系统，其中所述视网膜细胞是感光细胞。
170.81.项77-80任一项的系统，其中所述启动子是视紫红激酶(rk)启动子、视蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。
171.82.项47-81任一项的系统，其中所述个体是人。
172.83.项82的系统，其中所述异源核酸用于治疗选自下组的眼部病症：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇)、先天性全色盲、斯塔加特氏病、贝斯特氏病，
doyne氏病、锥体营养不良、视网膜色素变性、x连锁视网膜劈裂症、usher氏综合征、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性amd、糖尿病性黄斑病变、增生性糖尿病性视网膜病(pdr)、囊样黄斑水肿、中心性浆液性视网膜病、视网膜脱落、眼内炎、青光眼和后葡萄膜炎。
173.84.项47-83任一项的系统，其中所述raav载体是自身互补的raav载体。
174.85.项84的系统，其中所述载体包含编码异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。
175.86.项85的系统，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。
176.87.一种用于治疗眼部病症的试剂盒，其包含
177.a)包含raav颗粒的组合物，其中所述raav颗粒包含
178.i)包含raav衣壳蛋白的raav衣壳，所述raav衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
179.ii)raav载体，其包含用于治疗眼部病症的异源核酸和至少一个aav反向末端重复；和
180.b)适于视网膜下施用的药物赋形剂。
181.88.项87的试剂盒，其中所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳或aavrh10衣壳。
182.89.项87或88的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代减少所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。
183.90.项89的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合减少约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。
184.91.项87-90任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。
185.92.项91的试剂盒，其中用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。
186.93.项87-92任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。
187.94.项87-93任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。
188.95.项87-94任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置484、487或532处，编号基于aav2的vp1编号。
189.96.项95的试剂盒，其中所述编号基于包含seq id no:1的氨基酸序列的aav2的vp1。
190.97.项87-94和96任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。
191.98.项87-97任一项的试剂盒，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，
所述raav衣壳蛋白与seq id no:2、4和/或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。
192.99.项87-97任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484和r487处或位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。
193.100.项87-97任一项的试剂盒，其中达到一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a取代或r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1。
194.101.项87-97任一项的试剂盒，其中所述aav衣壳包含氨基酸取代r585a和r588a，编号基于aav-2的vp1。
195.102.项87-97任一项的试剂盒，其中所述aav衣壳包含氨基酸取代k532a，编号基于aav-2的vp1。
196.103.项87-94任一项的试剂盒，其中所述一个氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号，或所述一个氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。
197.104.项103的试剂盒，其中所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。
198.105.项103或104的试剂盒，其中所述一个氨基酸取代包括位置r485、r488、k528、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号，或所述一个氨基酸取代包括位置r485、r488、k528或r533处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
199.106.项103至105任一项的试剂盒，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。
200.107.项103至106任一项的试剂盒，其中一个氨基酸取代包含r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。
201.108.项87-107任一项的试剂盒，其中所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。
202.109.项87-108任一项的试剂盒，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：抗氧化剂、神经营养因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。
203.110.项87-109任一项的试剂盒，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：prph2、rpe65、aipl1、gucy2d、lca5、crx、cep290、myo 7a、clarin、abca4、rdh12、impdh1、crb1、lrat、nmnat1、tulp1、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3、gnat2、gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo、bcl2、bcl-x、nfκb、内皮他汀、血管他汀、sflt、spdgf-r、il10、抗-il17、sil17r、il1-ra、抗-tgfβ、stnf-r i、stnf-r ii和il4。
204.111.项87-108任一项的试剂盒，其中所述异源核酸编码治疗性核酸。
205.112.项111的试剂盒，其中所述治疗性核酸是sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核酶或脱氧核酶。
206.113.项87-112任一项的试剂盒，其中所述异源核酸处于在视网膜中表达的启动子序列的控制下。
207.114.项87-113任一项的试剂盒，其中所述异源核酸可操作地连接至适于治疗性多肽或治疗性核酸在一个或多个视网膜细胞类型中表达的启动子。
208.115.项114的试剂盒，其中所述视网膜细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、muller细胞和/或神经节细胞。
209.116.项114的试剂盒，其中所述视网膜细胞是感光细胞。
210.117.项114-116任一项的试剂盒，其中所述启动子是视紫红激酶(rk)启动子、视蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。
211.118.项87-117任一项的试剂盒，其中所述个体是人。
212.119.项118的试剂盒，其中所述异源核酸用于治疗选自下组的眼部病症：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇)、先天性全色盲、斯塔加特氏病、贝斯特氏病、doyne氏病、锥体营养不良、视网膜色素变性、x连锁视网膜劈裂症、usher氏综合征、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性amd、糖尿病性黄斑病变、增生性糖尿病性视网膜病(pdr)、囊样黄斑水肿、中心性浆液性视网膜病、视网膜脱落、眼内炎、青光眼和后葡萄膜炎。
213.120.项118的试剂盒，其中所述异源核酸用于治疗选自下组的眼部病症：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇)、斯塔加特氏病、视网膜色素变性、usher氏综合征和年龄相关性黄斑变性。
214.121.项87-120任一项的试剂盒，其中所述raav载体是自身互补的raav载体。
215.122.项121的试剂盒，其中所述载体包含编码异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。
216.123.项122的试剂盒，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。
217.124.项87-123任一项的试剂盒，其进一步包含用于视网膜下递送raav颗粒的组合物的装置。
218.125.项87-124任一项的试剂盒，其进一步包含用于视网膜下递送raav颗粒的组合物的说明书。
219.126.一种用于将异源核酸递送至个体的中枢神经系统(cns)的方法，其包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于所述个体的cns，其中所述raav颗粒包含
220.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
221.b)raav载体，其包含所述异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
222.127.一种与用包含野生型衣壳的raav转导细胞相比改进个体的中枢神经系统(cns)中细胞的raav转导的方法，该方法包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于所述个体的cns，其中所述raav颗粒包含
223.a)包含raav衣壳蛋白的raav衣壳，所述raav衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
224.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
225.128.一种用于改进异源核酸在个体的中枢神经系统(cns)中的表达的方法，该方法包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于所述个体的cns，其中所述raav颗粒包含
226.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
227.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
228.129.一种治疗个体的中枢神经系统(cns)病症的方法，其包括将有效量的包含raav颗粒的组合物施用于所述个体的cns，其中所述raav颗粒包含
229.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
230.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复。
231.130.项126-129任一项的方法，其中所述异源核酸以增加的表达水平表达，所述增加是与包含参考raav衣壳的raav颗粒的异源核酸表达水平相比。
232.131.项126-130任一项的方法，其中所述raav颗粒导致与包含参考raav衣壳的raav颗粒相比减少的神经性炎症。
233.132.项126-131任一项的方法，其中所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳，或aavrh10衣壳。
234.133.项126-132任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合任选地减少至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约100％。
235.134.项126-133任一项的方法，其中所述施用包括直接脊髓注射、颅内和/或脑内施用。
236.135.项134的方法，其中所述脑内施用位于选自下组的部位：大脑、髓质、脑桥、小脑、颅内腔、围绕脑的脑膜、硬脑膜、蛛网膜、软脑膜、围绕脑的蛛网膜下腔的脑脊液(csf)、小脑的深部小脑核、大脑的脑室系统、蛛网膜下腔、纹状体、皮层、隔膜、丘脑、下丘脑和脑的实质。
237.136.项126-135任一项的方法，其中所述施用是脑室内注射入至少一个大脑侧脑室。
238.137.项126-135任一项的方法，其中所述施用是鞘内注射于颈、胸和/或腰部中。
239.138.项126-135任一项的方法，其中所述施用是纹状体内注射。
240.139.项126-135任一项的方法，其中所述施用为丘脑内注射。
241.140.项126-135任一项的方法，其中所述施用是实质内(intraparenchymal)注射。
242.141.项126-140任一项的方法，其中所述raav颗粒施用于单一部位。
243.142.项135的方法，其中所述raav颗粒通过立体定向递送来递送。
244.143.项135或142的方法，其中所述raav颗粒通过对流增强递送来递送。
245.144.项143的方法，其中所述raav颗粒使用ced递送系统来递送。
246.145.项144的方法，其中所述ced递送系统包含套管和/或泵。
247.146.项145的方法，其中所述套管是抗回流套管或阶梯式套管。
248.147.项145或146的方法，其中所述泵是手动泵。
249.148.项145或146的方法，其中所述泵是渗透泵。
250.149.项145或146的方法，其中所述泵是输液泵。
251.150.项126-149任一项的方法，其中所述异源核酸在cns的一种或多种细胞中表达。
252.151.项150的方法，其中所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞(ependemal cell)，和/或浦肯野细胞(purkinje cell)。
253.152.项126-151任一项的方法，其中所述异源核酸在神经元中表达。
254.153.项152的方法，其中所述异源核酸仅在神经元中表达。
255.154.项126-153任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。
256.155.项154的方法，其中用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。
257.156.项126-155任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。
258.157.项156的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。
259.158.项126-157任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置484、487、527、532、585和/或588处，编号基于aav2的vp1编号。
260.159.项158的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置484、487、527或532处，编号基于aav2的vp1编号。
261.160.项158或159的方法，其中所述编号基于包含seq id no:1的氨基酸序列的aav2的vp1。
262.161.项126-158和160任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r448、r451、r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。
263.162.项126-161任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487、k527和/或k532处的取代，编号基于aav2的vp1。
264.163.项126-162任一项的方法，其中该raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，该raav衣壳蛋白与seq id no:2、4和/或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。
265.164.项126-162任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括r484a、r487a、k527a、k532a、r585a和/或r588a取代，编号基于aav2的vp1。
266.165.项126-162任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484和r487处或位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。
267.166.项126-162任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a取代或r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1。
268.167.项126-162任一项的方法，其中所述aav衣壳包含氨基酸取代r585a和r588a，
编号基于aav2的vp1。
269.168.项126-162任一项的方法，其中所述aav衣壳包含氨基酸取代k532a，编号基于aav2的vp1。
270.169.项126-157任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号，或所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。
271.170.项169的方法，其中所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。
272.171.项169或170的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r485、r488、k528、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号，或所述一个或多个氨基酸取代包括位置r485、r488、k528或r533处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
273.172.项169-171任一项的方法，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。
274.173.项169-172任一项的方法，其中一个氨基酸取代包含r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。
275.174.项126-173任一项的方法，其中所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。
276.175.项126-174任一项的方法，其中所述异源核酸编码cns相关的基因。
277.176.项126-175任一项的方法，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：酶、神经营养因子、在患有cns相关病症的个体中缺乏或突变的多肽、抗氧化剂、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子、α-突触核蛋白、酸性β-葡糖苷酶(gba)、β-半乳糖苷酶-1(glb1)、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(ids)、半乳糖基神经酰胺酶(galc)、甘露糖苷酶、α-d-甘露糖苷酶(man2b1)、β-甘露糖苷酶(manba)、假芳基硫酸酯酶a(arsa)、n-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(gnptab)、酸性鞘磷脂酶(asm)、尼曼-皮克c蛋白(niemann-pick c protein)(npc1)、酸性α-1,4-葡糖苷酶(gaa)、己糖胺酶β亚基、hexb、n-磺基葡糖胺磺基水解酶(mps3a)、n-α-乙酰葡糖胺酶(naglu)、肝素乙酰-coa、α-葡糖胺酶n-乙酰转移酶(mps3c)、n-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶(gns)、α-n-乙酰半乳糖胺酶(naga)、β-葡糖醛酸糖苷酶(gusb)、己糖胺酶α亚基(hexa)、亨廷顿蛋白(htt)、溶酶体酸性脂肪酶(lipa)、天冬氨酰葡糖胺酶、α-半乳糖苷酶a、棕榈酰蛋白硫酯酶、三肽基肽酶、溶酶体跨膜蛋白、半胱氨酸转运蛋白、酸性神经酰胺酶、酸性α-l-岩藻糖苷酶、组织蛋白酶a、α-l-艾杜糖醛酸糖苷酶(alpha-l-iduronidase)、芳基硫酸酯酶b、芳基硫酸酯酶a、n-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯、酸性β-半乳糖苷酶或α-神经酰胺酶(neuramidase)。
278.177.项176的方法，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：神经元细胞凋亡抑制蛋白(naip)、神经生长因子(ngf)、神经胶质来源的生长因子(gdnf)、脑源性生长因子(bdnf)、睫状神经营养因子(cntf)、酪氨酸羟化酶(th)、gtp环化水解酶(gtpch)、氨基酸脱羧酶(aadc)、抗氧化剂，抗血管生成多肽、抗炎多肽，和天冬氨酸酰基酶(aspa)。
279.178.项126-175任一项的方法，其中所述异源核酸编码治疗性核酸。
280.179.项178的方法，其中所述治疗性核酸是sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核
酶或脱氧核酶。
281.180.项126-179任一项的方法，其中所述异源核酸处于在cns的一种或多种细胞中表达的启动子序列的控制下。
282.181.项126-180任一项的方法，其中所述异源核酸处于选自下组的启动子序列的控制下：巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子，rsv ltr，momlv ltr，磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子，猿猴病毒40(sv40)启动子，ck6启动子，甲状腺素转运蛋白启动子(ttr)，tk启动子，四环素响应性启动子(tre)，hbv启动子，haat启动子，lsp启动子，嵌合肝特异性启动子(lsp)，e2f启动子，端粒酶(htert)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β球蛋白启动子(cag)启动子，延伸因子1-α启动子(ef1-α)启动子，人β葡糖醛酸糖苷酶启动子，鸡β-肌动蛋白(cba)启动子，逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(rsv)ltr启动子，二氢叶酸还原酶启动子，和13-肌动蛋白启动子。
283.182.项180的方法，其中所述异源核酸可操作地连接至适于治疗性多肽或治疗性核酸在cns的一种或多种细胞中表达的启动子。
284.183.项180的方法，其中所述cns的一种或多种细胞包含脑的一种或多种细胞。
285.184.项182或183的方法，其中所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。
286.185.项182-184任一项的方法，其中所述cns的细胞是神经元。
287.186.项126-185任一项的方法，其中所述raav载体是自身互补的raav载体。
288.187.项186的方法，其中所述载体包含编码所述异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。
289.188.项187的方法，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。
290.189.项126-188任一项的方法，其中所述个体是人。
291.190.项126-189任一项的方法，其中所述异源核酸编码用于治疗cns的病症的治疗性多肽或治疗性核酸。
292.191.项190的方法，其中所述cns的病症是溶酶体贮积病(lsd)、亨廷顿氏病(huntington's disease)、癫痫、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、中风、皮质基底变性(corticobasal degeneration)(cbd)、皮质基底神经节变性(cbgd)、额颞叶痴呆(ftd)、多系统萎缩症(msa)、进行性核上麻痹(psp)或脑癌。
293.192.项191的方法，其中所述病症是选自下组的溶酶体贮积病：天冬氨酰葡糖胺尿症(aspartylglusoaminuria)、法布里病(fabry)、婴儿巴藤病(batten disease)(cnl1)、经典婴儿后期巴藤病(cnl2)、幼年巴藤病(cnl3)、巴藤病形式cnl4、巴藤病形式cnl5、巴藤病形式cnl6、巴藤病形式cnl7、巴藤病形式cnl8、胱氨酸贮积症、法伯氏病(farber)、岩藻糖苷贮积症、半乳糖苷贮积症(galactosidosialidosis)、戈谢病(gaucher disease)1型、戈谢病2型、戈谢病3型、gm1神经节苷脂贮积症、亨特病(hunter disease)、克拉伯病(krabbe disease)、α甘露糖苷贮积症、β甘露糖苷贮积症、马-拉病(maroteaux-lamy)、异染性脑白质营养不良病、穆尔丘病(morquio)a、穆尔丘病b、粘脂贮积病ii/iii、尼曼-皮克病a、尼曼-皮克病b、尼曼-皮克病c、蓬佩病(pompe disease)、桑德霍夫病(sandhoff disease)、圣菲利
柏氏症a(sanfillipo a disease)、圣菲利柏氏症b、圣菲利柏氏症c、圣菲利柏氏症d、辛德勒病(schindler disease)、辛德勒-神崎病(schindler-kanzaki)、涎酸贮积症、史莱氏症(sly disease)、泰-萨二氏病(tay-sachs disease)和沃尔曼病(wolman disease)。
294.193.项191的方法，其中所述cns的病症为亨廷顿氏病或帕金森氏病。
295.194.一种在个体中治疗亨廷顿氏病的方法，其包括将有效量的包含重组腺相关病毒(raav)颗粒的组合物施用于所述个体的纹状体，其中所述raav颗粒包含
296.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
297.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复。
298.195.项194的方法，其中所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。
299.196.项195的方法，其中所述治疗性多肽是亨廷顿蛋白多肽或其片段。
300.197.项195的方法，其中所述治疗性核酸包含针对亨廷顿蛋白的rnai。
301.198.项197的方法，其中所述rnai是mirna。
302.199.一种治疗个体中的帕金森氏病的方法，其包括将有效量的包含重组腺相关病毒(raav)颗粒的组合物施用于所述个体的纹状体，其中所述raav颗粒包含
303.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
304.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复。
305.200.项199的方法，其中所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。
306.201.项200的方法，其中所述治疗性多肽为th、gtpcii、gdnf、bdnf和/或aadc；或其片段。
307.202.项200或项201的方法，其中所述治疗性多肽是aadc或其片段。
308.203.项194-202任一项的方法，其中所述异源核酸以增加的表达水平表达，所述增加是与包含参考raav衣壳的raav颗粒的异源核酸的表达水平相比。
309.204.项194-203任一项的方法，其中所述raav颗粒导致与包含参考raav衣壳的raav颗粒相比减少的神经性炎症。
310.205.项194-204任一项的方法，其中所述raav颗粒包含aav血清型2(aav2)衣壳。
311.206.项194-205任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代减少所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合或增加中枢神经系统中细胞的转导。
312.207.项206的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合减少约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％，或者将中枢神经系统中细胞的转导增加约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。
313.208.项194-207任一项的方法，其中所述raav颗粒通过立体定向递送来递送。
314.209.项194-207任一项的方法，其中所述raav颗粒通过对流增强递送来递送。
315.210.项209的方法，其中所述raav颗粒使用ced递送系统来施用。
316.211.项210的方法，其中所述ced递送系统包含套管和/或泵。
317.212.项211的方法，其中所述套管是抗回流套管或阶梯式套管。
318.213.项211或212的方法，其中所述泵是手动泵。
319.214.项211或212的方法，其中所述泵是渗透泵。
320.215.项211或212的方法，其中所述泵是输液泵。
321.216.项194-215任一项的方法，其中该异源核酸在该cns的一种或多种细胞中表达。
322.217.项216的方法，其中所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。
323.218.项194-217任一项的方法，其中所述异源核酸在神经元中表达。
324.219.项218的方法，其中所述异源核酸仅在神经元中表达。
325.220.项194-219任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。
326.221.项220的方法，其中用疏水性氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。
327.222.项194-221任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。
328.223.项222的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。
329.224.项194-223任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于484、487、527、532、585和/或588处，编号基于aav2的vp1编号。
330.225.项224的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置484、487、527或532处，编号基于aav2的vp1编号。
331.226.项224或225的方法，其中所述编号基于包含seq id no:1的氨基酸序列的aav2的vp1。
332.227.项194-224和226任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。
333.228.项194-227任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487和/或k532处的取代，编号基于aav2的vp1。
334.229.项194-228任一项的方法，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与seq id no:2、4和/或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。
335.230.项194-228任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484和r487处的取代，编号基于aav2的vp1。
336.231.项194-228任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。
337.232.项194-228任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a取代，编号基于aav2的vp1。
338.233.项194-228任一项的方法，其中所述aav衣壳包含氨基酸取代r585a和r588a，编号基于aav2的vp1。
339.234.项194-228任一项的方法，其中所述aav衣壳包含氨基酸取代k532a，编号基于aav2的vp1。
340.235.项194-223任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号，或所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。
341.236.项235的方法，其中所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。
342.237.项235或236的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r485、r488、k528、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号，或所述一个或多个氨基酸取代包括位置r485、r488、k528或r533处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
343.238.项235-237任一项的方法，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述raav衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。
344.239.项235-238任一项的方法，其中一个氨基酸取代包含r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。
345.240.项194-239任一项的方法，其中所述异源核酸处于在cns的一种或多种细胞中表达的启动子序列的控制下。
346.241.项194-239任一项的方法，其中所述异源核酸处于选自下组的启动子序列的控制下：巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子，rsv ltr，momlv ltr，磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子，猿猴病毒40(sv40)启动子，ck6启动子，甲状腺素转运蛋白启动子(ttr)，tk启动子，四环素响应性启动子(tre)，hbv启动子，haat启动子，lsp启动子，嵌合肝特异性启动子(lsp)，e2f启动子，端粒酶(htert)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β球蛋白启动子(cag)启动子，延伸因子1-α启动子(ef1-α)启动子，人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子，鸡β-肌动蛋白(cba)启动子，逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(rsv)ltr启动子，二氢叶酸还原酶启动子，和13-肌动蛋白启动子。
347.242.项240的方法，其中所述异源核酸可操作地连接至适于治疗性多肽或治疗性核酸在cns的一种或多种细胞中表达的启动子。
348.243.项240的方法，其中所述cns的一种或多种细胞包含脑的一种或多种细胞。
349.244.项242或项243的方法，其中所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞和/或浦肯野细胞(purkinje cell)。
350.245.项243的方法，其中所述脑的细胞是神经元。
351.246.项194-245任一项的方法，其中所述raav载体是自身互补的raav载体。
352.247.项246的方法，其中所述载体包含编码所述异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。
353.248.项247的方法，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。
354.249.项37-46和190-248任一项的方法，其中所述个体是人。
355.250.一种用于项1-46和126-249任一项的方法的试剂盒，其包含重组腺相关病毒(raav)颗粒，其中所述raav颗粒包含
356.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
357.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
358.251.一种用于将异源核酸递送至个体的中枢神经系统(cns)的试剂盒，其包含含有重组腺相关病毒(raav)颗粒的组合物，其中所述raav颗粒包含
359.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
360.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
361.252.一种用于在个体中治疗中枢神经系统(cns)病症的试剂盒，其包含含有重组腺相关病毒(raav)颗粒的组合物，其中所述raav颗粒包含
362.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
363.b)raav载体，其包含用于治疗cns病症的异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
364.253.项251或252的试剂盒，其中所述cns病症是亨廷顿氏病。
365.254.项251-253任一项的试剂盒，其中所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。
366.255.项254的试剂盒，其中所述治疗性多肽是亨廷顿蛋白多肽或其片段。
367.256.项254的试剂盒，其中所述治疗性核酸包含针对亨廷顿蛋白的rnai。
368.257.项256的试剂盒，其中所述rnai是mirna。
369.258.项251或252的试剂盒，其中所述cns病症是帕金森氏病。
370.259.项258的试剂盒，其中所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。
371.260.项259的试剂盒，其中所述治疗性多肽是th、gtpcii、gdnf、bdnf和/或aadc；或其片段。
372.261.项259或项260的试剂盒，其中所述治疗性多肽是aadc或其片段。
373.262.一种重组腺相关病毒(raav)颗粒，其用于项1-46和126-249任一项的方法。
374.263.一种重组腺相关病毒(raav)颗粒，其用于项1-46任一项的方法。
375.264.一种重组腺相关病毒(raav)颗粒，其用于项126-249任一项的方法。
376.265.一种重组腺相关病毒(raav)颗粒，其用于治疗个体中的亨廷顿氏病或帕金森氏病，其中所述raav颗粒包含
377.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
378.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复，
379.其中所述raav颗粒经配制用于递送至纹状体。
380.266.一种重组腺相关病毒(raav)颗粒，其用于治疗个体中的亨廷顿氏病或帕金森氏病，其中所述raav颗粒包含
381.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
382.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复，
383.其中所述raav颗粒经配制用于单一部位递送。
384.267.项250-261任一项的试剂盒或项262-266任一项的raav颗粒，其中所述异源核酸以增加的表达水平表达，所述增加是与包含参考raav衣壳的raav颗粒的异源核酸的表达水平相比。
385.268.项250-261和267任一项的试剂盒或项262-267任一项的raav颗粒，其中所述raav颗粒导致与包含参考raav衣壳的raav颗粒相比减少的神经性炎症。
386.269.项250-261、267和268任一项的试剂盒或项262-268任一项的raav颗粒，其中所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳或aavrh10衣壳。
387.270.项250-261和267-269任一项的试剂盒或项262-269任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代降低所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合或增加中枢神经系统中细胞的转导。
388.271.项270的试剂盒或raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约100％，或将该细胞的转导增加至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约100％。
389.272.项250-261和267-271任一项的试剂盒或项262-271任一项的raav颗粒，其中所述异源核酸在cns的一种或多种细胞中表达。
390.273.项272的试剂盒或raav颗粒，其中所述cns的一种或多种细胞为少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。
391.274.项250-261和267-273任一项的试剂盒或项262-273任一项的raav颗粒，其中所述异源核酸在神经元中表达。
392.275.项274的试剂盒或raav颗粒，其中所述异源核酸仅在神经元中表达。
393.276.项250-261和267-275任一项的试剂盒或项262-275任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。
394.277.项276的试剂盒或raav颗粒，其中用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。
395.278.项250-261和267-277任一项的试剂盒或项262-277任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。
396.279.项278的试剂盒或raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。
397.280.项250-261和267-279任一项的试剂盒或项262-279任一项的raav颗粒，其中
所述一个或多个氨基酸取代位于448、451、484、487、527、532、585和/或588处，编号基于aav2的vp1编号。
398.281.项280的试剂盒或raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置484、487或532处，编号基于aav2的vp1编号。
399.282.项280或281的试剂盒或raav颗粒，其中所述编号基于包含seq id no:1的氨基酸序列的aav2的vp1。
400.283.项250-261和267-280和282任一项的试剂盒或项262-280和282任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。
401.284.项250-261和267-283任一项的试剂盒或项262-283任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484、r487和/或k532处的取代，编号基于aav2的vp1。
402.285.项250-261和267-284任一项的试剂盒或项262-284任一项的raav颗粒，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与seq id no:2、4和/或6具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。
403.286.项250-261和267-284任一项的试剂盒或项262-284任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r484和r487处的取代，编号基于aav2的vp1。
404.287.项250-261和267-284任一项的试剂盒或项262-284任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r585和r588处的取代，编号基于aav2的vp1。
405.288.项250-261和267-284任一项的试剂盒或项262-284任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括r484a和r487a取代或r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1。
406.289.项114-261和267-284任一项的试剂盒或项262-149任一项的raav颗粒，其中所述aav衣壳包括氨基酸取代r585a和r588a，编号基于aav2的vp1。
407.290.项250-261和267-284任一项的试剂盒或项262-284任一项的raav颗粒，其中所述aav衣壳包括氨基酸取代k532a，编号基于aav2的vp1。
408.291.项250-261和267-279任一项的试剂盒或项262-279任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528、533或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号，或所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、528或533处，编号基于aavrh8r的vp1编号。
409.292.项291的试剂盒或raav颗粒，其中所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。
410.293.项291或292的试剂盒或raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置r485、r488、k528、r533或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号，或所述一个或多个氨基酸取代包括位置r485、r488、k528或r533处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
411.294.项291-293任一项的试剂盒或raav颗粒，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与seq id no:11具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。
412.295.项291-294任一项的试剂盒或raav颗粒，其中一个氨基酸取代包含r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1。
413.296.项250-261和267-295任一项的试剂盒或项262-295任一项的raav颗粒，其中所述异源核酸处于在cns的一种或多种细胞中表达的启动子序列的控制下。
414.297.项250-261和267-295任一项的试剂盒或项262-295任一项的raav颗粒，其中所述异源核酸处于选自下组的启动子序列的控制下：巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子，rsv ltr，momlv ltr，磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子，猿猴病毒40(sv40)启动子，ck6启动子，甲状腺素转运蛋白启动子(ttr)，tk启动子，四环素响应性启动子(tre)，hbv启动子，haat启动子，lsp启动子，嵌合肝特异性启动子(lsp)，e2f启动子，端粒酶(htert)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β球蛋白启动子(cag)启动子，延伸因子1-α启动子(ef1-α)启动子，人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子，鸡β-肌动蛋白(cba)启动子，逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(rsv)ltr启动子，二氢叶酸还原酶启动子，和13-肌动蛋白启动子。
415.298.项296的试剂盒或raav颗粒，其中所述异源核酸可操作地连接至适于治疗性多肽或治疗性核酸在cns的一种或多种细胞中表达的启动子。
416.299.项296的试剂盒或raav颗粒，其中所述cns的一种或多种细胞包含脑的一种或多种细胞。
417.300.项298或项299的试剂盒或raav颗粒，其中所述cns的一种或多种细胞是少突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元、脑实质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞，和/或浦肯野细胞。
418.301.项299的试剂盒或raav颗粒，其中所述脑的细胞是神经元。
419.302.项250-127和267-301任一项的试剂盒或项262-301任一项的raav颗粒，其中所述raav载体是自身互补的raav载体。
420.303.项302的试剂盒或raav颗粒，其中所述载体包含编码所述异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。
421.304.项303的试剂盒或raav颗粒，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。
422.305.项250-261和267-304任一项的试剂盒或项262-304任一项的raav颗粒，其中所述个体是人。
423.306.项250-261和267-305任一项的试剂盒或项262-305任一项的raav颗粒，其中所述raav颗粒在组合物中。
424.307.项306的试剂盒或raav颗粒，其中所述组合物包含缓冲液和/或药学上可接受的赋形剂。
425.308.项250-261和267-307任一项的试剂盒或项262-307任一项的raav颗粒，其进一步包含用于将raav颗粒的组合物递送至cns、任选地递送至纹状体的说明。
426.309.项250-261和267-308任一项的试剂盒或项262-308任一项的raav颗粒，其进一步包含用于将raav颗粒的组合物递送至cns中的单一部位的说明。
427.310.一种包含aavrh8r衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aavrh8r衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个
或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。
428.311.项310的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代与包含野生型aavrh8r衣壳蛋白的aav颗粒相比将所述raav颗粒对于眼部或中枢神经系统中的细胞的转导效率增加约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。
429.312.项310或311的raav颗粒，其中一个氨基酸取代位于位置586处，编号基于aavrh8r的vp1编号。
430.313.项312的raav颗粒，其中所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。
431.314.项312或313的raav颗粒，其中一个氨基酸取代包括位于位置a586处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
432.315.项312-314任一项的raav颗粒，其中一个氨基酸取代包括a586r取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
433.316.项310-315任一项的raav颗粒，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与seq id no:10具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。
434.317.一种增加包含aavrh8r衣壳蛋白的raav颗粒的转导效率的方法，其包括将一个或多个氨基酸取代在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置导入所述衣壳蛋白，编号基于aav2的vp1编号，其中所述一个或多个氨基酸取代与包含野生型aavrh8r衣壳蛋白的aav颗粒相比增加该raav颗粒至眼部或中枢神经系统中的细胞的转导效率。
435.318.项317的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒至该细胞的转导效率增加至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约100％。
436.319.项317或318的方法，其中一个氨基酸取代位于位置586处，编号基于aavrh8r的vp1编号。
437.320.项317-319任一项的方法，其中所述aavrh8r的vp1包含seq id no:9的氨基酸序列。
438.321.项317-320任一项的方法，其中一个氨基酸取代包括位置a586处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
439.322.项317-321任一项的方法，其中一个氨基酸取代包括a586r取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
440.323.项317-322任一项的方法，其中所述raav颗粒包含一个或多个raav衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与seq id no:10具有至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或100％序列同一性。
441.324.一种包含aav1衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aav1衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。
442.325.项324的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代与包含野生型aav1衣壳
蛋白的aav颗粒相比将所述raav颗粒对于眼部或中枢神经系统中的细胞的转导效率增加约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。
443.326.项324或325的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav1的vp1编号。
444.327.项326的raav颗粒，其中所述编号基于包含seq id no:12的氨基酸序列的aav1的vp1。
445.328.项326或327的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或t589处的取代，编号基于aav1的vp1编号。
446.329.项326-328任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包含s586r取代，编号基于aav1的vp1。
447.330.项326-329任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包含t589r取代，编号基于aav1的vp1。
448.331.一种包含aav6衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aav6衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。
449.332.项331的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代与包含野生型aav6衣壳蛋白的aav颗粒相比将所述raav颗粒对于眼部或中枢神经系统中的细胞的转导效率增加约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。
450.333.项331或332的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav6的vp1编号。
451.334.项333的raav颗粒，其中所述编号基于包含seq id no:13氨基酸序列的aav6的vp1。
452.335.项333或334的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或t589处的取代，编号基于aav6的vp1编号。
453.336.项333-335任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包含s586r取代，编号基于aav6的vp1。
454.337.项333-336任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包含t589r取代，编号基于aav6的vp1。
455.338.一种包含aav8衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aav8衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。
456.339.项338的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代与包含野生型aav8衣壳蛋白的aav颗粒相比将该raav颗粒对于眼部或中枢神经系统中的细胞的转导效率增加约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。
457.340.项338或339的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置588和/或591处，编号基于aav8的vp1编号。
458.341.项338-340任一项的raav颗粒，其中所述编号基于包含seq id no:14氨基酸序列的aav8的vp1。
459.342.项340或341的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置q588和/
或t591处的取代，编号基于aav8的vp1编号。
460.343.项340-342任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括q588r取代，编号基于aav8的vp1。
461.344.项340-343任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t591r取代，编号基于aav8的vp1。
462.345.一种包含aav9衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aav9衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。
463.346.项345的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代与包含野生型aav9衣壳蛋白的aav颗粒相比将该raav颗粒对于眼部或中枢神经系统中的细胞的转导效率增加约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。
464.347.项345或346的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav9的vp1编号。
465.348.项347的raav颗粒，其中所述编号基于包含seq id no:15的氨基酸序列的aav9的vp1。
466.349.项347或348的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或a589处的取代，编号基于aav9的vp1编号。
467.350.项347-349任一项的raav颗粒，其中该一个或多个氨基酸取代包含s586r取代，编号基于aav9的vp1。
468.351.项347-350任一项的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包含a589r取代，编号基于aav9的vp1。
469.352.一种包含aavrh10衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aavrh10衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。
470.353.项352的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代与包含野生型aavrh10衣壳蛋白的aav颗粒相比将该raav颗粒对于眼部或中枢神经系统中的细胞的转导效率增加约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。
471.354.项352或353的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置588和/或591处，编号基于aavrh10的vp1编号。
472.355.项354的raav颗粒，其中所述编号基于包含seq id no:16的氨基酸序列的aavrh10的vp1。
473.356.项354或355的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置q588和/或a591处的取代，编号基于aavrh10的vp1编号。
474.357.项354-356任一项的raav颗粒，其中该一个或多个氨基酸取代包括q588r取代，编号基于aavrh10的vp1。
475.358.项354-357任一项的raav颗粒，其中该一个或多个氨基酸取代包括a591r取代，编号基于aavrh10的vp1。
476.359.项1-46和126-249任一项的方法，其中所述raav颗粒包含aav1、aav6或aav9衣壳，且其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、533、586和/或589处，编号基于
aav1、aav6或aav9的vp1编号；和/或其中所述raav颗粒包含aav8或aavrh10衣壳，且其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置487、490、535、588和/或591处，编号基于aav8或aavrh10的vp1编号。
477.360.项47-86任一项的系统，其中所述raav颗粒包含aav1、aav6或aav9衣壳，且其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、533、586和/或589处，编号基于aav1、aav6或aav9的vp1编号；和/或其中所述raav颗粒包含aav8或aavrh10衣壳，且其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置487、490、535、588和/或591处，编号基于aav8或aavrh10的vp1编号。
478.361.项87-125和250-261任一项的试剂盒，其中所述raav颗粒包含aav1、aav6或aav9衣壳，且其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、533、586和/或589处，编号基于aav1、aav6或aav9的vp1编号；和/或其中所述raav颗粒包含aav8或aavrh10衣壳，且其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置487、490、535、588和/或591处，编号基于aav8或aavrh10的vp1编号。
479.362.项262-316任一项的raav颗粒，其中所述raav颗粒包含aav1、aav6或aav9衣壳，且其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置485、488、533、586和/或589处，编号基于aav1、aav6或aav9的vp1编号；和/或其中所述raav颗粒包含aav8或aavrh10衣壳，且其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置487、490、535、588和/或591处，编号基于aav8或aavrh10的vp1编号。
480.363.一种包含aav1、aav6或aav9衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于位置485、488、或533处，编号基于aav1、aav6或aav9的vp1编号。
481.364.一种包含aav8或aavrh10衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于位置487、490或535处，编号基于aav8或aavrh10的vp1编号。
482.365.一种用于将异源核酸递送至个体的视网膜的方法，其包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒玻璃体内施用于所述个体，其中所述raav颗粒包含
483.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
484.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
485.366.一种用于在将raav颗粒经玻璃体内递送至个体的眼部后改进细胞的raav转导的方法，所述改进是与用包含野生型衣壳的raav转导细胞相比，该方法包括将一个或多个氨基酸取代并入aav衣壳蛋白中，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号；其中所述raav颗粒包含该raav衣壳蛋白和含有异源核酸和至少一个aav末端重复的raav载体。
486.367.一种用于在将raav颗粒经玻璃体内递送至个体眼部之后改进异源核酸的表达的方法，该方法包括将一个或多个氨基酸取代并入aav衣壳蛋白中，所述氨基酸取代位于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号；其中所述raav颗粒包含该
raav衣壳蛋白和含有异源核酸和至少一个aav末端重复的raav载体。
487.368.一种治疗个体中眼部病症的方法，其包括将包含raav颗粒的组合物玻璃体内递送至个体的视网膜，其中所述raav颗粒包含
488.a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
489.b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复。
490.369.项365-368任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代改变所述raav衣壳蛋白上的电荷。
491.370.项365-369任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代使所述raav颗粒至眼中细胞的转导效率增加至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约100％。
492.371.项365-370任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。
493.372.项371的方法，其中所述带正电荷的氨基酸残基代替疏水性氨基酸残基。
494.373.项365-372任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基的取代。
495.374.项365-373任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基对丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸残基的取代。
496.375.项365-374任一项的方法，其中所述raav颗粒包含aav血清型rh8r(aavrh8r)衣壳。
497.376.项375的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。
498.377.项376的方法，其中所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。
499.378.项375-377任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置a586和/或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
500.379.项375-378任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括a586r或a586k取代，编号基于aavrh8r的vp1。
501.380.项375-379任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aavrh8r的vp1。
502.381.项365-374任一项的方法，其中所述raav颗粒包含aav血清型1(aav1)衣壳。
503.382.项381的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav1的vp1编号。
504.383.项382的方法，其中所述编号基于包含seq id no:12的氨基酸序列的aav1的vp1。
505.384.项381-383任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或t589处的取代，编号基于aav1的vp1编号。
506.385.项381-384任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或
s586k取代，编号基于aav1的vp1。
507.386.项381-385任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aav1的vp1。
508.387.项365-374任一项的方法，其中所述raav颗粒包含aav血清型6(aav6)衣壳。
509.388.项387的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav6的vp1编号。
510.389.项388的方法，其中所述编号基于包含seq id no:13的氨基酸序列的aav6的vp1。
511.390.项387-389任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或t589处的取代，编号基于aav6的vp1编号。
512.391.项387-390任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav6的vp1。
513.392.项387-391任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aav6的vp1。
514.393.项365-374任一项的方法，其中所述raav颗粒包含aav血清型8(aav8)衣壳。
515.394.项393的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置588和/或591处，编号基于aav8的vp1编号。
516.395.项394的方法，其中所述编号基于包含seq id no:14的氨基酸序列的aav8的vp1。
517.396.项393-395任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置q588和/或t591处的取代，编号基于aav8的vp1编号。
518.397.项393-396任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括q588r或q588k取代，编号基于aav8的vp1。
519.398.项393-397任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t591r或t591k取代，编号基于aav8的vp1。
520.399.项365-374任一项的方法，其中所述raav颗粒包含aav血清型9(aav9)衣壳。
521.400.项399的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav9的vp1编号。
522.401.项400的方法，其中所述编号基于包含seq id no:15的氨基酸序列的aav9的vp1。
523.402.项399-401任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或a589处的取代，编号基于aav9的vp1编号。
524.403.项399-402任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav9的vp1。
525.404.项399-403任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括a589r或a589k取代，编号基于aav9的vp1。
526.405.项365-374任一项的方法，其中所述raav颗粒包含aav血清型rh10(aavrh10)衣壳。
527.406.项405的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置588和/或591处，编
号基于aavrh10的vp1编号。
528.407.项406的方法，其中所述编号基于包含seq id no:16的氨基酸序列的aavrh10的vp1。
529.408.项405-407任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置q588和/或a591处的取代，编号基于aavrh10的vp1编号。
530.409.项405-408任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括q588r或q588k取代，编号基于aavrh10的vp1。
531.410.项405-409任一项的方法，其中所述一个或多个氨基酸取代包括a591r或a591k取代，编号基于aavrh10的vp1。
532.411.项365-410任一项的方法，其中所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。
533.412.项365-411任一项的方法，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：抗氧化剂、神经营养因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。
534.413.项365-412任一项的方法，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：prph2、rpe65、aipl1、gucy2d、lca5、crx、cep290、myo 7a、clarin、abca4、rdh12、impdh1、crb1、lrat、nmnat1、tulp1、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3、gnat2、gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo、bcl2、bcl-x、nfκb、内皮他汀、血管他汀、sflt、spdgf-r、il10、抗-il17、sil17r、il1-ra、抗-tgfβ、stnf-r i、stnf-r ii和il4。
535.414.项365-411任一项的方法，其中所述异源核酸编码治疗性核酸。
536.415.项414的方法，其中所述治疗性核酸是sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核酶或脱氧核酶。
537.416.项365-415任一项的方法，其中所述异源核酸处于在视网膜中表达的启动子序列的控制下。
538.417.项365-416任一项的方法，其中所述异源核酸可操作地连接至适于所述治疗性多肽或治疗性核酸在一个或多个视网膜细胞类型中表达的启动子。
539.418.项417的方法，其中所述视网膜细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、muller细胞和/或神经节细胞。
540.419.项417或418的方法，其中所述视网膜细胞是感光细胞。
541.420.项416-419任一项的方法，其中所述启动子是视紫红激酶(rk)启动子、视蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。
542.421.项365-420任一项的方法，其中所述个体是人。
543.422.项421的方法，其中所述异源核酸用于治疗选自下组的眼部病症：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇)、先天性全色盲、斯塔加特氏病、贝斯特氏病、doyne氏病、锥体营养不良、视网膜色素变性、x连锁视网膜劈裂症、usher氏综合征、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性amd、糖尿病性黄斑病变、增生性糖尿病性视网膜病(pdr)、囊样黄斑水肿、中心性浆液性视网膜病、视网膜脱落、眼内炎、青光眼和后葡萄膜炎。
544.423.项365-422任一项的方法，其中所述raav载体是自身互补的raav载体。
545.424.项423的方法，其中所述载体包含编码所述异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长
度的大部分形成链内碱基对。
546.425.项424的方法，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。
547.426.项365-425任一项的方法，其中所述raav颗粒在药物组合物中。
548.427.项426的方法，其中所述药物组合物中颗粒的浓度为约1x 106drp/ml至约1x 10
14
drp/ml。
549.428.项426或427的方法，其中所述raav颗粒的药物组合物对于治疗个体的视觉功能是有效的。
550.429.项428的方法，其中视觉功能通过微视野检查法、暗适应视野检查法、视觉活动性评估、视敏度、erg、或阅读评估来评价。
551.430.项428或429的方法，其中所述方法导致个体的视觉功能的改进。
552.431.项365-430任一项的方法，其中所述方法导致预防由于眼部病症的进展所致的人的视觉功能衰退或是减缓所述衰退的进展。
553.432.一种用于玻璃体内递送载体至个体眼部的系统，其包含
554.a)包含有效量的raav颗粒的组合物，其中
555.i)raav颗粒的衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，及
556.ii)所述载体包含编码治疗性多肽或治疗性rna的异源核酸和至少一个aav末端重复；和
557.b)用于玻璃体内递送所述raav的装置。
558.433.项432的系统，其中所述装置包含细孔套管和注射器，其中所述细孔套管是27至45号。
559.434.项433的系统，其中所述raav颗粒的组合物容纳于注射器内。
560.435.项433或434的系统，其中所述套管附接至所述注射器。
561.436.项432-435任一项的系统，其中所述组合物中颗粒的浓度为约1x106drp/ml至约1x 10
14
drp/ml。
562.437.项432-436任一项的系统，其中所述raav颗粒包含aav1衣壳、aav2衣壳、aav3衣壳、aav6衣壳、aav8衣壳、aavrh8r衣壳、aav9衣壳，或aavrh10衣壳。
563.438.项432-437任一项的系统，其中该一个或多个氨基酸取代改变该raav衣壳蛋白上的电荷。
564.439.项438的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒至眼中细胞的转导效率增加至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约100％。
565.440.项432-439任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。
566.441.项440的系统，其中所述带正电荷的氨基酸残基代替疏水性氨基酸残基。
567.442.项432-441任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基的取代。
568.443.项432-442任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或
赖氨酸残基取代丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸残基。
569.444.项432-443任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。
570.445.项444的系统，其中所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。
571.446.项432-445任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置a586和/或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
572.447.项432-446任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括a586r或a586k取代，编号基于aavrh8r的vp1。
573.448.项432-447任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aavrh8r的vp1。
574.449.项432-448任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav1的vp1编号。
575.450.项449的系统，其中所述编号基于包含seq id no:12的氨基酸序列的aav1的vp1。
576.451.项449或项450的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或t589处的取代，编号基于aav1的vp1编号。
577.452.项449-451任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav1的vp1。
578.453.项449-452任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aav1的vp1。
579.454.项432-448任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav6的vp1编号。
580.455.项454的系统，其中所述编号基于包含seq id no:13的氨基酸序列的aav6的vp1。
581.456.项454或项455的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或t589处的取代，编号基于aav6的vp1编号。
582.457.项454-456任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav6的vp1。
583.458.项454-457任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aav6的vp1。
584.459.项432-448任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置588和/或591处，编号基于aav8的vp1编号。
585.460.项459的系统，其中所述编号基于包含seq id no:14的氨基酸序列的aav8的vp1。
586.461.项459或460的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置q588和/或t591处的取代，编号基于aav8的vp1编号。
587.462.项459-461任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括q588r或q588k取代，编号基于aav8的vp1。
588.463.项459-462任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t591r或t591k取代，编号基于aav8的vp1。
589.464.项432-448任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav9的vp1编号。
590.465.项464的系统，其中所述编号基于包含seq id no:15的氨基酸序列的aav9的vp1。
591.466.项464或465的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或a589处的取代，编号基于aav9的vp1编号。
592.467.项464-466任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav9的vp1。
593.468.项464-467任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括a589r或a589k取代，编号基于aav9的vp1。
594.469.项432-448任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置588和/或591处，编号基于aavrh10的vp1编号。
595.470.项469的系统，其中所述编号基于包含seq id no:16的氨基酸序列的aavrh10的vp1。
596.471.项469或470的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置q588和/或a591处的取代，编号基于aavrh10的vp1编号。
597.472.项469-471任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括q588r或q588k取代，编号基于aavrh10的vp1。
598.473.项469-472任一项的系统，其中所述一个或多个氨基酸取代包括a591r或a591k取代，编号基于aavrh10的vp1。
599.474.项432-473任一项的系统，其中所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。
600.475.项432-474任一项的系统，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：抗氧化剂、神经营养因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。
601.476.项432-475任一项的系统，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：prph2、rpe65、aipl1、gucy2d、lca5、crx、cep290、myo 7a、clarin、abca4、rdh12、impdh1、crb1、lrat、nmnat1、tulp1、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3、gnat2、gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo、bcl2、bcl-x、nfκb、内皮他汀、血管他汀、sflt、spdgf-r、il10、抗-il17、sil17r、il1-ra、抗-tgfβ、stnf-r i、stnf-r ii和il4。
602.477.项432-474任一项的系统，其中所述异源核酸编码治疗性核酸。
603.478.项477的系统，其中所述治疗性核酸是sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核酶或脱氧核酶。
604.479.项432-478任一项的系统，其中所述异源核酸处于在视网膜中表达的启动子序列的控制下。
605.480.项432-479任一项的系统，其中所述异源核酸可操作地连接至适于该治疗性多肽或治疗性核酸在一个或多个视网膜细胞类型中表达的启动子。
606.481.项480的系统，其中所述视网膜细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、muller细胞和/或神经节细胞。
607.482.项481的系统，其中所述视网膜细胞是感光细胞。
608.483.项479-482任一项的系统，其中所述启动子是视紫红激酶(rk)启动子、视蛋白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。
609.484.项432-483任一项的系统，其中所述个体是人。
610.485.项484的系统，其中所述异源核酸用于治疗选自下组的眼部病症：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇)、先天性全色盲、斯塔加特氏病、贝斯特氏病、doyne氏病、锥体营养不良、视网膜色素变性、x连锁视网膜劈裂症、usher氏综合征、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性amd、糖尿病性黄斑病变、增生性糖尿病性视网膜病(pdr)、囊样黄斑水肿、中心性浆液性视网膜病、视网膜脱落、眼内炎、青光眼和后葡萄膜炎。
611.486.项432-485任一项的系统，其中所述raav载体是自身互补的raav载体。
612.487.项486的系统，其中所述载体包含编码所述异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。
613.488.项487的系统，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。
614.489.一种用于项365-431任一项的方法的试剂盒。
615.490.一种用于治疗眼部病症的试剂盒，其包含
616.a)包含raav颗粒的组合物，其中所述raav颗粒包含
617.i)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处或在对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号，及
618.ii)raav载体，其包含用于治疗眼部病症的异源核酸和至少一个aav反向末端重复；和
619.b)适于玻璃体内施用的药物赋形剂，任选地其中所述raav颗粒包含aavrh8r、aav1、aav6、aav8、aav9或aavrh10衣壳。
620.491.项489或490的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代改变所述raav衣壳蛋白上的电荷。
621.492.项491的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒至眼中细胞的转导效率增加至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约100％。
622.493.项489-492任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。
623.494.项493的试剂盒，其中所述带正电荷的氨基酸残基代替疏水性氨基酸残基。
624.495.项489-494任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基的取代。
625.496.项489-495任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括用精氨酸或赖氨酸残基取代丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸残基。
626.497.项489-496任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。
627.498.项497的试剂盒，其中所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。
628.499.项489-498任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置a586和/或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。
629.500.项489-499任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括a586r或a586k取代，编号基于aavrh8r的vp1。
630.501.项489-500任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aavrh8r的vp1。
631.502.项489-496任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav1的vp1编号。
632.503.项502的试剂盒，其中所述编号基于包含seq id no:12的氨基酸序列的aav1的vp1。
633.504.项502或503的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或t589处的取代，编号基于aav1的vp1编号。
634.505.项502-504任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav1的vp1。
635.506.项502-505任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aav1的vp1。
636.507.项489-496任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav6的vp1编号。
637.508.项507的试剂盒，其中所述编号基于包含seq id no:13的氨基酸序列的aav6的vp1。
638.509.项507或508的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或t589处的取代，编号基于aav6的vp1编号。
639.510.项507-509任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav6的vp1。
640.511.项507-510任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aav6的vp1。
641.512.项489-496任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置588和/或591处，编号基于aav8的vp1编号。
642.513.项512的试剂盒，其中所述编号基于包含seq id no:14的氨基酸序列的aav8的vp1。
643.514.项512或513的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置q588和/或t591处的取代，编号基于aav8的vp1编号。
644.515.项512-514任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括q588r或q588k取代，编号基于aav8的vp1。
645.516.项512-515任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括t591r或t591k取代，编号基于aav8的vp1。
646.517.项489-496任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置586
和/或589处，编号基于aav9的vp1编号。
647.518.项517的试剂盒，其中所述编号基于包含seq id no:15的氨基酸序列的aav9的vp1。
648.519.项517或518的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或a589处的取代，编号基于aav9的vp1编号。
649.520.项517-519任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav9的vp1。
650.521.项517-520任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括a589r或a589k取代，编号基于aav9的vp1。
651.522.项489-496任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置588和/或591处，编号基于aavrh10的vp1编号。
652.523.项522的试剂盒，其中所述编号基于包含seq id no:16的氨基酸序列的aavrh10的vp1。
653.524.项522或523的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括位置q588和/或a591处的取代，编号基于aavrh10的vp1编号。
654.525.项522-524任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括q588r或q588k取代，编号基于aavrh10的vp1。
655.526.项522-525任一项的试剂盒，其中所述一个或多个氨基酸取代包括a591r或a591k取代，编号基于aavrh10的vp1。
656.527.项489-526任一项的试剂盒，其中所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。
657.528.项489-527任一项的试剂盒，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：抗氧化剂、神经营养因子、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。
658.529.项489-528任一项的试剂盒，其中所述异源核酸编码选自下组的多肽：prph2、rpe65、aipl1、gucy2d、lca5、crx、cep290、myo 7a、clarin、abca4、rdh12、impdh1、crb1、lrat、nmnat1、tulp1、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3、gnat2、gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo、bcl2、bcl-x、nfκb、内皮他汀、血管他汀、sflt、spdgf-r、il10、抗-il17、sil17r、il1-ra、抗-tgfβ、stnf-r i、stnf-r ii和il4。
659.530.项489-527任一项的试剂盒，其中所述异源核酸编码治疗性核酸。
660.531.项530的试剂盒，其中所述治疗性核酸是sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核酶或脱氧核酶。
661.532.项489-531任一项的试剂盒，其中所述异源核酸处于在视网膜中表达的启动子序列的控制下。
662.533.项489-532任一项的试剂盒，其中所述异源核酸可操作地连接至适于所述治疗性多肽或治疗性核酸在一个或多个视网膜细胞类型中表达的启动子。
663.534.项533的试剂盒，其中所述视网膜细胞是感光细胞、视网膜色素上皮细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、muller细胞和/或神经节细胞。
664.535.项534的试剂盒，其中所述视网膜细胞是感光细胞。
665.536.项532-535任一项的试剂盒，其中所述启动子是视紫红激酶(rk)启动子、视蛋
白启动子、巨细胞病毒(cmv)启动子、鸡β-肌动蛋白(cba)启动子。
666.537.项489-536任一项的试剂盒，其中所述个体是人。
667.538.项537的试剂盒，其中所述异源核酸用于治疗选自下组的眼部病症：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇)、先天性全色盲、斯塔加特氏病、贝斯特氏病、doyne氏病、锥体营养不良、视网膜色素变性、x连锁视网膜劈裂症、usher氏综合征、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性amd、糖尿病性黄斑病变、增生性糖尿病性视网膜病(pdr)、囊样黄斑水肿、中心性浆液性视网膜病、视网膜脱落、眼内炎、青光眼和后葡萄膜炎。
668.539.项538的试剂盒，其中所述异源核酸用于治疗选自下组的眼部病症：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇)、斯塔加特氏病、视网膜色素变性、usher氏综合征和年龄相关性黄斑变性。
669.540.项489-539任一项的试剂盒，其中所述raav载体是自身互补的raav载体。
670.541.项540的试剂盒，其中所述载体包含编码所述异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。
671.542.项541的试剂盒，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列通过突变的aav itr连接，其中所述突变的aav itr包含d区的缺失并包含末端解析序列的突变。
672.543.项489-542任一项的试剂盒，其进一步包含用于玻璃体内递送raav颗粒的组合物的装置。
673.544.项489-543任一项的试剂盒，其进一步包含用于玻璃体内递送aav颗粒的组合物的说明书。
674.545.项422-431任一项的方法或项538-544任一项的试剂盒，其中所述个体是人。
675.546.一种包含aav3衣壳蛋白的raav颗粒，其中所述aav3衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于对应于氨基酸484、487、527、532、585或588的一个或多个位置处，编号基于aav2的vp1编号。
676.547.项546的raav颗粒，其中所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒对于眼部或中枢神经系统中细胞的转导效率与包含野生型aavrh8r衣壳蛋白的aav颗粒相比增加约至少10％，约至少25％，约至少50％，约至少75％，或约至少100％。
677.附图简述
678.图1表示硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合中涉及的衣壳残基和引入以生成aav2 hbko突变体的突变。编号基于vp1氨基酸序列。
679.图2显示与野生型aav2颗粒(aav2 cba-sflt02)相比，用hbko突变体aav2颗粒(aav2 hbko cba-sflt02)观察到的培养物中293细胞的转导的减少。通过在用野生型或hbko突变体aav2颗粒(其携带有使用cba启动子来驱动flt表达的载体)注射后48小时测量细胞培养基中存在的可溶性flt(sflt)的量来测定转导。
680.图3显示与野生型aav2颗粒(aav2 cba-gfp)相比，用hbko突变体aav2颗粒(aav2 hbko cba-gfp)观察到的培养物中293和hela细胞的转导的减少。通过在用野生型或hbko突变体aav2颗粒(其携带有使用cba启动子来驱动egfp表达的载体)的注射后48小时取得的细胞的荧光成像来测定转导。
681.图4a和4b显示玻璃体内(图4a)或视网膜下(图4b)注射野生型aav2或hbko突变体aav2颗粒后所观察到的转导。通过用编码flt的载体转导后的可溶性flt(sflt)的表达来测定转导。对于每个实验指示了注射的载体基因组的数目(108或109vg)。
682.图5显示在玻璃体内注射后hbko突变体aav2颗粒未能转导小鼠眼。给予小鼠玻璃体内注射的野生型(aav2 cba-gfp)或hbko突变体aav2颗粒(aav2 hbko cba-gfp)(其携带使用cba启动子来驱动egfp表达的载体)，并通过荧光显微术将切片进行显像。
683.图6显示在视网膜下注射后hbko突变体aav2颗粒(aav2 cba hbko)与野生型颗粒(aav2 cba)相比引起转导的显著增加。通过在用aav2颗粒(其携带由使用cba启动子来驱动flt表达的载体)注射后可溶性flt(sflt)的表达来测定转导。指示注射的载体基因组的数目(108或109vg)。
684.图7显示与野生型颗粒(aav2 cba-gfp)相比，hbko突变体aav2颗粒(aav2 hbko cba-gfp)在视网膜下注射后引起感光细胞的转导的显著增加(如标记的)。通过在用aav2颗粒(其携带有使用cba启动子来驱动egfp表达载体)转导后gfp表达的荧光成像来测量转导。
685.图8显示与野生型颗粒(aav2 rk)相比，hbko突变体aav2颗粒(aav2 rk hbko)在视网膜下注射后引起感光物的转导的显著增加。通过在用aav2颗粒(其携带有使用视紫红激酶(rk)启动子来驱动flt表达的载体)注射后可溶性flt(sflt)的表达来测定转导。指示注射的载体基因组的数目(108或109vg)。
686.图9a和9b显示与野生型小鼠中的aav2-egfp(图9b)相比，在纹状体内注射aav2hbko-egfp(图9a)后30天小鼠脑中egfp的表达。在每个图面中，egfp的表达通过cba启动子驱动，并使用荧光显微术来显现。
687.图10a和10b显示与yac128 hd小鼠中的aav1-mirna-htt-gfp(图10b)相比，在纹状体内注射aav2hbko-mirna-htt-gfp(图10a)后30天小鼠脑中gfp的表达。所述mirna-htt-gfp载体意指表达靶向人htt的人工mirna和gfp报告蛋白的构建体。在每个图面中，gfp的表达通过cba启动子驱动，并使用荧光显微术以三个不同的放大倍数(4x、10x和20x，如标记的)来显现。
688.图11a显示与未处理的对照相比，注射aav1-mirna-htt和aav2hbko-mirna-htt后30天纹状体小鼠脑穿孔物(brain punches)中人htt mrna水平的qpcr分析。
689.图11b显示与未处理的对照相比，注射aav1-mirna-htt和aav2hbko-mirna-htt后30天皮质小鼠脑穿孔物中人htt蛋白水平的western印迹分析。
690.图12a-12c显示与未处理的对照(图12a)相比，用aav2hbko-mirna-htt-gfp(图12b)或aav1-mirna-htt-gfp(图12c)注射后30天yac128小鼠纹状体中iba1的表达。
691.图13a-13c显示与未处理的对照(图13a)相比，用aav2hbko-mirna-htt-gfp(图13b)或aav1-mirna-htt-gfp(图13c)注射后30天yac128小鼠纹状体中gfp的表达。
692.图14比较了aav2和aavrh8r衣壳之间的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖结合中涉及的衣壳残基。编号基于vp1氨基酸序列。
693.图15显示aav2和aavrh8r在负责aav2的乙酰肝素结合的残基处的氨基酸比对。圈出了aavrh8r精氨酸衣壳修饰的位置。
694.图16a显示与野生型aavrh8r相比，由aavrh8r a586r突变体表现出的hela细胞的改进的体外转导。通过用aavrh8r或aavrh8r精氨酸修饰的载体感染后48小时培养基中的
sflt02来监测转导。
695.图16b显示与野生型aavrh8r相比，由aavrh8r r533a突变体表现出的helarc32细胞的减少的体外转导。通过用aavrh8r或aavrh8r精氨酸修饰的载体感染后48小时培养基中的sflt02来监测转导。
696.图17a-17d显示与野生型aavrh8r相比，由aavrh8r a586r和r533a突变体表现出的体外转导水平。aavrh8r a586r突变体(图17b)显示与野生型aavrh8r(图17a)相比ns1细胞的增加的体外转导。aavrh8r r533a突变体(图17d)显示与野生型aavrh8r(图17c)相比hela细胞的减少的体外转导。通过用aavrh8r或aavrh8r精氨酸修饰的载体感染后48小时细胞中的egfp表达来监测转导。
697.图18a和18b显示由aavrh8r a586r和r533a突变体表现出的c57bl6小鼠中视网膜下转导的水平。(图18a)aavrh8r a586r突变体显示与野生型aavrh8r相比减少的视网膜下转导。还测试了aav2载体。(图18b)aavrh8rr533a突变体显示与野生型aavrh8r和未处理的小鼠(mice)相比增加的视网膜下转导。通过视网膜下施用aavrh8r或aavrh8r精氨酸修饰的载体后30天c57bl6小鼠的视网膜裂解物(lysate)中的sflt02来监测转导。
698.图19显示玻璃体内施用aav2、aavrh8r或aavrh8r-a586r载体后30天c57bl6小鼠的视网膜裂解物中的sflt02的水平。
699.图20显示aav2的负责乙酰肝素结合的残基处与aavrh8r、aav1、aav6、aav8、aav9和aavrh10的氨基酸比对。
700.发明详述
701.如本技术中所述，发明人令人惊奇地发现：raav颗粒中对应于氨基酸484、487、532、585和/或588(编号基于aav2的vp1编号)的修饰证明了施用于受试者的眼或cns后增加的细胞转导。不愿受任何理论束缚，认为这些raav颗粒具有降低的或去除的与hspg的结合或在衣壳上具有修饰的电荷，使得所述raav颗粒的施用导致受试者的眼或cns中的细胞转导增加。因此，本发明提供用于将异源核酸递送至个体的眼或cns的方法，其包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于个体的眼或cns，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和b)raav载体，其包含所述异源核酸和至少一个aav反向末端重复。在一些实施方案中，所述氨基酸取代导致降低的或去除的与hspg的结合。
702.在一些方面，本发明提供用于将异源核酸递送个体眼部的方法，其包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于个体的视网膜下，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和b)raav载体，其包含所述异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
703.在一些方面，本发明提供在将raav颗粒视网膜下递送至个体眼部后与用包含野生型衣壳的raav转导细胞相比改进细胞的raav转导的方法，所述方法包括在aav衣壳蛋白中并入一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处；其中所述raav颗粒包含raav衣壳蛋白和raav载体，所述raav载体包含异源核酸和至少一个aav末端重复。在一些实施方案中，所述氨基酸取代导致降低的或去除的与hspg的结合。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含衣壳，所述衣壳包含raav2的r585a和
r588a取代，编号基于aav2的vp1(seq id no:1)。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含衣壳，所述衣壳包含aavrh8r的a586r和/或r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1(seq id no:9)。
704.在一些方面，本发明提供在将raav颗粒视网膜下递送至个体的眼部后改进异源核酸的表达的方法，所述方法包括在aav衣壳蛋白中并入一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处；其中所述raav颗粒包含raav衣壳蛋白和raav载体，所述raav载体包含所述异源核酸和至少一个aav末端重复。在一些实施方案中，所述氨基酸取代导致降低的或去除的与hspg的结合。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含衣壳，所述衣壳包含raav2的r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1(seq id no:1)。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含衣壳，所述衣壳包含aavrh8r的a586r和/或r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1(seq id no:9)。
705.在一些方面，本发明提供在将raav颗粒视网膜下递送至个体眼部后改进异源核酸的表达的方法，所述方法包括在aav衣壳蛋白中并入一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处；其中所述raav颗粒包含raav衣壳蛋白和raav载体，所述raav载体包含异源核酸和至少一个aav末端重复。所述改进是与包含野生型衣壳的raav颗粒相比的转导。在一些实施方案中，所述氨基酸取代导致降低的或去除的与hspg的结合。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含衣壳，所述衣壳包含raav2衣壳的r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1(seq id no:1)。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含衣壳，所述衣壳包含aavrh8r的a586r和/或r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1(seq id no:9)。
706.在一些方面，本发明提供治疗个体中的眼部病症的方法，其包括将包含有效量的raav颗粒的组合物递送至个体的视网膜，其中所述raav颗粒包含a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav末端重复。在一些实施方案中，所述氨基酸取代导致降低的或去除的与hspg的结合。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含衣壳，所述衣壳包含raav2的r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1(seq id no:1)。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含衣壳，所述衣壳包含aavrh8r的a586r和/或r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1(seq id no:9)。
707.本发明还提供用于将载体视网膜下递送至个体眼部的系统，其包含a)含有有效量的raav颗粒的组合物，其中i)所述raav颗粒的衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，且ii)所述载体包含编码治疗性多肽或治疗性rna的异源核酸和至少一个aav末端重复；和b)用于视网膜递送所述raav的装置。在一些实施方案中，所述氨基酸取代导致降低的或去除的与hspg的结合。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含衣壳，所述衣壳包含raav2的r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1(seq id no:1)。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含衣壳，所述衣壳包含aavrh8r的a586r和/或r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1(seq id no:9)。
708.在一些方面，本发明还提供用于将异源核酸递送至个体的中枢神经系统(cns)的方法，其包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于个体的cns。所述raav颗粒包含(a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙
酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和(b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。这些方法表现出在将raav颗粒递送至个体的cns后改进的异源核酸表达和/或细胞的raav转导，例如与用包含野生型衣壳的raav转导细胞相比的改进。而且，本发明的方法能够感染特定的细胞(例如神经元)同时仍实现普遍的和稳固的转导效率。所述raav颗粒和方法适用于治疗cns病症，所述cns病症包括但不限于亨廷顿氏病。在一些实施方案中，所述氨基酸取代导致降低的或去除的与hspg的结合。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含衣壳，所述衣壳包含raav2的r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1(seq id no:1)。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含衣壳，所述衣壳包含aavrh8r的a586r和/或r533a取代，编号基于aavrh8r的vp1(seq id no:9)。
709.本发明还提供含有raav颗粒或含raav颗粒的组合物的试剂盒，所述raav颗粒具有(a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和(b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。这些试剂盒可用于将异源核酸递送至个体的眼部或cns，以及用于治疗个体中的眼部或cns病症(例如治疗视网膜病或亨廷顿氏病)。
710.i.一般技术
711.本领域的技术人员一般地充分理解并使用常规方法通常地采用本技术所描述或引用的技术和步骤，例如，如下文献中描述的广泛利用的方法：molecular cloning:a laboratory manual(sambrook等，第4版，cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,n.y.,2012)；current protocols in molecular biology(f.m.ausubel等编,2003)；methods in enzymology系列(academic press,inc.)；pcr 2:a practical approach(m.j.macpherson,b.d.hames and g.r.taylor编,1995)；antibodies,a laboratory manual(harlow和lane,编,1988)；culture of animal cells:a manual of basic technique and specialized applications(r.i.freshney,第六版,j.wiley and sons,2010)；oligonucleotide synthesis(m.j.gait编,1984)；methods in molecular biology,humana press；cell biology:alaboratory notebook(j.e.cellis编,academic press,1998)；introduction to cell and tissue culture(j.p.mather和p.e.roberts,plenum press,1998)；cell and tissue culture:laboratory procedures(a.doyle,j.b.griffiths,及d.g.newell,编,j.wiley and sons,1993-8)；handbook of experimental immunology(d.m.weir和c.c.blackwell编,1996)；gene transfer vectors for mammalian cells(j.m.miller和m.p.calos编,1987)；pcr:the polymerase chain reaction,(mullis等编,1994)；current protocols in immunology(j.e.coligan等编,1991)；short protocols in molecular biology(ausubel等编,j.wiley and sons,2002)；immunobiology(c.a.janeway等,2004)；antibodies(p.finch,1997)；antibodies:a practical approach(d.catty编,irl press,1988-1989)；monoclonal antibodies:a practical approach(p.shepherd和c.dean编,oxford university press,2000)；using antibodies:a laboratory manual(e.harlow和d.lane,cold spring harbor laboratory press,1999)；the antibodies(m.zanetti and j.d.capra编,harwood academic publishers,1995)；和cancer:principles and practice of oncology(v.t.devita等编,j.b.lippincott company,2011)。
712.ii.定义
713.如本文所用的，“载体”意指重组质粒或病毒，其包含待体外或体内递送入宿主细胞的核酸。
714.如本文所用的术语“多核苷酸”或“核酸”意指聚合物形式的任何长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。因此，此术语包括但不限于单链、双链或多链dna或rna、基因组dna、cdna、dna-rna杂交体或包含嘌呤和嘧啶碱基的聚合物，或其他天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生化的核苷酸碱基。多核苷酸的主链可以包含糖和磷酸基团(如常见于rna或dna中的)，或修饰的或取代的糖或磷酸基团。或者，多核苷酸的骨架可以包含合成的亚基如氨基磷酸酯(phosphoramidate)的聚合物，并由此可以是寡脱氧核苷氨基磷酸酯(p-nh2)或混合的氨基磷酸酯-磷酸二酯(phosphoramidate-phosphodiester)寡聚物。此外，双链多核苷酸能够从化学合成的单链多核苷酸产物通过合成互补链并在适当的条件下退火所述链，或者通过使用dna聚合酶以适当的引物从头合成互补链来获得。
715.术语“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，以意指氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。所述氨基酸残基的聚合物可以含有天然或非天然氨基酸残基，其包括但不限于肽、寡肽、氨基酸残基的二聚体、三聚体和多聚体。所述定义涵盖全长蛋白质和其片段二者。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化、磷酸化等。此外，就本发明而言，“多肽”意指这样的蛋白质，其包括对天然序列的修饰，如缺失、添加和取代(通常在性质上是保守的)，只要所述蛋白质维持所需的活性。这些修饰可以是故意的，如通过定点诱变(site-directed mutagenesis)，或可以是意外的，如通过产生所述蛋白质的宿主的突变或由于pcr扩增的错误得到的。
[0716]“重组病毒载体”意指包含一个或多个异源序列(即非病毒来源的核酸序列)的重组多核苷酸载体。在重组aav载体的情况中，重组核酸侧翼有至少一个反向末端重复序列(itr)。在一些实施方案中，重组核酸侧翼有两个itr。
[0717]“重组aav载体(raav载体)”意指多核苷酸载体，其包含一个或多个异源序列(即非aav来源的核酸序列)，其侧翼有至少一个aav末端反向重复序列(itr)。所述raav载体当存在于已用合适的辅助病毒感染(或者正在表达合适的辅助功能的)且正在表达aav rep和cap基因产物(即aav rep和cap蛋白质)的宿主细胞中时可复制并包装入感染性病毒颗粒。当将raav载体整合入较大的多核苷酸(例如整合入染色体中或于另一载体，如用于克隆或转染的质粒中)时，则该raav载体可称为“原载体(pro-vector)”，其能够通过在aav包装功能和合适的辅助功能的存在下复制和衣壳化而被“拯救”。raav载体可以是多种形式中的任一种，包括但不限于质粒、线性人工染色体、与脂质复合、包囊于脂质粒内和在病毒颗粒(例如aav颗粒)中衣壳化。可将raav载体包装入aav病毒衣壳以生成“重组腺相关病毒颗粒(raav颗粒)”。
[0718]“raav病毒”或“raav病毒颗粒”意指由至少一个aav衣壳蛋白和衣壳化的raav载体基因组组成的病毒颗粒。
[0719]“异源”意指源自与其比较的或引入或整合入的实体的其余部分在基因型上截然不同的实体。例如，通过基因工程技术引入不同细胞类型的多核苷酸是异源多核苷酸(而且在表达时能够编码异源多肽)。类似地，并入病毒载体的细胞序列(例如基因或其部分)是相对于所述载体的异源核苷酸序列。
[0720]
术语“转基因”意指引入细胞并能够被转录成rna且任选地在适当条件下翻译和/或表达的多核苷酸。在一些方面，它赋予它所引入的细胞以期望的性质或以其他方式产生期望的治疗或诊断结果。在另一个方面，它可以被转录为介导rna干扰的分子，如mirna、sirna或shrna。
[0721]
如涉及病毒效价使用的术语“基因组颗粒(gp)”、“基因组等同物”或“基因组拷贝”意指含有重组aav dna基因组的病毒体的数目，而无论感染性或功能性。特定载体制备物中的基因组颗粒的数目能够通过如本文实施例中，或例如clark等(1999)hum.gene ther.,10:1031-1039；veldwijk等(2002)mol.ther.,6:272-278中所述的步骤来测量。
[0722]
如本技术使用的术语“载体基因组(vg)”可指一个或多个多核苷酸，其包含载体(例如病毒载体)的一组多核苷酸序列。载体基因组可衣壳化于病毒颗粒中。取决于特定的病毒载体，载体基因组可包含单链dna、双链dna或单链rna或双链rna。载体基因组可包含与特定病毒载体相关联的内源序列和/或通过重组技术插入特定病毒载体的任何异源序列。例如，重组aav载体基因组可包含至少一个itr序列，其位于启动子、填充片段(stuffer)、目的序列(例如rnai)和多聚腺苷酸化序列的侧翼。完全的载体基因组可包含载体的多核苷酸序列的完全组。在一些实施方案中，病毒载体的核酸效价可以vg/ml来测量。适于测量此效价的方法是本领域已知的(例如定量pcr)。
[0723]
如涉及病毒效价而使用的术语“感染单位(iu)”、“感染性颗粒”或“复制单位”指如通过感染性中心测定法(也称为复制中心测定法，如例如mclaughlin等(1988)j.virol.,62:1963-1973中所述)测量的感染性的且有复制能力的重组aav载体颗粒的数目。
[0724]
如涉及病毒效价使用的术语“转导单位(tu)”意指如功能测定法(如本文实施例中或例如xiao等(1997)exp.neurobiol.,144:113-124中；或fisher等(1996)j.virol.,70:520-532(lfu测定法)中描述的)中测得的导致功能性转基因产物产生的感染性重组aav载体颗粒的数目。
[0725]“反向末端重复”或“itr”序列是本领域中充分理解的术语并意指见于病毒基因组末端的处于反方向的相对短的序列。
[0726]
本领域中充分理解的术语“aav反向末端重复(itr)”序列是大约145-核苷酸的序列，其存在于天然单链aav基因组的两个末端。itr的最外侧的125个核苷酸能够以两个可选方向的任一个存在，这导致不同aav基因组之间的异质性和单个aav基因组的两个末端之间的异质性。最外侧的125个核苷酸也含有自身互补性的几个较短区域(定名为a、a'、b、b'、c、c'和d区)，其允许在itr的此部分内发生链内碱基配对。
[0727]“末端解析序列”或“trs”是aav itr的d区中的序列，其在病毒dna复制过程中被aav rep蛋白切割。突变体末端解析序列难以被(refractory to)aav rep蛋白的切割。
[0728]
aav的“辅助病毒”意指允许aav(其是缺陷性细小病毒(defective parvovirus))被宿主细胞复制并包装的病毒。已鉴定出多个这样的辅助病毒，包括腺病毒、疱疹病毒和痘病毒如牛痘。腺病毒涵盖多个不同的亚组，尽管c亚组的腺病毒5型(ad5)是最通常使用的。人、非人哺乳动物和禽来源的多种腺病毒是已知的，并可由保藏机构如atcc得到。还可由保藏机构如atcc得到的疱疹家族的病毒包括例如单纯疱疹病毒(hsv)、epstein-barr病毒(ebv)、巨细胞病毒(cmv)和假狂犬病病毒(prv)。
[0729]
相对于参考多肽或核酸序列的“百分比(％)序列同一性”定义为在比对序列并引
入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性而不考虑任何保守取代作为序列同一性的部分后，候选序列中与参考多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。意在确定百分比氨基酸或核酸序列同一性的比对能够以本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件程序，例如current protocols in molecular biology(ausubel等编，1987),增刊30，7.7.18节，表7.7.1中所述的那些，并包括blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。比对程序的一个实例是align plus(scientific and educational software,pennsylvania)。本领域的技术人员能够确定测量比对的适当的参数，其包括实现参与比较的序列在全长上的最大对齐所需要的任何算法。就本文的目的而言，给定氨基酸序列a对、与或针对给定氨基酸序列b的％氨基酸序列同一性(或者其可描述为对、与或针对给定氨基酸序列b具有或包含一定％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列a)计算如下：100乘以分数x/y，其中x是该程序的a和b比对中由序列比对程序计分为相同匹配的氨基酸残基的数目，而其中y是b中氨基酸残基的总数。可理解的是其中氨基酸序列a的长度不等于氨基酸序列b的长度，a对b的％氨基酸序列同一性不等于b对a的％氨基酸序列同一性。就本文的目的而言，给定核酸序列c对、与或针对给定核酸序列d的％核酸序列同一性(或者其可描述为对、与或针对给定核酸序列d具有或包含一定％核酸序列同一性的给定核酸序列c)计算如下：100乘以分数w/z，其中w是该程序的c和d比对中由序列比对程序计分为相同匹配的核苷酸的数目，而其中z是d中核苷酸的总数。可理解的是其中核酸序列c的长度不等于核酸序列d的长度，c对d的％核酸序列同一性不等于d对c的％核酸序列同一性。
[0730]“分离的”分子(例如核酸或蛋白质)或细胞意指其已被鉴定和分离和/或从其天然环境的组分回收。
[0731]“有效量”是足以实现有益或期望的结果，包括临床结果(例如症状改善，达到临床终点等)的量。有效量可以在一次或多次施用中施用。就疾病状态而言，有效量是足以改善疾病、稳定疾病、或延迟疾病进展的量。
[0732]“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养动物(例如，牛，羊，猫，狗，和马)，灵长类动物(例如，人和非人灵长类动物如猴)，兔，和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，所述个体或受试者是人。
[0733]
如本文所用的，“治疗”是用于获得有益的或期望的临床结果的方法。对于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻，疾病程度的降低，稳定的(例如不恶化的)疾病状态，防止疾病的扩散(例如转移)，疾病进展的延迟或减缓，疾病状态的改善或减轻，和缓解(无论部分或全部)，无论其是可检测或不可检测的。“治疗”也能意味着与不接受治疗的预期存活期相比延长的存活期。
[0734]
如本文所用的，术语“预防性治疗”指这样的治疗，在所述治疗中个体已知患有或疑似患有病症或处于患上病症的风险但未表现出病症的症状或表现出最少症状。经历预防性治疗的个体可在症状发作前得到治疗。
[0735]
如本文所用的，“治疗”剂(例如治疗性多肽、核酸或转基因)是一种药剂，其提供有益的或期望的临床结果，如上述的示例性临床结果。如此，治疗剂可用于如上所述的治疗。
[0736]
如本文所用的术语“中央视网膜”指外黄斑(outer macula)和/或内黄斑(inner macula)和/或凹(fovea)。如本文所用的术语“中央视网膜细胞类型”意指中央视网膜的细
胞类型，如例如rpe和感光细胞。
[0737]
术语“黄斑”意指灵长类中中央视网膜中的区，其含有与外周视网膜相比更高相对浓度的感光细胞，特别是视杆细胞和视锥细胞。如本文所用的术语“外黄斑”还可称为“外周黄斑”。如本文所用的术语“内黄斑”还可称为“中央黄斑”。
[0738]
术语“凹”意指灵长类的中央视网膜中的小区，直径约等于或小于0.5mm，其含有与外周视网膜和黄斑相比更高相对浓度的感光细胞，特别是视锥细胞。
[0739]
如本文所用的术语“视网膜下空间”意指视网膜中感光细胞和视网膜色素上皮细胞之间的部位。视网膜下空间可以是潜在的空间，如在流体的任何视网膜下注射之前。视网膜下空间还可含有注射入潜在空间的流体。在此情况中，所述流体“与视网膜下空间接触”。“与视网膜下空间接触”的细胞包括毗连视网膜下空间边界的细胞，如rpe和感光细胞。
[0740]
如本文所用的术语“泡(bleb)”意指眼的视网膜下空间内的流体空间。本发明的泡可通过如下产生：将流体单次注射入单个空间，将一种或多种流体多次注射入相同空间，或多次注射入多个空间，其在复位时产生用于对视网膜下空间的期望的部分实现治疗效果的总流体空间(total fluid space)。
[0741]“视紫红激酶(rk)启动子”意指源自视紫红激酶基因(例如人rk，以genbank entrez gene id 6011表示)的多核苷酸序列，其驱动视杆和视锥感光细胞以及视网膜细胞系如weri rb-1中特异性的表达。如本文所用的，“视紫红激酶启动子”可指整个启动子序列或足以驱动光感受器特异性表达的所述启动子的片段，如khani,s.c.等(2007)invest.ophthalmol.vis.sci.48(9):3954-61和young,j.e.等(2003)invest.ophthalmol.vis.sci.44(9):4076-85中所述的序列。在一些实施方案中，rk启动子跨越-112至+180(相对于转录起始位点)。
[0742]“鸡β-肌动蛋白(cba)启动子”意指源自鸡β-肌动蛋白基因(例如原鸡β-肌动蛋白，由genbank entrez gene id 396526表示)的多核苷酸序列。如本文所用的，“鸡β-肌动蛋白启动子”可指这样的启动子，所述启动子含有巨细胞病毒(cmv)早期增强子元件、鸡β-肌动蛋白基因的启动子和第一外显子和内含子，和兔β-球蛋白基因的剪接受体，如miyazaki,j.等(1989)gene79(2):269-77中所述的序列。如本文所用的，术语“cag启动子”可互换使用。如本文所用的，术语“cmv早期增强子/鸡β-肌动蛋白(cag)启动子”可互换使用。
[0743]
本技术提及值或参数的“约”包括(并描述)针对该值或参数本身的实施方案。例如，提及“约x”的描述包括“x”的描述。
[0744]
如本文所用的，物品的单数形式“一个/一种”、“所述”和“所述”包括复数指称，除非另有说明。
[0745]
可理解的是，本技术所述本发明的方面和实施方案包括“包含”、“由...组成”和/或“基本上由...组成”方面和实施方案。
[0746]
iii.病毒颗粒
[0747]
本领域已知硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)充当aav2颗粒的细胞受体(summerford,c.和samulski,r.j.(1998)j.virol.72(2):1438-45)。aav2颗粒和细胞膜处的hspg之间的结合用于将颗粒附接至细胞。其他细胞表面蛋白如成纤维细胞生长因子受体和αvβ5整联蛋白也可促进细胞感染。在结合之后，aav2颗粒可通过包括受体介导的胞吞作用的机制经由网格蛋白包覆小窝(clathrin-coated pit)进入细胞。aav2颗粒可在内体酸
化(endosomal acidification)后从细胞内小泡释放。这允许aav2颗粒行进至核周区然后至细胞核。还已知aav3颗粒结合乙酰肝素(rabinowitz,j.e.等(2002)j.virol.76(2)：791-801)。
[0748]
眼部病症的基因治疗程序需要将载体局部递送至眼中的细胞(例如视网膜的细胞)。可作为这些疾病中的治疗靶标的细胞可包括尤其是眼部的一种或多种细胞(例如感光物、眼神经元等)。本发明的方法和试剂盒基于、至少部分基于如下发现：特定的raav衣壳(例如包含raav衣壳蛋白的那些，所述衣壳蛋白在与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸取代)允许在眼部细胞中广布的载体分布。如此，这些衣壳可以特别有利地用于将异源核酸递送至个体的眼部、改进在将raav颗粒递送至个体眼部后细胞的raav转导、改进将raav颗粒递送至个体眼部后异源核酸的表达和/或使用raav颗粒治疗个体的眼部病症。
[0749]
同样地，cns的病症的基因治疗程序需要将载体局部递送至cns中的细胞。可作为这些疾病中的治疗靶标的细胞可包括尤其是脑的一种或多种细胞(例如神经元)。本发明的方法和试剂盒基于、至少部分基于如下发现：特定的raav衣壳(例如包含raav衣壳蛋白的那些，所述衣壳蛋白在与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处包含一个或多个氨基酸取代)允许在cns的细胞中广布的载体分布。如此，这些衣壳可特别有利地用于将异源核酸递送至个体的中枢神经系统(cns)、改进将raav颗粒递送至个体的cns后细胞的raav转导、改进将raav颗粒递送至个体的cns后异源核酸的表达和/或使用raav颗粒治疗个体的cns的病症。
[0750]
aav(例如aav2、aavrh8r等)的衣壳已知包括三种衣壳蛋白：vp1、vp2和vp3。这些蛋白质含有显著量的重叠氨基酸序列和独特的n-末端序列。aav2衣壳包括通过二十面体对称排布的60个亚基(xie,q.等(2002)proc.natl.acad.sci.99(16):10405-10)。已发现vp1、vp2和vp3以1:1:10比例存在。
[0751]
已知aav2衣壳蛋白和hspg之间的结合经由碱性aav2衣壳蛋白残基和带负电的糖胺聚糖残基之间的静电相互作用发生(opie,sr等，(2003)j.virol.77:6995-7006；kern,a等，(2003)j.virol.77:11072-11081)。这些相互作用中涉及的特定衣壳残基包括r484、r487、k532、r585和r588。已显示这些残基中的突变可降低aav2与hela细胞和乙酰肝素自身的结合(opie,sr等，(2003)j.virol.77:6995-7006；kern,a等，(2003)j.virol.77:11072-11081；wo2004/027019a2、美国专利no.7,629,322)。此外，不愿受理论束缚，认为位于一个或多个对应于氨基酸484、487、532、585或588的残基(编号基于aav2的vp1编号)处的氨基酸取代可调节不结合hspg的aav衣壳类型的转导特性，或可不依赖于其对hspg的结合能力而调节aav衣壳类型的转导特性。
[0752]
本发明的一些方面涉及将异源核酸递送至个体的眼部或中枢神经系统(cns)，其包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于个体的眼部或cns。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含含有raav衣壳蛋白的raav衣壳，所述衣壳蛋白在与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，本发明的raav颗粒包含aav血清型2(aav2)衣壳。在一些实施方案中，本发明的raav颗粒包含aav血清型rh8r(aavrh8r)衣壳。
[0753]
如本技术中所述，在衣壳蛋白中在与hspg相互作用的残基处或在对应于氨基酸
484、487、532、585或588的一个或多个残基(编号基于aav2的vp1编号)处具有突变的raav颗粒显示出有利的性质，如增强的表达和/或降低的神经性炎症。因此，在一些实施方案中，递送后由raav载体编码的异源核酸以增加的表达水平表达，所述增加是与包含含有参考raav衣壳蛋白(例如野生型raav衣壳蛋白)的raav衣壳的raav颗粒的异源核酸的表达水平相比。在一些实施方案中，核酸的表达增加至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约100％。在一些实施方案中，递送后所述raav颗粒引起与包含参考raav衣壳蛋白(例如野生型raav衣壳蛋白)的raav颗粒相比降低的神经性炎症。在一些实施方案中，将神经性炎症减少至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％，或至少约100％。合适的参考raav衣壳蛋白可包括任何这样的衣壳蛋白，所述衣壳蛋白在与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置缺乏一个或多个氨基酸取代(参考衣壳可由此含有一个或多个“背景”取代，其不改变与hspg的结合)。
[0754]
在一些实施方案中，本发明提供用于将异源核酸递送至个体眼部的方法，其包括将重组腺相关病毒(raav)颗粒施用于个体的视网膜下空间，其中所述raav颗粒包含a)包含raav衣壳蛋白的raav衣壳，所述raav衣壳蛋白含有一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和b)raav载体，其包含所述异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
[0755]
在一些实施方案中，本发明的raav颗粒包含aav血清型2(aav2)衣壳。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是aav2的vp1、vp2和/或vp3的任一项的氨基酸残基的取代，其中所述氨基取代改变raav颗粒与hspg的相互作用(例如降低或去除与hspg的结合)。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是vp1 aav2的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是vp2 aav2的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是vp3 aav2的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是aav2的vp1、vp2和vp3的组合的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是aav2的vp1、vp2和/或vp3的任一者的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是seq id no:1、3和/或5的衣壳蛋白的任一者的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，本发明的raav颗粒包含seqid no：2、4和/或6的衣壳蛋白。
[0756]
在一些实施方案中，本发明的raav颗粒包含aav血清型3(aav3)衣壳。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是aav3的vp1、vp2和/或vp3的任一项的氨基酸残基的取代，其中所述氨基取代改变所述raav颗粒与hspg的相互作用(例如降低或去除与hspg的结合)。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是vp1 aav3的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是vp2 aav3的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是vp3 aav3的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是aav3的vp1、vp2和vp3的组合的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是aav3的vp1、vp2和/或vp3的任一者的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是对应于seq id no:7的衣壳蛋白的氨基酸残基的取代。
[0757]
在一些实施方案中，本发明的raav颗粒包含aav血清型rh8r(aavrh8r)衣壳，例如，如u.s.pg pub.no.20090317417中所述。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是
aavrh8r的vp1、vp2和/或vp3的任一者的氨基酸残基的取代，其中所述氨基取代改变所述raav颗粒与hspg的相互作用(例如降低或去除与hspg的结合)。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是vp1 aavrh8r的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是vp2 aavrh8r的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是vp3 aavrh8r的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是aavrh8r的vp1、vp2和vp3的组合的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是aavrh8r的vp1、vp2和/或vp3的任一者的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是由seq id no:9例示的衣壳蛋白的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，本发明的raav颗粒包含seq id no:10和/或11的衣壳蛋白。
[0758]
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低约至少10％、约至少25％、约至少50％、约至少75％、或约至少100％。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低约至少10％、约至少15％、约至少20％、约至少25％、约至少30％、约至少35％、约至少40％、约至少45％、约至少50％、约至少55％、约至少60％、约至少65％、约至少70％、约至少75％、约至少80％、约至少85％、约至少90％、约至少95％，或约至少100％(与包含野生型衣壳的raav颗粒的结合相比)。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代将所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合降低下述任一者：约10％至约100％、约20％至约100％、约30％至约100％、约40％至约100％、约50％至约100％、约60％至约100％、约70％至约100％、约80％至约100％、约90％至约100％、约10％至约90％、约20％至约90％、约30％至约90％、约40％至约90％、约50％至约90％、约60％至约90％、约70％至约90％、约80％至约90％、约10％至约80％、约20％至约80％、约30％至约80％、约40％至约80％、约50％至约80％、约60％至约80％、约70％至约80％、约10％至约70％、约20％至约70％、约30％至约70％、约40％至约70％、约50％至约70％、约60％至约70％、约10％至约60％、约20％至约60％、约30％至约60％、约40％至约60％、约50％至约60％、约10％至约50％、约20％至约50％、约30％至约50％、约40％至约50％、约10％至约40％、约20％至约40％、约30％至约40％、约10％至约30％、约20％至约30％或约10％至约20％(与包含野生型衣壳的raav颗粒的结合相比)。在一些实施方案中，与野生型raav颗粒的结合相比，所述一个或多个氨基酸取代导致没有可检测的raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。测量aav颗粒与hspg的结合的手段是本领域已知的；例如结合至硫酸乙酰肝素色谱介质或结合至已知在其表面表达hspg的细胞。例如，参见opie,sr等，(2003)j.virol.77:6995-7006和kern,a等，(2003)j.virol.77：11072-11081。
[0759]
在一些实施方案中，本发明提供raav颗粒用于视网膜下递送治疗性核酸，其中所述raav颗粒包含衣壳蛋白的一个或多个氨基酸取代，其降低或去除所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合，其中所述一个或多个氨基酸取代位于位置484、487、532、585或588处，编号基于aav2的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于aav2的vp1的位置484、487、532、585或588处。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于aav2的vp2的位置484、487、532、585或588处，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于aav2的vp3的位置484、487、532、585或588处，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于aav2的vp1、aav2的vp2和/或aav2
的vp3的位置484、487、532、585或588处，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，raav2的vp1包含seq id no:1的氨基酸序列。
[0760]
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于aav3的vp1的位置484、487、532、585或588处，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于aav3的vp2的位置484、487、532、585或588处，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于aav3的vp3的位置484、487、532、585或588处，编号基于aav2的vp1处。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于aav3的vp1、aav3的vp2和/或aav3的vp3的位置484、487、532、585或588处，编号基于raav2的vp1。在一些实施方案中，raav2的vp1包含seq id no:1的氨基酸序列。
[0761]
在一些实施方案中，本发明的aav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代位于位置485、488、528、533、586或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基取代带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用疏水性氨基酸残基取代所述带正电荷的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在其他实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用带正电荷的氨基酸残基取代疏水性氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括丙氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置r533和/或a586处的取代，编号基于aavrh8r的vp1。在进一步的实施方案中，所述aav衣壳包含氨基酸取代a586r和/或r533a，编号基于aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含seq id no:10和/或11的raav衣壳蛋白。
[0762]
在本发明的一些具体实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用不带正电荷的氨基酸残基(例如不含有带正电荷的侧链的氨基酸)取代带正电荷的氨基酸残基(例如具有带正电荷的侧链的氨基酸)。带正电荷的氨基酸包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸。不带正电荷的氨基酸残基的实例包括带负电的氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)、具有疏水侧链的氨基酸(丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)、甘氨酸、半胱氨酸和脯氨酸。在一些实施方案中，aav衣壳的一个或多个带正电荷的氨基酸残基用疏水性氨基酸残基取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括精氨酸或赖氨酸残基的取代。在进一步的实施方案中，一个或多个氨基酸取代包含用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。在其他实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用带正电荷的氨基酸残基取代不带正电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，用带正电荷的氨基酸残基取代疏水性氨基酸残基。在进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括丙氨酸残基的取代。在更进一步的实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括用丙氨酸残基取代精氨酸或赖氨酸残基。
[0763]
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括在vp1、vp2和/或vp3的位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，
所述一个或多个氨基酸取代包括在aav2的vp1、vp2和/或vp3的位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括在aav2的vp1、vp2和/或vp3的位置r484、r487、k527、k532和/或r588处的取代，编号基于seq id no:1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括aav2的vp1、vp2和/或vp3的r484a、r487a、r585a和/或r588a取代的一个或多个，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位于aav3的vp1、vp2和/或vp3的位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括aav3的vp1、vp2和/或vp3的r484a、r487a、r585a和/或r588a取代的一个或多个，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含seq id no:2、4和/或6的raav衣壳蛋白。
[0764]
在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括在vp1、vp2和/或vp3的位置r485、r488、r533、a586和/或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括在vp1、vp2和/或vp3的位置r485、r488、r533、a586和/或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1，编号基于seq id no:9。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括aav2的vp1、vp2和/或vp3的r533a和/或a586r取代的一个或多个，编号基于aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含seq id no:10和/或11的raav衣壳蛋白。
[0765]
在一些实施方案中，所述aav衣壳在与hspg相互作用的一个或多个位置处包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述aav衣壳在降低或去除与hspg的结合的一个或多个位置处包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述aav衣壳包含一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸取代，其降低或去除与hspg的结合。在一些实施方案中，所述aav衣壳具有一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸取代，其降低或去除与hspg的结合。在一些实施方案中，所述aav衣壳包含位于位置r484和r487处的取代，编号基于raav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳具有位置r484和r487处的取代，编号基于raav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳包含位置r585和r588处的取代，编号基于raav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳具有位置r585和r588处的取代，编号基于raav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳包含取代r484a和r487a，编号基于raav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳具有取代r484a和r487a，编号基于raav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳包含取代r585a和r588a，编号基于raav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳具有取代r585a和r588a，编号基于raav2的vp1。
[0766]
已知硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)在遍及身体的多个组织中表达，并在细胞外基质、细胞黏附和细胞信号传输中起重要的作用。在一些实施方案中，所述硫酸乙酰肝素蛋白聚糖在cns的一种或多种细胞上表达。在一些实施方案中，所述cns的一种或多种细胞是神经元。
[0767]
在一些实施方案中，本发明提供raav颗粒用于治疗性核酸的cns递送，其中所述raav颗粒包含衣壳蛋白的一个或多个氨基酸取代，其降低或去除所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置347、350、390、395、448、451、484、487、527、532、585和/或588处，编号基于aav2的vp1。如本文所用的，“编号基于aav2的vp1”指所述衣壳蛋白的氨基酸对应于aav2的vp1的所述氨基酸。例如，如
果一个或多个氨基酸取代位于位置347、350、390、395、448、451、484、487、527、532、585和/或588处，编号基于aav2的vp1，则所述一个或多个氨基酸取代位于所述衣壳蛋白对应于aav2的vp1的氨基酸347、350、390、395、448、451、484、487、527、532、585和/或588的氨基酸处。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置r347、r350、k390、k395、r448、r451、r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于aav2的位置484、487、532、585或588处。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于aav2的vp1、aav2的vp2和/或aav2的vp3的位置484、487、532、585或588处，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav2的vp1(例如raav2)包含seq id no:1的氨基酸序列。
[0768]
在一些实施方案中，所述aav衣壳包含位置r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于raav2的vp1。在一些实施方案中，本发明的raav颗粒包含seq id no:2、4和/或6的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述aav衣壳包含位置r484和r487或r585和r588处的取代，编号基于raav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳包含r484a和r487a取代或r585a和r588a取代，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳包含氨基酸取代r585a和r588a，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述aav衣壳包含氨基酸取代k532a，编号基于aav2的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括r347a、r350a、k390a、k395a、r448a、r451a、r484a、r487a、k527a、k532a、r585a和/或r588a取代，编号基于aav2的vp1。
[0769]
在一些实施方案中，本发明提供raav颗粒用于治疗性核酸的cns递送，其中所述raav颗粒包含衣壳蛋白的一个或多个氨基酸取代，其降低或去除所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合。在一些实施方案中，本发明的raav颗粒包含aav血清型rh8r(aavrh8r)衣壳，例如，如u.s.pg pub.no.20090317417中所述。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是aavrh8r的vp1、vp2和/或vp3的任一项的氨基酸残基的取代，其中所述氨基取代改变所述raav颗粒与hspg的相互作用(例如降低或去除与hspg的结合)。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是vp1 aavrh8r的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是vp2aavrh8r的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是vp3 aavrh8r的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是aavrh8r的vp1、vp2和vp3的组合的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是aavrh8r的vp1、vp2和/或vp3的任一者的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是由seq id no:9例示的衣壳蛋白的氨基酸残基的取代。在一些实施方案中，本发明的raav颗粒包含seq id no:10和/或11的衣壳蛋白。
[0770]
在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型rh8r(aavrh8r)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述编号基于包含seq id no:9的氨基酸序列的aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置a586和/或t589处的取代，编号基于aavrh8r的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括a586r取代，编号基于aavrh8r的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括t589r或t589k取代，编号基于aavrh8r的vp1。
[0771]
如上文所讨论的，不愿受理论束缚，认为位于对应于氨基酸484、487、532、585或
588的一个或多个残基处的氨基酸取代(编号基于aav2的vp1编号)可调节不结合hspg的aav衣壳类型的转导特性，或可不依赖于其结合hspg的能力而调节aav衣壳类型的转导性质。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包含对应于图20中所示的氨基酸的一个或多个氨基酸。例如，在一些实施方案中，在对应于氨基酸585和/或588(编号基于aav2的vp1)的位置处的一个或多个氨基酸被精氨酸残基替代(例如aav1或aav6的s586和/或t589；aav9的s586和/或a589；aavrh8r的a586和/或t589；aav8的q588和/或t591；和aavrh10的q588和/或a591)。这些修饰的衣壳可用于尤其是改善靶向视网膜的玻璃体内转导。在其他实施方案中，在对应于氨基酸484、487、527和/或532(编号基于aav2的vp1)的位置处的一个或多个氨基酸(例如精氨酸或赖氨酸)被不带正电荷的氨基酸如丙氨酸替代(例如aav1或aav6的r485、r488、k528和/或k533；aav9或aavrh8r的r485、r488、k528和/或r533；和aav8或aavrh10的r487、r490、k530和/或r535)。这些修饰的衣壳可用于尤其是改善视网膜下或cns转导。
[0772]
在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型1(aav1)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav1的vp1编号。在一些实施方案中，所述aav1的vp1包含seq id no:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或t589处的取代，编号基于aav1的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav1的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括t589r取代，编号基于aav1的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型6(aav6)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav6的vp1编号。在一些实施方案中，编号基于包含seq id no:13的氨基酸序列的aav6的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或t589处的取代，编号基于aav6的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav6的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括t589r取代，编号基于aav6的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型8(aav8)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置588和/或591处，编号基于aav8的vp1编号。在一些实施方案中，编号基于包含seq id no:14的氨基酸序列的aav8的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置q588和/或t591处的取代，编号基于aav8的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括q588r或q588k取代，编号基于aav8的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括t591r取代，编号基于aav8的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型9(aav9)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置586和/或589处，编号基于aav9的vp1编号。在一些实施方案中，编号基于包含seq id no:15的氨基酸序列的aav9的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括位置s586和/或a589处的取代，编号基于aav9的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括s586r或s586k取代，编号基于aav9的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括a589r或a589k取代，编号基于aav9的vp1。在一些实施方案中，所述raav颗粒包含aav血清型rh10(aavrh10)衣壳。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代位于位置588和/或591处，编号基于aavrh10的vp1编号。在一些实施方案中，编号基于包含seq id no:16的氨基酸序列的aavrh10的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸
取代包括位置q588和/或a591处的取代，编号基于aavrh10的vp1编号。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括q588r或q588k取代，编号基于aavrh10的vp1。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代包括a591r取代，编号基于aavrh10的vp1。
[0773]
iv.治疗方法
[0774]
用于视网膜疾病如lca、视网膜色素变性和与年龄相关的黄斑退化性改变的基因治疗程序需要将载体局部递送至视网膜中的细胞。在这些疾病中作为治疗靶标的细胞是视网膜中的感光细胞或感觉神经性视网膜下的(underlying the neurosensory retina)rpe的细胞。将基因治疗载体递送至这些细胞需要注射入视网膜和rpe之间的视网膜下空间中。在一些实施方案中，本发明提供将raav基因治疗载体递送至视网膜的细胞的方法，其中所述raav载体衣壳化于aav衣壳中，所述aav衣壳包含与hspg相互作用的一个或多个氨基酸残基的取代。
[0775]
在一些方面，本发明提供治疗个体的cns的病症的方法，其包括将包含raav颗粒的组合物递送至个体的cns，其中所述raav颗粒包含(a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和(b)raav载体，其包括所述异源核酸和至少一个aav末端重复。此外，本技术所述的用于将异源核酸递送至个体的中枢神经系统(cns)的方法、在将raav颗粒递送至个体的cns后改进细胞的raav转导的方法和在将raav颗粒递送至个体的cns后改进异源核酸的表达的方法可用于递送例如异源核酸，如编码治疗性多肽或治疗性核酸的异源核酸。这些方法可用于尤其是治疗cns的病症。在一些实施方案中，所述个体是人。
[0776]
治疗载体
[0777]
本发明提供眼部病症的基因治疗的方法，其中将包含治疗载体的raav颗粒递送至个体的视网膜。视网膜的细胞的改进的转导可通过将raav载体在raav衣壳(例如raav2、raavrh8r等颗粒)中衣壳化来实现，其中衣壳的与hspg相互作用的一个或多个氨基酸被取代从而降低或去除所述raav颗粒与hspg的结合。所述载体可包含编码多肽(例如治疗性或诊断性多肽)的异源核酸和/或治疗性核酸。编码治疗性或诊断性多肽和/或治疗性核酸的核酸能够使用本领域已知的方法用标准的合成和重组方法来生成。在一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性多肽。在一些实施方案中，所述异源核酸编码诊断性多肽。编码治疗性多肽的核酸的非限制性实例包括：用于替换已知引起视网膜疾病的缺失或突变基因的核酸，例如prph2、rpe65、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3和gnat2。编码治疗性多肽的核酸的其他非限制性实例包括编码神经营养因子(如gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo)、抗凋亡基因(如bcl2、bcl-x、nfκb)、抗血管生成因子(如内皮他汀、血管他汀、sflt)和抗炎因子(如il10、il1-ra、tgfβ、il4)的那些。用于眼部病症的其他治疗性多肽包括但不限于myo7a、abca4、rep1、gucy2d、pde6c、rs1、rpgrip、lpcat1、aipl1、rdh12、chm。在一些实施方案中，编码的多肽是多肽的人变体。
[0778]
本发明的核酸可编码多肽，所述多肽是细胞内蛋白质、锚定于细胞膜中、保持在细胞内，或由用本发明的载体转导的细胞分泌。对于由接受载体的细胞分泌的多肽；所述多肽可以是可溶的(即不附接于细胞)。例如，可溶的多肽缺乏跨膜区并从细胞分泌。鉴定并移除编码跨膜域的核酸序列的技术是本领域已知的。
[0779]
可根据本发明施用的载体还包括包含核酸的载体，所述核酸编码rna(例如rnai、
核酶、mirna、sirna、反义rna)，所述rna在从载体的核酸转录时可通过干扰与本发明的疾病状态相关的异常或过量蛋白翻译或转录来治疗眼部病症。例如，本发明的核酸可编码rna，所述rna通过对编码所述异常和/或过量蛋白的mrna的高度特异性清除或减少来治疗疾病。治疗性rna序列包括rnai、小抑制rna (sirna)、微rna(mirna)和/或核酶(如锤头核酶和发夹核酶)，其可通过对编码所述异常和/或过量蛋白质的mrna的高度特异性清除或减少来治疗疾病，所述蛋白质如遗传的视网膜退化的多种形式中存在的那些。可通过治疗性rna序列治疗的眼部病症的非限制性实例包括，例如常染色体显性视网膜色素变性(adrp)和糖尿病视网膜病变。可用于本发明的治疗性rna序列和编码这些序列的核酸的实例包括例如，美国专利号6,225,291中所述的那些，其公开内容通过提述以其整体并入本文。在一些实施方案中，所述治疗性rna序列是mir-708。在一些实施方案中，mir-708与编码野生型视紫红质的核酸组合使用，作为相同raav载体的一部分或者作为另一raav载体的一部分。在一些实施方案中，编码所述野生型视紫红质的核酸缺乏位于视紫红质基因的3’非翻译区中的mir-708靶序列。编码mir-708和/或视紫红质的raav载体由美国临时专利申请序号no.61/969,027提供，其通过提述以其整体并入本文。
[0780]
本发明的一些方面涉及raav颗粒(例如治疗载体)的用途，所述raav颗粒包含(a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和(b)raav载体，其包含所述异源核酸和至少一个aav末端重复。在一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性多肽或治疗性核酸。如本文所用的，治疗性核酸可表达本发明的任何治疗性核酸或编码本发明的治疗性多肽的任何核酸。例如，可使用治疗性核酸以改善病症的症状、防止或延迟病症的进展和/或提供对病症(例如本技术所述的病症)的治疗。
[0781]
cns的细胞的改进的转导可通过将raav载体在raav衣壳(例如raav2、raavrh8r等)中衣壳化来实现，其中所述衣壳的与hspg相互作用的一个或多个氨基酸被取代，从而降低或去除所述raav颗粒与hspg的结合。所述载体可包含编码多肽(例如治疗性或诊断性多肽)和/或治疗性核酸的异源核酸。编码治疗性或诊断性多肽和/或治疗性核酸的核酸可使用本领域已知的方法使用标准的合成和重组方法生成。在一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性多肽。在一些实施方案中，所述异源核酸编码诊断性多肽。在一些实施方案中，所述异源核酸编码cns相关的基因。
[0782]
在一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性核酸。在一些实施方案中，治疗性核酸可包括而不限于sirna、shrna、rnai、mirna、反义rna、核酶或脱氧核酶。如此，治疗性核酸可编码rna，所述rna在从所述载体的核酸转录时可通过干扰与本发明的病症相关的异常或过量蛋白转录或翻译来治疗本发明的病症(例如cns的病症)。例如，本发明的核酸可编码rna，所述rna通过对编码所述异常和/或过量蛋白的mrna的高度特异性消除或减少来治疗病症。治疗性rna序列包括rnai、小抑制rna(sirna)、微rna(mirna)和/或核酶(如锤头核酶和发夹核酶)，其可通过对编码所述异常和/或过量蛋白的mrna的高度特异性消除或减少来治疗病症。
[0783]
在一些实施方案中，所述异源核酸编码治疗性多肽。例如，治疗性多肽可提供多肽和/或酶活性，其在细胞或生物体中不存在或以降低的水平存在。或者，治疗性多肽可提供多肽和/或酶活性，其间接地抵消了细胞或生物体中的不平衡。例如，用于涉及由代谢酶或
活性的缺乏而引起的代谢物的积累的病症的治疗性多肽可提供丢失的代谢酶或活性，或其可提供导致代谢物减少的供选择的代谢酶或活性。例如，还可用治疗性多肽通过充当显性负性(dominant-negative)多肽来降低多肽的活性(例如过表达的、被功能获得型突变激活的、或其活性被以其他方式误调节的(misregulated))。
[0784]
在一些实施方案中，所述异源核酸编码选自如下的多肽：酶、神经营养因子、在患cns相关病症的个体中缺乏或突变的多肽、抗氧化剂、抗凋亡因子、抗血管生成因子和抗炎因子。此类多肽可用于通过如下来治疗cns的病症：例如提供在cns的病症中减少、不存在或误调节的多肽和/或酶活性，改善cns病症的病因和/或症状，和/或减轻由cns病症引起的对cns的损害(例如细胞凋亡、炎症或其他形式的细胞死亡)。编码治疗性多肽的核酸的非限制性实例包括：用于替换已知引起cns的病症的缺失或突变基因的核酸，例如prph2、rpe65、mertk、rpgr、rp2、rpgrip、cnga3、cngb3和gnat2。编码治疗性多肽的核酸的其他非限制性实例包括编码如下的那些：神经营养因子(如gdnf、cntf、fgf2、pedf、epo)、抗凋亡基因(如bcl2、bcl-x、nfκb)、抗血管生成因子(如内皮他汀、血管他汀、sflt)和抗炎因子(如il10、il1-ra、tgfβ、il4)。用于cns病症的其他治疗性多肽包括但不限于myo7a、abca4、rep1、gucy2d、pde6c、rs1、rpgrip、lpcat1、aipl1、rdh12、chm。在一些实施方案中，编码的多肽是所述多肽的人变体。在一些实施方案中，所述异源核酸编码神经元细胞凋亡抑制蛋白(naip)、神经生长因子(ngf)、神经胶质来源的生长因子(gdnf)、脑源性生长因子(bdnf)、睫状神经营养因子(cntf)、酪氨酸羟化酶(th)、gtp环化水解酶(gtpch)、氨基酸脱羧酶(aadc)、抗氧化剂、抗血管生成多肽、抗炎多肽和天冬氨酸酰基酶(aspa)。抗氧化剂的实例包括而不限于sod1；sod2；过氧化氢酶；sirtuins1、3、4或5；nrf2；pgc1a；gcl(催化亚基)；gcl(修饰亚基)；脂联素(adiponectin)；谷胱甘肽过氧化物酶1；和神经球蛋白(neuroglobin)。抗血管生成多肽的实例包括而不限于血管他汀、内皮他汀、pedf、可溶性vegf受体和可溶性pdgf受体。抗炎多肽的实例包括而不限于il-10、可溶性il17r、可溶性tnf-r、tnf-r-ig、il-1抑制剂和il18抑制剂。可用于治疗cns的病症的这些类型的其他例示性多肽在下文提供。
[0785]
本发明的核酸可编码多肽，所述多肽是细胞内蛋白、锚定于细胞膜中、保持在细胞内，或由用本发明的载体转导的细胞分泌。对于由接受载体的细胞分泌的多肽；所述多肽可为可溶的(即不附接于细胞)。例如，可溶的多肽缺乏跨膜区并从细胞分泌。鉴定并移除编码跨膜域的核酸序列的技术是本领域已知的。
[0786]
在一些实施方案中，所述异源核酸可操作地连接至启动子。例示性的启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子、rsv ltr、momlv ltr、磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子、猿猴病毒40(sv40)启动子、ck6启动子、甲状腺素转运蛋白启动子(ttr)、tk启动子、四环素响应性启动子(tre)、hbv启动子、haat启动子、lsp启动子、嵌合肝特异性启动子(lsp)、e2f启动子、端粒酶(htert)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β球蛋白启动子(cag启动子；niwa等，gene,1991,108(2):193-9)、延伸因子1-α启动子(ef1-α)启动子(kim等，gene,1990,91(2)：217-23和guo等，gene ther.,1996,3(9):802-10)。在一些实施方案中，所述启动子包含人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子或与鸡β-肌动蛋白(cba)启动子连接的巨细胞病毒增强子。所述启动子可以是组成型、诱导型或阻抑型启动子。在一些实施方案中，本发明提供重组载体，其包含编码本发明的异源转基因的核酸，所述核酸可操作地连接
至cba启动子。例示性的启动子和描述可见于例如u.s.pg pub.20140335054中。
[0787]
组成型启动子的实例包括而不限于逆转录病毒劳氏肉瘤病毒(rsv)ltr启动子(任选地与rsv增强子一起)、巨细胞病毒(cmv)启动子(任选地与cmv增强子一起)[参见例如boshart等，cell,41:521-530(1985)]、sv40启动子、二氢叶酸还原酶启动子、13-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(pgk)启动子和ef1a启动子[invitrogen]。
[0788]
诱导型启动子允许调节基因表达并能够经由如下来调节：外源供给的化合物，环境因子如温度，或特定生理状态的存在，例如急性期、细胞的特定分化状态或仅在正在复制的细胞中。诱导型启动子和诱导型系统可由多种商业来源得到，包括而不限于invitrogen、clontech和ariad。本领域技术人员已描述并能够容易地选择许多其他系统。由外源供给的启动子调节的诱导型启动子的实例包括锌诱导的羊金属硫蛋白(mt)启动子、地塞米松(dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)启动子、t7聚合酶启动子系统(wo 98/10088)；昆虫蜕皮激素启动子(no等，proc.natl.acad.sci.usa,93:3346-3351(1996))、四环素阻遏系统(gossen等，proc.natl.acad.sci.usa,89:5547-5551(1992))、四环素诱导系统(gossen等，science,268:1766-1769(1995)，另见harvey等，curr.opin.chem.biol.,2:512-518(1998))、ru486-诱导系统(wang等，nat.biotech.,15:239-243(1997)和wang等，gene ther.,4:432-441(1997))和雷帕霉素-诱导系统(magari等，j.clin.invest.,100:2865-2872(1997))。可用于此语境的其他类型的诱导性启动子是由特定的生理状态(例如温度、急性期、细胞的特定分化状态或仅在正在复制的细胞中)调节的那些。
[0789]
在另一个具体实施方案中，对转基因使用天然启动子或其片段。当转基因的表达应模拟天然表达是所需的时，可使用所述天然启动子。当转基因的表达必须暂时地或进行性地、或以组织特异性方式、或响应于特定的转录刺激物而受调节时，可使用所述天然启动子。在进一步的实施方案中，还可使用其他天然表达调控组件，如增强子组件、多腺苷酸化位点或kozak共有序列以模拟天然表达。
[0790]
在一些实施方案中，调控序列赋予组织特异性基因表达能力。在一些情况中，所述组织特异性调控序列结合组织特异性转录因子，其以组织特异性方式诱导转录。所述组织特异性调控序列(例如启动子、增强子等)是本领域熟知的。例示的组织特异性调控序列包括但不限于如下组织特异性启动子：神经元的如神经元-特异性烯醇化酶(nse)启动子(andersen等，cell.mol.neurobiol.,13:503-15(1993))、神经丝轻链基因启动子(piccioli等，proc.natl.acad.sci.usa,88:5611-5(1991))和神经元-特异性vgf基因启动子(piccioli等，neurons,15:373-84(1995))。在一些实施方案中，所述组织特异性启动子是选自如下的基因的启动子：神经元核(neun)、胶质纤维酸性蛋白(gfap)、腺瘤性结肠息肉病(apc)和离子化钙结合衔接分子1(iba-1)。其他适当的组织特异性启动子对于技术人员会是显而易见的。在一些实施方案中，所述启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。
[0791]
在一些实施方案中，所述异源核酸处于在cns的一种或多种细胞中表达的启动子序列的控制下。本领域已知上文列出的许多启动子序列(例如cba启动子)在cns的一种或多种细胞中表达。在一些实施方案中，所述启动子序列可在生物体中遍在地表达，且因而可在cns的一种或多种细胞中通过其向cns的递送来表达。在其他实施方案中，可使用在cns或一种或多种cns细胞的亚组中特异性表达的启动子序列。在一些实施方案中，所述异源核酸可操作地连接至适于治疗性多肽或治疗性核酸在cns的一种或多种细胞中表达的启动子。如
此，在一些实施方案中，本发明的治疗性多肽或治疗性核酸可用于治疗cns的病症。
[0792]
在一些实施方案中，所述启动子在脑细胞中表达所述异源核酸。脑细胞可指本领域已知的任何脑细胞，包括而不限于神经元(如感觉神经元、运动神经元、中间神经元、多巴胺能神经元、中型多棘神经元、胆碱能神经元、gaba能神经元、锥体神经元等)、神经胶质细胞(如小胶质细胞、大胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、室管膜细胞、放射状胶质细胞等)、脑实质细胞、小胶质细胞，室管膜细胞和/或浦肯野细胞。在一些实施方案中，所述启动子在神经元中表达所述异源核酸。在一些实施方案中，所述异源核酸仅在神经元中表达(例如在神经元中表达而不在cns的其他细胞如胶质细胞中表达)。
[0793]
在一些方面，本发明提供raav载体用于在哺乳动物中预防或治疗一个或多个基因缺陷(例如遗传的基因缺陷、体细胞基因改变等)，如例如导致受试者中多肽缺乏或多肽过量的基因缺陷的方法，或用于在受试者中治疗缺陷或降低缺陷的严重性或程度的方法，所述受试者显示出与细胞和组织中所述多肽的缺陷相联系的cns相关病症。在一些实施方案中，方法涉及将编码一个或多个治疗性肽、多肽、功能性rna、抑制核酸、shrna、微rna、反义核苷酸等的raav载体于药学上可接受的载体中施用于受试者，其施用的量和时间足以在患有或疑似患有cns相关病症的受试者中治疗所述病症。
[0794]
raav载体可包含转基因、编码蛋白或功能性rna的核酸，其调节或治疗cns相关病症。如下是与cns相关病症相关的基因的非限制性的列表：神经元细胞凋亡抑制蛋白(naip)、神经生长因子(ngf)、神经胶质来源的生长因子(gdnf)、脑源性生长因子(bdnf)、睫状神经营养因子(cntf)、酪氨酸羟化酶(th)、gtp环化水解酶(gtpch)、天冬氨酸酰基酶(aspa)、超氧化物歧化酶(sod1)、抗氧化剂，抗血管生成多肽、抗炎多肽，和氨基酸脱羧酶(aadc)。例如，在帕金森氏病的治疗中有用的转基因编码th，其是多巴胺的合成中的限速酶。在帕金森氏病的治疗中还可使用编码gtpcii的转基因，其生成tii辅因子四氢生物蝶呤。还可用编码gdnf或bdnf或aadc的转基因来治疗帕金森氏病，所述转基因促进l-dopa至da的转化。对于als的治疗而言，有用的转基因可编码：gdnf、bdnf或cntf。同样对于als的治疗而言，有用的转基因可编码功能性rna，例如shrna、mirna，其抑制sod1的表达。对于缺血的治疗，有用的转基因可编码naip或ngf。编码β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)的转基因可用于治疗一些溶酶体贮积症(例如粘多糖病类型vii(mps vii))。编码前药激活基因(例如hsv-胸苷激酶，其将更昔洛韦(ganciclovir)转化为破坏dna合成并导致细胞死亡的毒性核苷酸)的转基因可用于治疗一些癌症，例如，当与所述前药组合施用时。编码内源性阿片样物质(opioid)如β-内啡肽的转基因可用于治疗疼痛。抗氧化剂的实例包括而不限于sod1；sod2；过氧化氢酶；sirtuins 1、3、4或5；nrf2；pgc1a；gcl(催化亚基)；gcl(修饰亚基)；脂联素；谷胱甘肽过氧化物酶1；和神经球蛋白。抗血管生成多肽的实例包括而不限于血管他汀、内皮他汀、pedf、可溶性vegf受体和可溶性pdgf受体。抗炎多肽的实例包括而不限于il-10、可溶性il17r、可溶性tnf-r、tnf-r-ig、il-1抑制剂和il18抑制剂。可用于本发明的raav载体的转基因的其他实例对于技术人员是显而易见的(参见例如costantini l c，等，gene therapy(2000)7,93-109)。
[0795]
在一些实施方案中，所述治疗性多肽或治疗性核酸用于治疗cns的病症。不愿受理论束缚，认为治疗性多肽或治疗性核酸可用于减少或消除多肽的表达和/或活性，所述多肽的功能获得已与病症相关，或用于增强多肽的表达和/或活性以补足与病症相关的缺陷(例
如其表达显示出相似或相关活性的基因中的突变)。可通过本发明的治疗性多肽或治疗性核酸治疗的本发明的病症的非限制性实例(对于每种病症，可被靶向或供给的例示性基因提供于括号中)包括中风(例如半胱天冬酶-3、beclin1、ask1、par1、hif1α、puma和/或fukuda,a.m.和badaut,j.(2013)genes(basel)4:435-456中所述的任何基因)、亨廷顿氏病(突变体htt)、癫痫(例如，scn1a、nmdar、adk和/或boison,d.(2010)epilepsia 51:1659-1668中所述的任何基因)、帕金森氏病(α-突触核蛋白)、lou gehrig氏病(亦称为肌萎缩侧索硬化；sod1)、阿尔茨海默氏病(tau，淀粉样前体蛋白质)、皮质基底变性或cbd(tau)、皮质基底神经节变性或cbgd(tau)、额颞叶痴呆或ftd(tau)、进行性核上麻痹或psp(tau)、多系统萎缩或msa(α-突触核蛋白)、脑的癌症(例如脑癌中涉及的突变或过表达的癌基因)，和溶酶体贮积病(lsd)。本发明的病症可包括涉及大面积的皮质，例如多于一个的皮质功能区域、多于一个的皮质叶(lobe)和/或整个皮质。本发明的病症的其他非限制性实例可由本发明的治疗性多肽或治疗性核酸治疗，其包括外伤性脑损伤、酶功能障碍病症，精神病症(包括创伤后应激综合征)、神经退化性疾病和认知病症(包括痴呆症、自闭症和抑郁症)。酶功能障碍病症包括而不限于脑白质营养不良(包括canavan氏病)和下述的任何溶酶体贮积病。
[0796]
在一些实施方案中，所述治疗性多肽或治疗性核酸用于治疗溶酶体贮积病。如本领域中通常已知的，溶酶体贮积病是罕见的、特征为溶酶体功能缺陷的遗传性代谢病症。所述病症常常由正常的粘多糖、糖蛋白和/或脂质代谢所需的酶的缺乏引起，导致溶酶体储存的细胞材料的病理学积累。可用本发明的治疗性多肽或治疗性核酸治疗的本发明的溶酶体贮积病的非限制性实例(对于每种病症可被靶向或提供的例示性基因提供于括号中)包括戈谢病2型或3型(酸性β-葡糖苷酶，gba)、gm1神经节苷脂贮积症(β-半乳糖苷酶-1，glb1)、亨特病(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶，ids)、克拉伯病(半乳糖基神经酰胺酶，galc)、甘露糖苷贮积症(甘露糖苷酶，如α-d-甘露糖苷酶，man2b1)、β甘露糖苷贮积症(β-甘露糖苷酶，manba)、异染性脑白质营养不良症(假芳基硫酸酯酶a，arsa)、粘脂病ii/iii疾病(n-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶，gnptab)、尼曼-皮克病a(酸性鞘磷脂酶，asm)、尼曼-皮克病c(尼曼-皮克c蛋白质，npc1)、蓬佩病(酸性α-1,4-葡糖苷酶，gaa)、桑德霍夫病(己糖胺酶β亚基，hexb)、圣菲利柏氏症a(n-磺基葡糖胺磺基水解酶(n-sulfoglucosamine sulfohydrolase)，mps3a)、圣菲利柏氏症b(n-α-乙酰葡糖胺酶，naglu)、圣菲利柏氏症c(肝素乙酰coa:α-葡糖胺酶n-乙酰转移酶，mps3c)、圣菲利柏氏症d(n-乙酰葡糖胺-6-硫酸酯酶，gns)、辛德勒病(α-n-乙酰半乳糖胺酶，naga)、史莱氏症(β-葡糖醛酸糖苷酶，gusb)、泰-萨二氏病(己糖胺酶α亚基，hexa)和沃尔曼病(溶酶体酸性脂肪酶，lipa)。
[0797]
其他的溶酶体贮积症以及与每个疾病相关的缺陷的酶列于下表1中。在一些实施方案中，下表中所列的疾病通过本发明的治疗性多肽或治疗性核酸治疗，其补足或以其他方式补偿相应的酶缺陷。
[0798]
表1.溶酶体贮积症及相关的缺陷型酶
[0799][0800][0801]
亨廷顿氏病
[0802]
疾病(其中载体可能是有利的)的一个实例是亨廷顿氏病(hd)，其由编码突变体亨廷顿蛋白(mhtt)中扩展的聚谷氨酰胺(polyq)重复的cag重复扩展突变引起。hd对于基于dna和rna的治疗是有吸引力的靶标，因为它是由单个等位基因的突变引起的常染色体显性
tapping task)和符号数字模式测试(symbol digit modalities test)。
[0807]
在本发明的一些方面中，所述方法和组合物用于治疗患有hd的人。如上所述，hd以常染色体显性方式遗传并由htt基因中的cag重复扩展引起。青少年发病hd最经常从父系方继承。亨廷顿病-样表型也与其它遗传基因座相关，如hdl1、prnp、hdl2、hdl3和hdl4。认为其它遗传基因座可修饰hd症状的表现，包括grin2a、grin2b、msx1、grik2和apoe基因中的突变。
[0808]
raav组合物
[0809]
在一些方面，本发明提供包含任何本文所述的raav颗粒的组合物。通常，用于本发明的方法和系统的组合物包含有效量的raav颗粒，其包含编码多肽和/或rna的raav载体，任选地在药学上可接受的赋形剂中。所述病毒颗粒包含aav衣壳(例如aav2或aavrh8r衣壳)，其中与hspg相互作用的一个或多个氨基酸被取代从而减少或去除raav颗粒与hspg的结合。如本领域中熟知的，药学上可接受的赋形剂是相对惰性的物质，其促进药理学有效物质的施用并可作为液体溶液或悬浮物、作为乳剂、或作为使用前适于溶解或悬浮于液体中的固体形式提供。例如，赋形剂可给予形式或稠度，或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂和乳化剂、用于改变渗透性的盐、包囊剂、ph缓冲物质和缓冲液。所述赋形剂包括适于直接递送至眼的任何药剂，其可被施用而无过度的毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨醇，多种tween化合物中的任一种，和液体，如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐可包含在其中，例如，无机酸盐如氢氯化物、氢溴化物、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。药学上可接受的赋形剂的全面讨论可在remington’spharmaceutical sciences(mack pub.co.,n.j.1991)中获得。
[0810]
通常，这些组合物经配制用于通过视网膜下注射施用。因此，这些组合物可与药学上可接受的运载体如盐水、林格氏(ringer’s)平衡盐溶液(ph 7.4)等组合。虽然并非必需的，所述组合物可任选地以适于施用精确量的单位剂量形式供给。
[0811]
视网膜下递送raav的方法
[0812]
视网膜下递送的方法是本领域已知的。例如参见wo 2009/105690，其通过提述并入本文。简单地，用于将raav颗粒(例如raav2、raavrh8r等颗粒)递送至黄斑和凹的视网膜下的一般方法可通过如下简单概要来说明。此实施例仅仅意欲说明所述方法的某些特征，而并非意在限制。
[0813]
通常，可将所述raav载体以眼内(视网膜下)注射的组合物的形式在使用手术显微镜的直接观察下递送。在一些实施方案中，所述载体在raav颗粒中衣壳化，其中所述raav颗粒包含raav衣壳，所述raav衣壳包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用(例如抑制或去除hspg结合)的一个或多个位置处；和raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。此步骤可涉及玻璃体切割术，然后使用精细套管通过一个或多个小视网膜切口将raav载体悬浮物注射入视网膜下空间。
[0814]
简言之，可以在适当位置缝合输注套管以通过在整个操作中输注(例如，盐水)维持正常的球体积。使用适当孔尺寸的套管(例如20至27号)进行玻璃体切割，其中移出的玻璃体凝胶的所述体积通过输注来自输注套管的盐水或其他等渗溶液替代。有利的进行玻璃体切割术，是因为(1)去除它的皮质(玻璃样后膜)促进通过所述套管的视网膜渗透；(2)其
去除和用流体(例如盐水)替换创造了空间以容纳载体的眼内注射，和(3)其的受控去除降低了视网膜撕裂和计划外的视网膜脱落的可能性。
[0815]
在一些实施方案中，通过利用适当孔径(例如27-45号)的套管将所述raav组合物直接注射入中央视网膜外的视网膜下空间，因而在视网膜下空间创建泡(bleb)。在其他实施方案中，在视网膜下注射raav组合物之前将小体积(例如约0.1至约0.5ml)的适当的流体(如盐水或林格氏溶液)视网膜下注射入中央视网膜外的视网膜下空间。此种初始的进入视网膜下空间的注射建立了视网膜下空间内的初始流体泡，引起在初始泡的位置处的局部视网膜脱落。此初始流体泡能够促进将raav组合物靶向递送至视网膜下空间(通过在raav递送前限定注射平面(plane of injection)，并使可能的raav施用进入脉络膜和raav注射或回流入玻璃体腔的可能性最小化。在一些实施方案中，可以进一步用流体注射该初始流体泡，所述流体包含一个或多个的raav组合物和/或一种或多种另外的治疗剂，这通过将这些流体用相同或其他的细孔套管直接施用于初始流体泡来进行。
[0816]
所述raav组合物和/或初始小体积流体的眼内施用可使用附接于注射器的细孔套管(例如27-45号)来进行。在一些实施方案中，此注射器的柱塞可由机械化的设备(如通过脚踏踏板的压力)驱动。所述细孔套管穿过巩膜前进，穿过玻璃体腔并根据被靶向的视网膜的区域(但在中央视网膜外)进入视网膜处于每个受试者中预先确定的位点。在直接目测下，用自密封非膨胀性视网膜切开术将载体悬浮物机械注入感觉神经性视网膜，引起局部的视网膜脱落。如上所述，可将所述raav组合物直接注射入创建中央视网膜外泡的视网膜下空间或者可将所述载体注射入中央视网膜外的初始泡，引起其膨胀(并使视网膜脱落的区域扩展)。在一些实施方案中，注射raav组合物然后将另一流体注射入所述泡。
[0817]
不愿受理论束缚，视网膜下注射的速率和位置可导致局部化剪切力，其能够损害黄斑、凹和/或下方的rpe细胞。所述视网膜下注射可以以这样的速率进行，所述速率使剪切力最小化或避免剪切力。在一些实施方案中，所述raav组合物在约15-17分钟注射。在一些实施方案中，所述载体在约17-20分钟注射。在一些实施方案中，所述raav组合物在约20-22分钟注射。在一些实施方案中，所述raav组合物以约35至约65μl/分钟的速率注射。在一些实施方案中，所述raav组合物以约35μl/分钟的速率注射。在一些实施方案中，所述raav组合物以约40μl/分钟的速率注射。在一些实施方案中，所述raav组合物以约45μl/分钟的速率注射。在一些实施方案中，所述raav组合物以约50μl/分钟的速率注射。在一些实施方案中，所述raav组合物以约55μl/分钟的速率注射。在一些实施方案中，所述raav组合物以约60μl/分钟的速率注射。在一些实施方案中，所述raav组合物以约65μl/分钟的速率注射。本领域的普通技术人员会认识到，泡的注射的速率和时间可取决于：例如产生足够的视网膜脱落以接近中央视网膜的细胞所需的泡的大小或raav组合物的体积、用于递送所述raav组合物的套管的大小和安全地维持本发明的套管的位置的能力。
[0818]
在本发明的一些具体实施方案中，注射至视网膜的视网膜下空间的组合物的体积是大于约1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl、或1ml的任一项，或其之间的任何量。
[0819]
在一些实施方案中，所述方法包括将有效量的重组病毒颗粒施用于眼部(例如通过视网膜下和/或玻璃体内施用)，所述病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸
取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，所述病毒颗粒还包含编码异源核酸的载体。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价为至少约5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
、9
×
10
12
、10
×
10
12
、11
×
10
12
、15
×
10
12
、20
×
10
12
、25
×
10
12
、30
×
10
12
、或50
×
10
12
基因组拷贝/ml的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价为约5
×
10
12
至6
×
10
12
、6
×
10
12
至7
×
10
12
、7
×
10
12
至8
×
10
12
、8
×
10
12
至9
×
10
12
、9
×
10
12
至10
×
10
12
、10
×
10
12
至11
×
10
12
、11
×
10
12
至15
×
10
12
、15
×
10
12
至20
×
10
12
、20
×
10
12
至25
×
10
12
、25
×
10
12
至30
×
10
12
、30
×
10
12
至50
×
10
12
、或50
×
10
12
至100
×
10
12
基因组拷贝/ml的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价为约5
×
10
12
至10
×
10
12
、10
×
10
12
至25
×
10
12
、或25
×
10
12
至50
×
10
12
基因组拷贝/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价为至少约5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、10
×
109、11
×
109、15
×
109、20
×
109、25
×
109、30
×
109或50
×
109转导单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价为约5
×
109至6
×
109、6
×
109至7
×
109、7
×
109至8
×
109、8
×
109至9
×
109、9
×
109至10
×
109、10
×
109至11
×
109、11
×
109至15
×
109、15
×
109至20
×
109、20
×
109至25
×
109、25
×
109至30
×
109、30
×
109至50
×
109或50
×
109至100
×
109转导单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价为约5
×
109至10
×
109、10
×
109至15
×
109、15
×
109至25
×
109、或25
×
109至50
×
109转导单位/ml中的任何。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价为至少约5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、10
×
10
10
、11
×
10
10
、15
×
10
10
、20
×
10
10
、25
×
10
10
、30
×
10
10
、40
×
10
10
、或50
×
10
10
感染单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价为至少约5
×
10
10
至6
×
10
10
、6
×
10
10
至7
×
10
10
、7
×
10
10
至8
×
10
10
、8
×
10
10
至9
×
10
10
、9
×
10
10
至10
×
10
10
、10
×
10
10
至11
×
10
10
、11
×
10
10
至15
×
10
10
、15
×
10
10
至20
×
10
10
、20
×
10
10
至25
×
10
10
、25
×
10
10
至30
×
10
10
、30
×
10
10
至40
×
10
10
、40
×
10
10
至50
×
10
10
、或50
×
10
10
至100
×
10
10
感染单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价为至少约5
×
10
10
至10
×
10
10
、10
×
10
10
至15
×
10
10
、15
×
10
10
至25
×
10
10
、或25
×
10
10
至50
×
10
10
感染单位/ml中的任一项。
[0820]
在一些实施方案中，所述方法包括将有效量的重组病毒颗粒施用于个体(例如人)的眼部(例如通过视网膜下和/或玻璃体内施用)，所述病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，施用于所述个体的病毒颗粒的剂量为至少约1
×
108至约1
×
10
13
基因组拷贝/kg体重中的任一项。在一些实施方案中，施用于所述个体的病毒颗粒的剂量为约1
×
108至约1
×
10
13
基因组拷贝/kg体重中的任一项。
[0821]
可以产生一个或多个(例如2、3或更多个)泡。通常，由本发明的系统和方法产生泡的总体积不能超过眼睛的流体体积，例如在典型的人受试者中为约4ml。每个单独泡的总体积可为至少约0.3ml，或至少约0.5ml，以促进足够尺寸的视网膜脱落以暴露中央视网膜的细胞类型并产生对于最佳操纵有足够依赖性的泡。本领域的普通技术人员会理解，在根据本发明的系统和方法产生泡时必须维持适当的眼内压以避免对眼结构的损坏。每个个体泡的大小可以是例如约0.5至约1.2ml，约0.8至约1.2ml，约0.9至约1.2ml，约0.9至约1.0ml，约1.0至约2.0ml，约1.0至约3.0ml。因此，在一个实例中，为了注射总共3ml的raav组合物悬浮液，可建立每个约1ml的3个泡。组合中所有泡的总体积可以是例如约0.5至约3.0ml，约0.8至约3.0ml，约0.9至约3.0ml，约1.0至约3.0ml，约0.5至约1.5ml，约0.5至约1.2ml，约
0.9至约3.0ml，约0.9至约2.0ml，约0.9至约1.0ml。
[0822]
为了安全地和有效地转导泡的原始位置的边缘以外的靶视网膜(例如中央视网膜)区域，可操纵泡以将泡复位位于转导的目标区域。泡的操纵可通过泡的依赖性而发生，所述依赖性由泡的体积、含有泡的眼的复位、用含有一个或多个泡的眼睛对人的头部的复位和/或通过流体空气交换而产生。这与中央视网膜特别相关，因为此区域通常通过视网膜下注射而抵抗剥离。在一些实施方案中，用流体-空气交换来复位位泡；来自输注套管的流体暂时由空气置换，例如由空气吹到视网膜的表面上。随着空气的体积从视网膜的表面置换玻璃体腔流体，玻璃体腔中的流体可流出套管。暂时缺乏来自玻璃体腔流体的压力使泡移动并受重力作用吸引至眼的从属部分。通过适当定位眼球，视网膜下raav组合物的泡被操纵以影响到邻近区域(例如黄斑和/或凹)。在一些情况中，所述泡的质量足以导致其受重力作用吸引，即使没有使用流体-空气交换。可通过改变受试者的头部位置以进一步促进泡移动至所需位置从而促进所述泡受重力作用吸引至眼的所需位置。一旦实现泡的所需配置，流体返回到玻璃体腔。该流体是适当的流体，例如新鲜的盐水。通常，视网膜下raav组合物可留在原位而无需对视网膜切开进行视网膜填充(retinotomy)且无需眼内填充(intraocular tamponade)，而视网膜会自发在约48小时内重新附接。
[0823]
通过安全而有效地用包含治疗性多肽或rna序列的载体转导眼细胞(例如黄斑和/或凹的rpe和/或感光细胞)，本发明的方法可用于治疗个体；例如患有眼部病症的人，其中转导的细胞产生足以治疗所述眼部病症的量的治疗性多肽或rna序列。在一些实施方案中，眼细胞的转导可通过使用包含aav衣壳蛋白的raav颗粒(例如raav2、raavrh8r等颗粒)来改进，所述aav衣壳蛋白包含氨基酸的一个或多个取代，所述氨基酸与hspg相互作用(例如抑制或去除与hspg的结合)。在一些实施方案中，所述raav颗粒显示出与hspg的降低的结合；例如降低大于约10％、25％、50％、75％、100％或其间的任何数目。在一些实施方案中，raav与hspg的结合降低约5％至约100％，约10％至约50％，约10％至约30％，约25％至约75％，约25％至约50％或约30％至约50％。
[0824]
取决于治疗的目的，施用有效量的raav(在一些实施方案中为颗粒的形式)。例如当低百分比的转导能实现所需的治疗效果时，则治疗的目的通常在于满足或超过此转导水平。在一些情况中，此转导水平可通过仅转导约1至5％的靶细胞来达到，在一些实施方案中为所需的组织类型的至少约20％的细胞，在一些实施方案中为至少约50％，在一些实施方案中为至少约80％，在一些实施方案中为至少约95％，在一些实施方案中为所需的组织类型的至少约99％的细胞。如上文所讨论的，raav衣壳的与hspg相互作用的一个或多个氨基酸的取代改进raav转导。作为指导，每次注射施用的颗粒的数目通常为约1x106至约1x10
14
颗粒，约1x107至1x10
13
颗粒、约1x109至1x10
12
颗粒或约1x10
11
颗粒。所述raav组合物可通过在同一步骤过程中或间隔数天、数周、数月或数年的一次或多次视网膜下注射来施用。在一些实施方案中，多个载体可用于治疗人。
[0825]
在一些实施方案中，对视网膜施用有效量的raav病毒颗粒转导施用位点或其附近的感光细胞，所述病毒颗粒包含raav衣壳，其具有与hspg相互作用的氨基酸的一个或多个取代。在一些实施方案中，转导了多于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或100％的任一项的感光细胞。在一些实施方案中，转导了约5％至约100％、约10％至约50％、约10％至约30％、约25％至约75％、约25％至约
50％、或约30％至约50％的感光细胞。鉴定由aav病毒颗粒转导的感光细胞的方法是本领域已知的，所述病毒颗粒包含raav衣壳，其具有与hspg相互作用的氨基酸的一个或多个取代；例如免疫组化或使用标记物，如增强的绿色荧光蛋白可用于检测病毒颗粒的转导，所述病毒颗粒包含raav衣壳，其具有与hspg相互作用的氨基酸的一个或多个取代。
[0826]
在本发明的一些实施方案中，所述方法包括将有效量的raav病毒颗粒施用于哺乳动物的视网膜下(例如视网膜下空间)用于治疗患眼部病症的个体(例如患眼部病症的人)，所述病毒颗粒包含raav衣壳，其具有与hspg相互作用的氨基酸的一个或多个取代。在一些实施方案中，将所述组合物注射至视网膜下中的一个或多个位置以允许在感光细胞中表达异源核酸。在一些实施方案中，将所述组合物注射入视网膜下的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十个或多于十个位置的任一项中。
[0827]
在一些实施方案中，将所述raav病毒颗粒同时或序贯施用于多于一个位置，所述病毒颗粒包含raav衣壳，其具有与hspg相互作用的氨基酸的一个或多个取代。在一些实施方案中，raav病毒颗粒的多次注射间隔不多于一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、九小时、十二小时或24小时。
[0828]
玻璃体内注射的方法
[0829]
用于玻璃体内注射的一般方法可通过如下简要概述来说明。此实例仅意在说明本方法的一些特征，而不意在进行限制。用于玻璃体内注射的步骤是本领域已知的(参见例如peyman,g.a等.(2009)retina 29(7):875-912和fagan,x.j和al-qureshi,s.(2013)clin.experiment.ophthalmol.41(5):500-7)。
[0830]
简言之，玻璃体内注射的受试者可准备进行瞳孔扩张、眼的消毒和施用麻醉的步骤。本领域已知的任何合适的散瞳剂均可用于瞳孔扩张。可在治疗前证实充分散瞳。灭菌可通过消毒的眼治疗例如含碘溶液如聚维酮碘实现。还可用类似的方案来清洁眼睑、睫毛和附近的任何其他组织(例如皮肤)。可以任何适当的浓度来使用任何合适的麻醉剂，如利多卡因或丙美卡因。麻醉剂可通过本领域已知的任何方法施用，包括但不限于局部滴剂(drop)、凝胶(gel)或胶状物(jelly)，和结膜下施用麻醉剂。
[0831]
在注射前，可将灭菌的眼睑窥器用于清除(clear)所述区域的睫毛。注射的位点可用注射器标记。注射的位点可基于患者的晶状体(lens)来选择。例如，注射位点可距离人工晶状体眼或无晶状体眼患者中的(角膜)缘(limbus)3-3.5mm，和距有晶状体眼患者中的(角膜)缘3.5-4mm。所述患者可看向注射位点相反的方向。
[0832]
在一些实施方案中，所述方法包括将有效量的重组病毒颗粒施用于眼部(例如通过视网膜下和/或玻璃体内施用)，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代且包含编码异源核酸的载体，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是至少约5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
、9
×
10
12
、10
×
10
12
、11
×
10
12
、15
×
10
12
、20
×
10
12
、25
×
10
12
、30
×
10
12
、或50
×
10
12
基因组拷贝/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是约5
×
10
12
至6
×
10
12
、6
×
10
12
至7
×
10
12
、7
×
10
12
至8
×
10
12
、8
×
10
12
至9
×
10
12
、9
×
10
12
至10
×
10
12
、10
×
10
12
至11
×
10
12
、11
×
10
12
至15
×
10
12
、15
×
10
12
至20
×
10
12
、20
×
10
12
至25
×
10
12
、25
×
10
12
至30
×
10
12
、30
×
10
12
至50
×
10
12
、或50
×
10
12
至100
×
10
12
基因组拷贝/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是约5
×
10
12
至10
×
10
12
、10
×
10
12
至25
×
10
12
、或25
×
10
12
至50
×
10
12
基因组拷贝/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是至少约5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、10
×
109、11
×
109、15
×
109、20
×
109、25
×
109、30
×
109、或50
×
109转导单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是约5
×
109至6
×
109、6
×
109至7
×
109、7
×
109至8
×
109、8
×
109至9
×
109、9
×
109至10
×
109、10
×
109至11
×
109、11
×
109至15
×
109、15
×
109至20
×
109、20
×
109至25
×
109、25
×
109至30
×
109、30
×
109至50
×
109或50
×
109至100
×
109转导单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是约5
×
109至10
×
109、10
×
109至15
×
109、15
×
109至25
×
109、或25
×
109至50
×
109转导单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价为至少约5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、10
×
10
10
、11
×
10
10
、15
×
10
10
、20
×
10
10
、25
×
10
10
、30
×
10
10
、40
×
10
10
、或50
×
10
10
感染单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是至少约5
×
10
10
至6
×
10
10
、6
×
10
10
至7
×
10
10
、7
×
10
10
至8
×
10
10
、8
×
10
10
至9
×
10
10
、9
×
10
10
至10
×
10
10
、10
×
10
10
至11
×
10
10
、11
×
10
10
至15
×
10
10
、15
×
10
10
至20
×
10
10
、20
×
10
10
至25
×
10
10
、25
×
10
10
至30
×
10
10
、30
×
10
10
至40
×
10
10
、40
×
10
10
至50
×
10
10
、或50
×
10
10
至100
×
10
10
感染单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价为至少约5
×
10
10
至10
×
10
10
、10
×
10
10
至15
×
10
10
、15
×
10
10
至25
×
10
10
、或25
×
10
10
至50
×
10
10
感染单位/ml中的任一项。
[0833]
在一些实施方案中，所述方法包括将有效量的重组病毒颗粒施用于个体(例如人)的眼(例如经由视网膜下和/或玻璃体内施用)，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，施用于所述个体的病毒颗粒的剂量为至少约1
×
108至约1
×
10
13
基因组拷贝/kg体重中的任一项。在一些实施方案中，施用于所述个体的病毒颗粒的剂量为约1
×
108至约1
×
10
13
基因组拷贝/kg体重中的任一项。
[0834]
在注射过程中，可将针垂直插入巩膜并指向眼的中央。可插入针使得尖端结束于玻璃体而非视网膜下空间。可使用本领域已知用于注射的任何合适的体积。注射后，可用灭菌剂如抗生素处理眼。还可冲洗眼以去除过量的灭菌剂。
[0835]
视网膜的结构和测定raav递送的有效性的手段
[0836]
已知视网膜含有多层。视网膜中的细胞层可包括内界膜、神经纤维、神经节细胞、内网、内核、外网、外核、外界膜、感光细胞和视网膜色素上皮层。最接近玻璃体的层是内界膜。此层可含有m
ü
ller细胞，其为一类神经胶质细胞。神经纤维层可含有来自形成视神经的神经节细胞的轴突。神经节细胞层可包括神经节细胞和无长突细胞。内网层可含有神经节和无长突细胞的树突之间的突触和双极细胞的轴突。内核层可含有无长突、双极和水平细胞的细胞核。外网层可含有水平细胞树突和感光细胞突起物(projections)之间的突触。外核层可含有感光细胞体。外部或外界膜可包括m
ü
ller细胞顶突过程中和这些过程与感光细胞内段之间的细胞联系，如黏附连接和桥粒。感光细胞层也称为视杆细胞和视锥细胞和jacob膜层，其可含有感光细胞，包括视杆细胞和视锥细胞。视网膜层距玻璃体最远的是视网膜色素上皮(rpe)，其可包括含有色素颗粒的六角形的上皮细胞的层。
[0837]
还已知视网膜含有许多不同的细胞类型。视网膜神经元可包括感光细胞、双极细胞、神经节细胞、无长突细胞和水平细胞。感光细胞是对光敏感的。它们可感受光并通过将信号通过双极细胞和神经节细胞传递至视神经来响应。感光细胞可包括视杆细胞(其一般
在低光条件下感受光)和视锥细胞(其一般感受颜色和更明亮的光感)。双极细胞可接收来自感光细胞和无长突细胞或神经节细胞上的突触的输入。神经节细胞可接收来自无长突细胞或水平细胞的信息，而且它们的轴突形成视神经。水平细胞可整合来自多个感光细胞的输入并有助于调节至光水平。无长突细胞是中间神经元，其帮助调节双极细胞并将输入提供至神经节细胞。神经胶质视网膜的细胞可包括m
ü
ller细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。
[0838]
通过视网膜下或玻璃体内注射的raav递送效果可通过如本文所述的几个标准监测。例如，使用本发明的方法在受试者中处理后，可通过一个或多个临床参数(包括本文所述的那些)来评估受试者的例如在疾病状态的一个或多个迹象或症状的改善和/或稳定和/或进展延迟。所述测试的实例是本领域已知的，且包括客观和主观(例如受试者报告的)量度。例如，为了测量治疗对受试者的视觉功能的有效性，可以评价如下的一项或多项：受试者的主观视觉质量或改进的中央视觉功能(例如受试者流畅阅读和识别面孔的能力的改进)，受试者的视觉活动性(例如通行迷宫所需的时间减少)，视敏度/视力(例如，受试者的logmar评分的改进)，微视野检查(例如受试者的db评分的改进)，暗适应视野检查(例如受试者的db评分的改进)，精细矩阵映像(例如受试者的db评分的改进)，goldmann视野检查(例如减少的盲点区域(即盲区)的大小和解析较小目标的能力的改进)，闪烁的敏感性(例如hertz的改进)，自发荧光，和电生理学测量(例如erg的改进)。在一些实施方案中，通过受试者的视觉活动性测量视觉功能。在一些实施方案中，通过受试者的视敏度/视力测量视觉功能。在一些实施方案中，通过微视野检查测量视觉功能。在一些实施方案中，通过暗适应视野检查测量视觉功能。在一些实施方案中，通过erg测量视觉功能。在一些实施方案中，通过受试者的主观视觉质量测量视觉功能。
[0839]
在导致进展的退化性视觉功能的疾病的情况下，在早期治疗受试者不仅可导致减慢或停止疾病进展，它也可以改善或防止由于后天弱视导致的视觉功能损失。弱视可为两类。在非人灵长类动物和小猫的研究中，它们从出生直到几个月龄保持在完全黑暗中，所述动物即使后续暴露于光也成为功能上不可逆的失明，尽管有由视网膜发送的功能信号。此失明的发生是因为神经连接和对皮层的“教育”由于刺激停止而从出生开始就在发育上停止。这个功能是否能恢复是未知的。在视网膜退化疾病的情况下，正常的视觉皮层回路最初是“学习的”或发育上适当的，直至退化产生的显著功能障碍的点。在功能障碍的眼的信号传导中视觉刺激的损失产生“获得的”或“习得的”功能障碍(“后天弱视”)，导致大脑无法解释信号，或“使用”该眼。在“后天弱视”的这些情况中未知的是，作为弱视眼的基因治疗的结果，改进的来自视网膜的信号传导除了使疾病状态稳定或减慢其进展之外，是否可导致更多正常功能的获得。在一些实施方案中，治疗的人小于30岁。在一些实施方案中，治疗的人小于20岁。在一些实施方案中，治疗的人小于18岁。在一些实施方案中，治疗的人小于15岁。在一些实施方案中，治疗的人小于14岁。在一些实施方案中，治疗的人小于13岁。在一些实施方案中，治疗的人小于12岁。在一些实施方案中，治疗的人小于10岁。在一些实施方案中，治疗的人小于8岁。在一些实施方案中，治疗的人小于6岁。
[0840]
在一些眼部病症中，存在“哺育细胞”现象，其中一类细胞的功能的改进可改进另一类细胞的功能。例如，通过本发明的raav转导中央视网膜的rpe可以改进视杆细胞的功能，而视杆细胞功能的改进又导致视锥细胞功能的改进。因此，对一个细胞类型的治疗可导致另一个细胞类型中功能的改进。
[0841]
特定的raav载体和组合物的选择取决于许多不同的因素，包括但不限于个体人的病史和被治疗的病况及个体特征。这些特征的评价和适当的治疗方案的设计最终是处方医师的责任。
[0842]
在一些实施方案中，待治疗的人患有遗传的眼部病症但还未显示出临床的迹象或症状。在一些实施方案中，待治疗的人患有眼部病症。在一些实施方案中，待治疗的人显示出眼部病症的一个或多个迹象或症状。
[0843]
可通过本发明的系统和方法治疗的眼部病症的非限制性实例包括：常染色体隐性重度早发型视网膜变性(leber氏先天性黑矇)、先天性全色盲、斯塔加特氏病、贝斯特氏病、doyne氏病、锥体营养不良、视网膜色素变性、x连锁视网膜劈裂症、usher氏综合征、年龄相关性黄斑变性、萎缩性年龄相关性黄斑变性、新生血管性amd、糖尿病性黄斑病变、增生性糖尿病性视网膜病(pdr)、囊样黄斑水肿、中心性浆液性视网膜病、视网膜脱落、眼内炎、青光眼、后葡萄膜炎、无脉络膜症(choroideremia)，和leber遗传性视神经病变。
[0844]
本发明的组合物(例如用于视网膜下或玻璃体内递送aav病毒颗粒，所述aav病毒颗粒包含aav衣壳，所述aav衣壳具有氨基酸的一个或多个取代，所述氨基酸与hspg相互作用或位于对应于氨基酸484、487、532、585或588的一个或多个位置)可单独或与用于治疗眼部病症的一种或多种另外的治疗剂组合使用。序贯施用之间的间隔可以至少(或可替换地少于)数分钟、数小时或数天为单位。
[0845]
在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂可施用于视网膜下或玻璃体(例如通过玻璃体内施用)。另外的治疗剂的非限制性实例包括多肽神经营养因子(例如gdnf、cntf、bdnf、fgf2、pedf、epo)，多肽抗血管生成因子(例如sflt、血管他汀、内皮他汀)，抗血管生成核酸(例如sirna、mirna、核酶)，例如针对vegf的抗血管生成核酸，抗血管生成吗啉代(morpholinos)，例如针对vegf的抗血管生成吗啉代，抗血管生成抗体和/或抗体片段(例如fab片段)，例如针对vegf的抗血管生成抗体和/或抗体片段。
[0846]
用于cns递送的方法
[0847]
在一些实施方案中，施用有效量的本发明的重组病毒颗粒(例如aav2、aavrh8r颗粒等)转导施用位点处或附近的神经元(例如纹状体神经元，如棘神经元)，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于硫酸乙酰肝素蛋白聚糖与相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，转导了多于约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或100％任一项的神经元。在一些实施方案中，转导了约5％至约100％，约10％至约50％，约10％至约30％，约25％至约75％，约25％至约50％，或约30％至约50％的神经元。鉴定通过表达异源核酸的重组病毒颗粒转导的神经元的方法是本领域已知的；例如，可使用免疫组化、rna检测(例如qpcr、northern印迹、rna-seq、原位杂交等)或使用共表达的标记物如增强的绿色荧光蛋白来检测表达。
[0848]
在本发明的一些实施方案中，所述方法包括将有效量的本发明的重组病毒颗粒施用于哺乳动物的脑，用于治疗哺乳动物(例如人)，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，将所述组合物注射至脑的一个或多个位置以允许本发明的异源核酸在至少神经元中表达。在一些实施方案中，将所述组合物注射入脑中的一、二、三、四、五、六、七、八、九、十或多于十个位置中的任一项。在一些实施方案中，将所述组合物注射入纹状体。在
一些实施方案中，将所述组合物注射入背侧纹状体。在一些实施方案中，将所述组合物注射入壳核(putamen)。在一些实施方案中，将所述组合物注射入尾状核(caudate nucleus)。在一些实施方案中，将所述组合物注射入壳核并注射入尾状核。在一些实施方案中，将所述重组病毒颗粒通过立体定位注射施用于个体的cns(例如纹状体)，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，将所述重组病毒颗粒通过对流增强递送(ced)施用于个体的cns(例如ced至纹状体)，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。
[0849]
所述raav颗粒的施用可通过多种途径进行。在一些实施方案中，所述施用包括直接脊髓注射和/或脑内施用。在一些实施方案中，所述施用处于选自如下的部位：大脑、髓质、脑桥、小脑、颅内腔、围绕大脑的脑膜、硬脑膜、蛛网膜、软脑膜、围绕脑的蛛网膜下腔的脑脊液(csf)、小脑的深部小脑核、大脑的脑室系统、蛛网膜下腔、纹状体、皮层、隔膜、丘脑、下丘脑和脑的实质。在一些实施方案中，所述施用包括脑室内注射入至少一个大脑侧脑室。在一些实施方案中，所述施用包括鞘内注射到颈、胸和/或腰部中。在一些实施方案中，所述施用包括纹状体内注射。在一些实施方案中，所述施用包括丘脑内注射。适于这些施用途径的多种技术和设备在本文中描述，例如，ced和/或立体定位注射。
[0850]
在一些实施方案中，将所述重组病毒颗粒施用于脑的一个半球，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，将所述重组病毒颗粒施用于脑的两个半球。
[0851]
在一些实施方案中，将所述重组病毒颗粒同时或顺序施用于多于一个位置，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，重组病毒颗粒的多次注射间隔不多于一小时、两小时、三小时、四小时、五小时、六小时、九小时、十二小时或24小时。
[0852]
在一些实施方案中，本发明提供用于治疗患有cns的病症的人的方法，其通过施用有效量的本发明的药物组合物来治疗cns的病症，所述药物组合物包含重组病毒颗粒，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，所述药物组合物包含一个或多个药学上可接受的赋形剂。
[0853]
通常，可递送约1μl至约1ml的本发明的组合物(例如约100μl至约500μl的组合物)。在本发明的一些实施方案中，注射至纹状体的重组病毒颗粒的体积是约或多于约1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1ml中的任一项，或其间的任何量，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。
[0854]
在一些实施方案中，将第一体积的重组病毒颗粒注射入脑的第一区，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，且将第二体积的变体raav颗粒注射入脑的第二区。例如在一些实施方案中，将第一体积的变体raav颗粒注射入尾状核，且将第二体积的所述组合物注射入壳核。在一些实施方案中，将1x体积的变体raav颗粒注射入尾状核，且将1.5x、2x、2.5x、3x、
3.5x或4x体积的所述组合物注射入壳核，其中x是约或多于约1μl、2μl、3μl、4μl、5μl、6μl、7μl、8μl、9μl、10μl、15μl、20μl、25μl、50μl、75μl、100μl、200μl、300μl、400μl、500μl、600μl、700μl、800μl、900μl或1ml中的任一项，或其间任何量的体积。
[0855]
本发明的组合物(例如本发明的重组病毒颗粒，其包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处)可单独或与用于治疗cns的病症(例如hd)的一种或多种额外治疗剂组合使用。顺序施用之间的间隔可以至少(或可替换地少于)数分钟、数小时或数天为单位。
[0856]
在一些实施方案中，所述方法包括将有效量的重组病毒颗粒施用于cns，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代且包含编码异源核酸的载体，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是至少约5
×
10
12
、6
×
10
12
、7
×
10
12
、8
×
10
12
、9
×
10
12
、10
×
10
12
、11
×
10
12
、15
×
10
12
、20
×
10
12
、25
×
10
12
、30
×
10
12
、或50
×
10
12
基因组拷贝/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是约5
×
10
12
至6
×
10
12
、6
×
10
12
至7
×
10
12
、7
×
10
12
至8
×
10
12
、8
×
10
12
至9
×
10
12
、9
×
10
12
至10
×
10
12
、10
×
10
12
至11
×
10
12
、11
×
10
12
至15
×
10
12
、15
×
10
12
至20
×
10
12
、20
×
10
12
至25
×
10
12
、25
×
10
12
至30
×
10
12
、30
×
10
12
至50
×
10
12
、或50
×
10
12
至100
×
10
12
基因组拷贝/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是约5
×
10
12
至10
×
10
12
、10
×
10
12
至25
×
10
12
、或25
×
10
12
至50
×
10
12
基因组拷贝/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价为至少约5
×
109、6
×
109、7
×
109、8
×
109、9
×
109、10
×
109、11
×
109、15
×
109、20
×
109、25
×
109、30
×
109、或50
×
109转导单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是约5
×
109至6
×
109、6
×
109至7
×
109、7
×
109至8
×
109、8
×
109至9
×
109、9
×
109至10
×
109、10
×
109至11
×
109、11
×
109至15
×
109、15
×
109至20
×
109、20
×
109至25
×
109、25
×
109至30
×
109、30
×
109至50
×
109或50
×
109至100
×
109转导单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是约5
×
109至10
×
109、10
×
109至15
×
109、15
×
109至25
×
109、或25
×
109至50
×
109转导单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是至少约5
×
10
10
、6
×
10
10
、7
×
10
10
、8
×
10
10
、9
×
10
10
、10
×
10
10
、11
×
10
10
、15
×
10
10
、20
×
10
10
、25
×
10
10
、30
×
10
10
、40
×
10
10
、或50
×
10
10
感染单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是至少约5
×
10
10
至6
×
10
10
、6
×
10
10
至7
×
10
10
、7
×
10
10
至8
×
10
10
、8
×
10
10
至9
×
10
10
、9
×
10
10
至10
×
10
10
、10
×
10
10
至11
×
10
10
、11
×
10
10
至15
×
10
10
、15
×
10
10
至20
×
10
10
、20
×
10
10
至25
×
10
10
、25
×
10
10
至30
×
10
10
、30
×
10
10
至40
×
10
10
、40
×
10
10
至50
×
10
10
、或50
×
10
10
至100
×
10
10
感染单位/ml中的任一项。在一些实施方案中，所述组合物的病毒效价是至少约5
×
10
10
至10
×
10
10
、10
×
10
10
至15
×
10
10
、15
×
10
10
至25
×
10
10
、或25
×
10
10
至50
×
10
10
感染单位/ml中的任一项。
[0857]
在一些实施方案中，所述方法包括将有效量的重组病毒颗粒施用于个体(例如人)的cns，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，施用于个体的病毒颗粒的剂量是至少约1
×
108至约1
×
10
13
基因组拷贝/kg体重中的任一项。在一些实施方案中，施用于个体的病毒颗粒的剂量是约1
×
108至约1
×
10
13
基因组拷贝/kg体重中的任一项。
[0858]
在一些实施方案中，所述方法包括将有效量的重组病毒颗粒施用于个体(例如人)的cns，所述重组病毒颗粒包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝
素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，施用于个体的病毒颗粒的总量是至少约1
×
109至约1
×
10
14
基因组拷贝中的任一项。在一些实施方案中，施用于个体的病毒颗粒的总量是约1
×
109至约1
×
10
14
基因组拷贝中的任一项。
[0859]
v.表达构建体
[0860]
在一些方面，本发明提供通过视网膜下递送包含异源核酸的raav载体从而将所述异源核酸递送至眼部的方法，且其中所述raav载体在raav衣壳(例如raav2衣壳、raavrh8r衣壳等)中衣壳化，所述raav衣壳包含与hspg相互作用的氨基酸的一个或多个取代。在一些方面，本发明提供治疗个体的cns的病症的方法，其包括将包含raav颗粒的组合物递送至个体的cns，其中所述raav颗粒包含(a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和(b)raav载体，其包含所述异源核酸和至少一个aav末端重复。在一些实施方案中，所述异源核酸(例如转基因)可操作地连接至启动子。例示性的启动子包括但不限于巨细胞病毒(cmv)立即早期启动子，rsv ltr，momlv ltr，磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子，猿猴病毒40(sv40)启动子和ck6启动子，甲状腺素转运蛋白启动子(ttr)，tk启动子，四环素响应性启动子(tre)，hbv启动子，haat启动子，lsp启动子，嵌合肝特异性启动子(lsp)，e2f启动子，端粒酶(htert)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白/兔β球蛋白启动子(cag启动子；niwa等，gene,1991,108(2):193-9)和延伸因子1-α启动子(ef1-α)启动子(kim等，gene,1990,91(2):217-23和guo等，gene ther.,1996,3(9):802-10)。在一些实施方案中，所述启动子包含人β-葡糖醛酸糖苷酶启动子或与鸡β-肌动蛋白(cba)启动子连接的巨细胞病毒增强子。所述启动子可以是组成型、诱导型或阻抑型启动子。在一些实施方案中，所述启动子能够在眼的细胞中表达所述异源核酸。在一些实施方案中，所述启动子能够在感光细胞或rpe中表达所述异源核酸。在具体实施方案中，所述启动子是视紫红激酶(rk)启动子；例如人rk启动子。在一些实施方案中，所述启动子是视蛋白启动子；例如人视蛋白启动子或小鼠视蛋白启动子。
[0861]
本发明涵盖重组病毒基因组用于引入一个或多个编码治疗性多肽和/或核酸的核酸序列的用途，用于包装入包含与hspg相互作用的氨基酸的一个或多个取代的raav病毒颗粒。所述重组病毒基因组可包括建立所述治疗性多肽和/或核酸的表达的任何元件，例如启动子、itr、核糖体结合元件、终止子、增强子、选择标记物、内含子、多聚a信号(poly a signal)和/或复制起点。
[0862]
在一些实施方案中，所述raav载体是自身互补的raav载体，例如包含重组自身互补的(术语“自身互补的”在本文中可互换使用)基因组的raav载体。具有自身互补的基因组的aav病毒颗粒和使用自身互补的aav基因组的方法描述于美国专利号6,596,535；7,125,717；7,465,583；7,785,888；7,790,154；7,846,729；8,093,054；和8,361,457；以及wang z.等，(2003)gene ther10:2105-2111中，其各自通过提述以其整体并入本文。包含自身互补的基因组的raav凭借其部分互补序列(例如转基因的互补的编码和非编码链)会迅速地形成双链dna分子。在一些实施方案中，所述载体包含编码所述异源核酸的第一核酸序列和编码该核酸的互补体的第二核酸序列，其中所述第一核酸序列能与第二核酸序列沿其全长或长度的大部分形成链内碱基对。
[0863]
在一些实施方案中，所述第一异源核酸序列和所述第二异源核酸序列经由突变的
itr(例如右侧(right)itr)连接。在一些实施方案中，所述itr包含多核苷酸序列5
’‑
cactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccacgcccgggctttgcccgggcg
–3’
(seq id no:8)。所述突变的itr包含d区的缺失并包含末端解析序列。结果，在aav病毒基因组的复制中，所述rep蛋白质不会在突变的itr处切割病毒基因组，并由此，可以5'至3'顺序将包含如下的重组病毒基因组包装在病毒衣壳中：aav itr、包含调节序列的第一异源多核苷酸序列、突变的aav itr、与第一异源多核苷酸方向相反的第二异源多核苷酸和第三aav itr。
[0864]
vi.病毒颗粒和产生病毒颗粒的方法
[0865]
raav病毒颗粒
[0866]
在一些方面，本发明提供通过视网膜下递送包含异源核酸的raav载体而将所述异源核酸递送至眼部的方法，且其中所述raav载体在raav衣壳(例如raav2、raavrh8r等)中衣壳化，所述raav衣壳包含与hspg相互作用的氨基酸的一个或多个取代。在一些方面，本发明提供涉及将raav颗粒递送至个体的cns的方法和试剂盒。
[0867]
在一些实施方案中，所述raav颗粒包含raav载体。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是包含核酸的重组aav颗粒，所述核酸包含侧翼有一个或两个aav末端反向重复(itr)的异源转基因。所述核酸在aav颗粒中衣壳化。所述aav颗粒还包含衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述核酸包含目的编码序列(例如异源转基因)，其以转录的方向可操作地连接组分，调控序列(包括转录起始和终止序列)，由此形成表达盒。
[0868]
所述表达盒在5'和3'端侧翼有至少一个功能性aav itr序列。“功能性aav itr序列”是指itr序列发挥所意欲的功能，用于aav病毒体的拯救、复制和包装。参见davidson等，pnas,2000,97(7)3428-32；passini等，j.virol.,2003,77(12):7034-40；和pechan等，gene ther.,2009,16:10-16，其全部通过提述以其整体并入本文。为了实施本发明的一些方面，所述重组载体至少包含对于衣壳化和用于raav感染的物理结构所必需的全部aav序列。用于在本发明中使用的载体的aav itr不需要具有野生型核苷酸序列(例如，如kotin,hum.gene ther.,1994,5:793-801中所述)，并可通过核苷酸的插入、缺失或取代而改变，或者所述aav itr可源自数种aav血清型的任一项。目前已知aav的多于40个血清型，而且继续在对新的血清型和现存的血清型的变体进行鉴定。参见gao等，pnas,2002,99(18):11854-6；gao等，pnas,2003,100(10):6081-6；和bossis等，j.virol.,2003,77(12):6799-810。
[0869]
任何aav血清型的使用都视为在本发明的范围内。在一些实施方案中，raav载体是源自aav血清型的载体，其包括而不限于，aav itr为aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav dj、山羊aav、牛aav或小鼠aav itr等。在一些实施方案中，所述aav中的核酸包含aav itr的itr，其为aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav dj、山羊aav、牛aav或小鼠aav等。在一些实施方案中，所述aav中的核酸包含aav2 itr。如上文所述，所述raav颗粒可进一步包含含有raav衣壳蛋白的衣壳，所述raav衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。
[0870]
在一些实施方案中，载体可包括填充核酸。在一些实施方案中，所述填充核酸可编码绿色荧光蛋白。在一些实施方案中，所述填充核酸可位于启动子和编码所述rnai的核酸
之间。
[0871]
不同的aav血清型用于优化特定靶细胞的转导或用于靶向特定靶组织(例如cns组织)内特定的细胞类型。raav颗粒可包含相同血清型或混合的血清型的病毒蛋白质和病毒核酸。例如在一些实施方案中，raav颗粒可包含本发明的aav2衣壳蛋白和至少一个aav2 itr，或其可包含aav2衣壳蛋白和至少一个aav1 itr。用于产生raav颗粒的aav血清型的任何组合在本文中提供，如同各组合已明确地叙述于本文中那样。在一些实施方案中，本发明提供包含本发明的aav2衣壳的raav颗粒。在一些实施方案中，本发明提供包含本发明的aavrh8r衣壳的raav颗粒。
[0872]
aav颗粒的产生
[0873]
本领域已知许多方法用于生产raav载体，包括转染、稳定的细胞系的生产，和感染性杂交病毒生产系统，其包括腺病毒-aav杂交体、疱疹病毒-aav杂交体(conway,je等，(1997)j.virology 71(11):8780-8789)和杆状病毒-aav杂交体。用于产生raav病毒颗粒的raav生产培养物都需要：1)合适的宿主细胞，包括例如源自人的细胞系如hela细胞、a549或293细胞，或源自昆虫的细胞系如sf-9(对于杆状病毒生产系统的情况而言)；2)合适的辅助病毒功能，其由野生型或突变体腺病毒(如温度敏感的腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；3)aav rep和cap基因和基因产物；4)转基因(如治疗性转基因)，其侧翼有至少一个aav itr序列；和5)合适的培养基和培养基组分，以支持raav生产。本领域中已知的合适培养基可用于产生raav载体。这些培养基包括而不限于由hyclone laboratories和jrh生产的培养基，包括改良的eagle培养基(mem)，dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中，定制的配制物如美国专利no.6,566,118中所述的那些，和如美国专利no.6,723,551中所述的sf-900ii sfm培养基，其各自通过提述以其整体并入本文，特别是关于用于产生重组aav载体的定制的培养基配制物。
[0874]
所述raav颗粒能够使用本领域中已知的方法来产生。参见例如美国专利no.6,566,118；6,989,264和6,995,006。在本发明的实施中，用于产生raav颗粒的宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、微生物和酵母。宿主细胞也可以是包装细胞，其中所述aav rep和cap基因被稳定地保持在宿主细胞或生产者细胞中，其中所述aav载体基因组被稳定地保持。例示性的包装和生产者细胞源自293、a549或hela细胞。使用本领域已知的标准技术纯化和配制aav载体。
[0875]
在一些实施方案中，raav颗粒可通过三重转染方法来生产，如示例性三重转染方法在下文提供。简言之，可将含有rep基因和衣壳基因的质粒以及辅助腺病毒质粒转染(例如使用磷酸钙法)入细胞系(例如hek-293细胞)中，并可收集和任选地纯化病毒。
[0876]
在一些实施方案中，raav颗粒可通过生产者细胞系方法产生，如下文提供的示例性的生产者细胞系方法(另见(martin等，(2013)human gene therapy methods 24:253-269中引用的)。简言之，细胞系(例如hela细胞系)可用含有rep基因、衣壳基因和启动子-转基因序列的质粒稳定地转染。可筛选细胞系以选择引导克隆用于raav生产，然后可将其扩展到生产生物反应器并用作为辅助者的腺病毒(例如野生型腺病毒)来感染以启动raav生产。随后可收获病毒，可以将腺病毒灭活(例如通过加热)和/或去除，且可纯化所述raav颗粒。
[0877]
在一些方面，提供了用于产生如本文公开的任何raav颗粒的方法，其包括：(a)在
产生raav颗粒的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含(i)一个或多个aav包装基因，其中每个aav包装基因编码aav复制和/或衣壳化蛋白；(ii)raav原-载体，其包含编码如本文所述的治疗性多肽和/或核酸的核酸，所述核酸侧翼有至少一个aav itr，和(iii)aav辅助功能；和(b)回收由宿主细胞产生的raav颗粒。在一些实施方案中，所述至少一个aav itr是选自下组的aav itr：aav1、aav2、aav3、aav4、aav5、aav6、aav7、aav8、aavrh8、aavrh8r、aav9、aav10、aavrh10、aav11、aav12、aav2r471a、aav dj、山羊aav、牛aav或小鼠aav等。在一些实施方案中，所述衣壳化蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处。在一些实施方案中，所述衣壳化蛋白是aav2衣壳化蛋白。在一些实施方案中，所述衣壳化蛋白是aavrh8r衣壳化蛋白。
[0878]
本发明的合适的raav生产培养基可以0.5％-20％(v/v或w/v)的水平补充血清或血清来源的重组蛋白质。或是如本领域已知的，raav载体可在无血清条件下产生，其也可称为无动物来源产品的培养基。本领域的普通技术人员可理解，经设计以支持raav载体产生的商用或定制培养基也可以补充有本领域已知的一个或多个细胞培养组分，包括但不限于葡萄糖、维生素、氨基酸和或生长因子，以增加生产培养物中raav的效价(titer)。
[0879]
raav生产培养物可以在适于所使用的特定宿主细胞的多种条件(在宽的温度范围，进行不同的时间长度等)下生长。如本领域已知的，raav生产培养包括附接依赖性培养，其可在合适的附接依赖性容器如，例如，滚瓶、中空纤维滤器、微载体和填充床或流化床生物反应器中进行培养。raav载体生产培养物还可包括适应悬浮液的宿主细胞如hela细胞、293和sf-9细胞，其可以多种方式，包括例如旋转瓶、搅拌罐生物反应器和一次性系统如wave袋系统进行培养。
[0880]
本发明的raav载体颗粒可从raav生产培养物通过裂解所述生产培养物的宿主细胞或通过从生产培养物收获用过的培养基来收获，只要将细胞在本领域中已知的条件下培养以引起raav颗粒从完整细胞释放入培养基，如更充分地于美国专利no.6,566,118中所描述的)。裂解细胞的合适方法也是本领域中已知的且包括例如多个冻/融循环、声处理、微流化，和用化学品(如洗涤剂和/或蛋白酶)处理。
[0881]
在进一步的实施方案中，纯化所述raav颗粒。如本文所用的术语“纯化”包括制备缺少了至少一些其它组分的raav颗粒，所述其它组分还可能存在于天然存在的或由其起始制备的raav颗粒中。因此，例如，分离的raav颗粒可使用纯化技术从来源混合物(如培养裂解物或生产培养物上清液)将其富集来制备。富集可以多种方式测量，如，例如通过存在于溶液中的脱氧核酶抗性颗粒(drp)或基因组拷贝(gc)的比例，或通过感染性来测量，或其可相对于来源混合物中存在的第二、潜在的干扰物质而测量，所述干扰物质如污染物，包括生产培养污染物或过程中的污染物，包括辅助病毒，培养基组分等。
[0882]
在一些实施方案中，将所述raav生产培养收获物澄清以除去宿主细胞碎片。在一些实施方案中，生产培养收获物通过一系列的深度过滤器(包括，例如，等级(grade)dohc millipore millistak+hc pod过滤器、等级a1hc millipore millistak+hc pod过滤器，和0.2μm过滤器opticap xl1o millipore express shc亲水膜过滤器)通过过滤澄清。澄清也可以通过多种本领域已知的其它标准技术来实现，如离心或通过本领域中已知的0.2μm或更大孔尺寸的任何醋酸纤维素滤膜过滤。
[0883]
在一些实施方案中，将所述raav生产培养收获物进一步用处理以消
化所述生产培养物中存在任何高分子量dna。在一些实施方案中，所述消化在本领域已知的标准条件下进行，包括例如终浓度为1-2.5单位/ml的在环境至37℃的温度进行30分钟至数小时的时段。
[0884]
可使用一个或多个如下纯化步骤来分离或纯化raav颗粒：平衡离心；穿过(flow-through)阴离子交换过滤；用于浓缩所述raav颗粒的切向流过滤(tff)；通过磷灰石色谱进行的raav捕获；辅助病毒的热灭活；通过疏水相互作用色谱的raav捕获；通过大小排阻色谱(sec)的缓冲液交换；纳米过滤；和通过阴离子交换色谱、阳离子交换色谱或亲和色谱的raav捕获。这些步骤可以单独、以多种组合，或以不同的顺序使用。在一些实施方案中，所述方法包括以如下所述的顺序的所有步骤。纯化raav颗粒的方法见于，例如，xiao等，(1998)journal of virology 72:2224-2232；美国专利号6,989,264和8,137,948；和wo 2010/148143中。
[0885]
本技术还提供了包含raav颗粒和药学上可接受的载体的药物组合物，所述raav颗粒包含编码治疗性多肽和/或治疗性核酸的异源核酸，其中所述raav颗粒包含raav衣壳，所述raav衣壳包含与hspg相互作用的氨基酸的一个或多个取代。所述药物组合物可适于本文所述的任何施用方式；例如经通过视网膜下施用。
[0886]
在一些实施方案中，包含本文所述的raav和药学上可接受的载体的药物组合物适于施用于人。此类载体是本领域熟知的(参见例如remington'spharmaceutical sciences，第15版，第1035-1038和1570-1580页)。在一些实施方案中，包含本技术所述的raav和药学上可接受的载体的药物组合物适于眼部注射。所述药学上可接受的载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油等。盐水溶液和含水右旋糖、聚乙二醇(peg)和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。所述药物组合物可进一步包含另外的成分，例如防腐剂、缓冲液、等渗剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子型润湿或澄清剂，增粘剂等。本文所述的药物组合物可以包装于单个单位剂量或多剂量形式中。所述组合物通常配制为无菌和基本上等渗的溶液。
[0887]
vii.系统和试剂盒
[0888]
如本文所述的raav组合物可包含于经设计在本文所述的本发明的方法之一中使用的系统之内。
[0889]
视网膜下递送
[0890]
在一些实施方案中，本发明提供用于将载体视网膜下递送至个体的眼部的系统，其包含a)包含有效量的raav颗粒的组合物，其中i)所述raav颗粒的衣壳蛋白包含一个或多个氨基酸取代，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，且ii)所述载体包含编码治疗性多肽或治疗性rna的异源核酸和至少一个aav末端重复；和b)用于视网膜递送所述raav的装置。
[0891]
通常，所述系统包含细孔套管(其中所述套管为27至45号)、一个或多个注射器(例如1、2、3、4或更多)和适用于本发明的方法的一种或多种流体(例如1、2、3、4或更多)。
[0892]
所述细孔套管适于将载体悬浮物和/或待注射的其他流体视网膜下注射入视网膜下空间。在一些实施方案中，所述套管为27至45号。在一些实施方案中，所述细孔套管为35-41号。在一些实施方案中，所述细孔套管为40或41号。在一些实施方案中，所述细孔套管为
41-号。所述套管可以是任何合适的套管类型，例如，套管或套管。
[0893]
所述注射器可以是任何合适的注射器，条件是它能够连接于用于递送流体的套管。在一些实施方案中，所述注射器是系统注射器。在一些实施方案中，所述系统具有一个注射器。在一些实施方案中，所述系统具有两个注射器。在一些实施方案中，所述系统具有三个注射器。在一些实施方案中，所述系统具有四个或更多个注射器。
[0894]
所述系统可进一步包含自动化的注射泵，其可通过例如踏板启动。
[0895]
适用于本发明的方法的流体包括本技术所述的那些，例如各自包含有效量的本文所述的一个或多个载体的一种或多种流体，用于产生起始泡的一种或多种流体(例如盐水或其他适当的流体)，和包含一个或多个治疗剂的一种或多种流体。
[0896]
适用于在本发明的方法中使用的流体包括本技术所述的那些，例如各包含有效量的本文所述的一个或多个载体的一种或多种流体，用于产生起始泡的一种或多种流体(例如盐水或其他适当的流体)，和包含一个或多个治疗剂的一种或多种流体。
[0897]
在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为大于约0.8ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为至少约0.9ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为至少约1.0ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为至少约1.5ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为至少约2.0ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为大于约0.8至约3.0ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为大于约0.8至约2.5ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为大于约0.8至约2.0ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为大于约0.8至约1.5ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为大于约0.8至约1.0ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为约0.9至约3.0ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为约0.9至约2.5ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为约0.9至约2.0ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为约0.9至约1.5ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为约0.9至约1.0ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为约1.0至约3.0ml。在一些实施方案中，包含有效量的载体的流体的体积为约1.0至约2.0ml。
[0898]
用于产生起始泡的流体可以是例如约0.1至约0.5ml。在一些实施方案中，系统中所有流体的总体积是约0.5至约3.0ml。
[0899]
在一些实施方案中，所述系统包含单一流体(例如包含有效量的载体的流体)。在一些实施方案中，所述系统包含2种流体。在一些实施方案中，所述系统包含3种流体。在一些实施方案中，所述系统包含4种或更多种流体。
[0900]
本发明的系统可进一步包装入试剂盒中，其中所述试剂盒可进一步包含使用说明。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于视网膜下递送raav颗粒的组合物的装置。在一些实施方案中，所述使用说明包括根据本技术所述方法之一的说明。在一些实施方案中，所述使用说明包括用于视网膜下递送raav颗粒的说明，所述raav颗粒包含具有一个或多个氨基酸取代的衣壳，所述氨基酸取代改变、降低或去除所述raav颗粒与hspg的结合。
[0901]
cns递送
[0902]
本发明提供用于将异源核酸递送至个体的cns的试剂盒，其包含含有raav颗粒的组合物，其中所述raav颗粒包含(a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣
壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和(b)raav载体，其包含异源核酸和至少一个aav反向末端重复。本文进一步提供用于治疗个体中的cns病症的试剂盒，其包含含有raav颗粒的组合物，其中所述raav颗粒包含(a)raav衣壳，其包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处，和(b)raav载体，其包含用于治疗cns病症的异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
[0903]
所述试剂盒可包含本发明的任何raav颗粒或raav颗粒组合物。例如，所述试剂盒可包括具有raav衣壳的raav颗粒，所述raav衣壳包含含有一个或多个氨基酸取代的raav衣壳蛋白，所述氨基酸取代位于与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖相互作用的一个或多个位置处(例如降低所述raav颗粒与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合的一个或多个氨基酸取代，如位于r484、r487、k527、k532、r585和/或r588处的取代，编号基于aav2的vp1)；和raav载体，其包含所述异源核酸和至少一个aav反向末端重复。
[0904]
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于所述raav颗粒的组合物的cns递送的装置。用于cns递送(例如用于递送包含raav颗粒的组合物)的装置是本领域已知的并可利用泵(例如渗透泵和/或输液泵，如下所述)和注射装置(例如导管、套管等)。任选地，成像技术可用于指导注射装置和/或监测输注物(例如包含raav颗粒的组合物)的递送。cns递送可包括通过立体定位注射或通过对流增强递送(ced)的递送。可将所述注射装置插入受试者中的cns组织。本领域的技术人员能够确定用于将注射装置定位于靶cns组织中的合适的坐标。在一些实施方案中，定位通过例如由受试者的脑的ct和/或mri成像获得的解剖图谱来完成，以将注射装置引导至靶cns组织。
[0905]
在一些实施方案中，可进行递送的术中磁共振成像(imri)和/或实时成像。在一些实施方案中，该装置用于通过本发明的方法将raav颗粒施用于哺乳动物。本领域已知imri作为在手术过程中用于患者的基于mri的成像的技术，这有助于证实成功的手术过程(例如将raav颗粒递送至cns)和降低损伤组织的其它部分的风险(对于进一步的描述，参见例如fiandaca等，(2009)neuroimage 47suppl.2:t27-35)。在一些实施方案中，追踪剂(例如mri造影增强剂)可与输注物(例如包括raav颗粒的组合物)共递送以提供输注物的组织分布的实时监测。参见例如fiandaca等,(2009)neuroimage47 suppl.2:t27-35；u.s.pg pub 2007/0259031；和美国专利no.7,922,999。使用追踪剂可以通知递送的停止。本领域已知的其他追踪和成像手段技术也可用于追踪输注物分布。
[0906]
在一些实施方案中，raav颗粒可以通过标准的立体定位(术语“立体定向”在本文中可互换使用)注射使用本领域中已知的用于递送raav颗粒的装置和方法来施用。通常，这些方法可以使用注射装置，用于将靶向递送组织的区域转换成一系列坐标(例如沿侧(latero-lateral)，背腹(dorso-ventral)，和尾(rostro-caudal)轴的参数)的规划系统，和根据计划的坐标用于立体定位的装置(例如立体定位装置，任选地包括探头和用于将头固定在与坐标系对齐的位置的结构)。可用于mri引导手术和/或立体定向注射的系统的非限制性例子是系统(mri interventions,memphis,tn)。
[0907]
用于将raav颗粒递送至cns的另一个例示性和非限制性方法是对流增强递送(ced)。如本文所用的，术语“对流增强递送(ced)”可意指将治疗剂通过输注以这样的速率递送至cns，在所述速率中静水压力导致对流分布。在一些实施方案中，输注以大于0.5μl/
分钟的速率完成。然而，可使用任何合适的流速使得颅内压保持在合适的水平从而不会伤害脑组织。例如，可通过使用合适的导管或套管(例如分步设计无回流(step-design reflux-free)套管)通过将套管的尖端定位于至少靠近靶cns组织(例如将尖端插入cns组织)来完成ced。定位套管后，将其连接至泵，所述泵将治疗剂经由套管尖端递送至靶cns组织。可在输注过程中保持来自套管尖端的压力梯度。在一些实施方案中，可通过追踪剂来监测输注，所述追踪剂是可由成像方法如术中mri(imri)或另外的实时mri技术来检测的。
[0908]
ced是基于在组织间流体的静水压力得到克服的压力下将输注物(例如含有raav颗粒的组合物)泵送入cns。这使得所述输注物与cns血管周(perivasculature)接触，其被用作泵以将所述输注物通过对流来分布并增强其递送的程度(参见例如hadaczek等，(2006)hum.gene ther.17:291-302；bankiewicz等，(2000)exp.neurol.164:2-14；sanftner,lm等，(2005)exp.neurol.164:2-14；forsayeth,jr等，(2006)mol.ther.14(4):571-577；美国专利no.6,953,575；美国专利申请公开号2002/0141980；美国专利申请公开号2007/0259031；和wo 2010/088560)。
[0909]
在一些实施方案中，用于对流增强递送的装置包含渗透泵和/或输液泵。渗透泵和/或输液泵是商业上可得到的(例如获取自 corp.,hamilton corp.,alza inc.于palo alto,ca)。泵系统可以是可植入的。示例性的泵系统可见于例如，美国专利no.7,351,239；7,341,577；6,042,579；5,735,815；和4,692,147中。用于ced的示例性装置，包括抗回流和阶梯式套管，可见于wo 99/61066和wo 2006/042090中，其在此通过提述以其整体并入。
[0910]
在一些实施方案中，用于对流增强递送的装置包含抗回流套管(例如无回流分步设计套管)。抗回流套管的进一步描述和例示可见于例如krauze等，methods enzymol.465:349-362；u.s.pg pub 2006/0135945；u.s.pg pub2007/0088295；和pct/us08/64011中。在一些实施方案中，仅使用一个套管。在其他实施方案中，使用多于一个套管。在一些实施方案中，用于对流增强递送的装置包含与泵连接的抗回流套管，所述泵产生足够的压力以引起输注物以受控的速率通过套管流至靶组织。可使用任何合适的流速使得颅内压保持在合适的水平从而不会伤害脑组织。
[0911]
在一些实施方案中，输注物的渗透通过使用促进剂而进一步扩大。促进剂能够进一步促进输注物递送至靶组织(例如cns靶组织)。促进剂的非限制性实例是低分子量肝素(参见例如美国专利no.7,922,999)。
[0912]
在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含用于所述raav颗粒的组合物的cns递送的说明书。本技术所述的试剂盒可进一步包括由商业和用户立场出发所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和具有用于实施本文所述的任何方法的说明的包装插页。还可包括合适的包装材料且其可以是本领域已知的任何包装材料，例如小瓶(如密封小瓶)、容器、安瓿、瓶、罐、柔性包装(例如密封的mylar或塑料包)等。这些制造物品可进一步加以灭菌和/或密封。在一些实施方案中，所述试剂盒包含使用本文所述的任何方法和/或raav颗粒治疗本文所述的cns的病症的说明书。所述试剂盒可包括适于注射入个体的cns的药学上可接受的载体，和如下的一种或多种：缓冲液、稀释剂、滤器、针头、注射器和具有用于实施注射入个体的cns的说明的包装说明书。
[0913]
赋形剂
[0914]
在涉及视网膜下和/或cns递送的一些具体实施方案中，所述试剂盒进一步含有缓冲液和/或药学上可接受的赋形剂。如本领域中熟知的，药学上可接受的赋形剂是相对惰性的物质，其促进药理学有效物质的施用并可作为液体溶液或悬浮物、作为乳剂或作为适于在使用前溶解或悬浮于液体中的固体形式来提供。例如，赋形剂可给予形式或稠度(consistency)或充当稀释剂。合适的赋形剂包括但不限于稳定剂、润湿剂或乳化剂、用于改变渗透压的盐、包囊剂、ph缓冲物质和缓冲液。所述赋形剂包括任何适于直接递送至眼的药剂，其可被施用而无过度的毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于山梨糖醇、任何多种tween化合物，和液体如水、盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐可包含于其中，例如无机酸盐如氢氯化物、氢溴化物、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。药学上可接受的赋形剂的全面讨论可在remington’s pharmaceutical sciences(mack pub.co.,n.j.1991)中获得。
[0915]
在涉及视网膜下和/或cns递送的一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂可包括药学上可接受的载剂。所述药学上可接受的载剂可以是灭菌的液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油等。盐水溶液和含水右旋糖、聚乙二醇(peg)和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。还可使用额外的成分，例如防腐剂、缓冲液、等渗剂、抗氧化剂和稳定剂、非离子型润湿或澄清剂，增粘剂等。本文所述的试剂盒可以单个单位剂量或多剂量形式包装。所述试剂盒的内容物通常配制为无菌和基本上等渗的溶液。
实施例
[0916]
通过参考如下实施例可更加充分地理解本发明。然而，它们不应被解释为限制本发明的范围。可理解的是本技术所述的实施例和具体实施方案仅出于说明目的，而且在其启示下的多种修饰或变化会被本领域的技术人员认识到并包括在本技术的精神和范围以及所附权利要求的范围之内。
[0917]
实施例1：hspg结合所需的精氨酸残基的突变在培养的细胞系中降低aav2-介导的转导
[0918]
aav2基因治疗载体目前用于眼适应症的临床试验。这些载体可经玻璃体内施用途径递送，其在小鼠和非人灵长类中导致视网膜神经节细胞和m
ü
ller细胞的转导，或是经视网膜下施用途径递送，其靶向视网膜色素上皮细胞和感光细胞。不同血清型的aav使用不同的细胞表面受体和共受体用于感染。已知aav2的初级细胞表面受体是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)(summerford,c.和samulski,r.j.(1998)j.virol.72(2):1438-45)。理解aav2转导视网膜的机制对于进一步开发aav基因治疗载体是重要的。
[0919]
为了研究hspg结合在视网膜的aav2转导中的作用，用衣壳蛋白生成了aav2载体，所述衣壳蛋白在已知用于hspg结合所需的精氨酸残基中携带突变(aav2 hbko)。这些载体导致与野生型aav2相比对293和hela细胞在培养物中显著降低的转导。令人惊讶地，视网膜下递送至小鼠眼部的aav2hbko载体导致转导与野生型aav2相比的2-log增加。然而，当玻璃体内递送aav2hbko载体时，没有明显的转导。这些结果指示在aav2颗粒的视网膜下注射后，相对于玻璃体内注射，hspg结合所需的氨基酸中的突变对于转导效率具有相反的作用。
[0920]
方法
[0921]
构建aav2精氨酸突变体质粒
[0922]
使用quikchange lightning多重定点诱变试剂盒(agilent technologies)将所述aav2 rep/cap质粒pim45bd进行突变。设计pcr突变引物以引入精氨酸585和588至丙氨酸的变化。通过测序证实阳性突变体。
[0923]
生成raav载体
[0924]
使用pim45bd或pim45bdr585a/r588a rep/cap质粒和padhelper通过293细胞的三重转染产生表达增强的绿色荧光蛋白(egfp)或可溶的vegf受体杂交体(sflt02)的重组aav载体。转基因处于鸡β-肌动蛋白(cba)或人视紫红激酶启动子(rk)的控制下。
[0925]
体外转导测定法
[0926]
将293或hela细胞铺板入24孔板(1-2x105个细胞/孔)。铺板后24小时，以1x 103vg/细胞(+)ad5ts149感染细胞。感染后48小时测量转导效率，所述测量通过egfp荧光或通过elisa以定量培养基中的sflt02(通过r&d systems的人可溶性vegf r1 elisa)来进行。
[0927]
动物
[0928]
购买由jackson laboratories(bar harbor,me)获得的成年c57bl/6小鼠并维持在genzyme的动物饲养室(vivarium)中。在研究期间使所述动物自由接触食物和水。所有步骤在由动物保护和利用委员会(institutional animal care and use committee)批准的规程下进行。
[0929]
玻璃体内注射
[0930]
使用经由鼻锥(nose cone)递送至动物的运载于800ml/分钟的氧气中的3.5％异氟醚来诱导并保持麻木(torpor)。使用装配有33号斜式针头(beveled needle)的hamilton注射器(hamilton co.,reno,nv)将一微升的测试物品注入玻璃状液(vitreous humor)。引导针头在(角膜)缘(limbus)的大约2mm下通过巩膜并小心地前进至玻璃体腔以避免接触晶状体。将测试物品在1-2秒的时间递送。注射后，将针头保持在原位约五秒然后抽出。允许动物从麻醉恢复然后回到它的笼。
[0931]
视网膜下注射
[0932]
局部施用托吡卡胺(tropicamide)(alcon,fort worth,tx)诱导瞳孔散大和睫状肌麻痹。使用经鼻锥递送至动物的运载于800ml/分钟的氧气中的3.5％异氟醚来诱导并保持麻木。使用环头钳(ring tipped forceps)(world precision instruments,sarasota,fl)固定眼，且使用30号针头将试点切口置于(角膜)缘下大约2mm的巩膜上。通过切口导入33号钝尖针头并向后进针直到尖端穿透后视网膜神经上皮层(posterior neurosensory retina)。将一微升的测试物品在1秒递送。将针头保持在原位约五秒然后抽出。允许动物从麻醉恢复然后回到它的笼。
[0933]
egfp的组织学
[0934]
使用落射荧光显微镜(epifluorescence microscope)在福尔马林固定的石蜡包埋处理的眼上观察到原始egfp信号。
[0935]
结果
[0936]
如图1中所描绘，已显示五个衣壳残基对于aav2与hspg的结合是关键的。构建aav2突变体，其携带这些残基中的两个氨基酸取代：r585a和r588a(编号基于vp1氨基酸序列)。此突变体称为hbko，测试其在培养物中转导细胞的能力。
[0937]
使人细胞系在培养物中生长并用野生型或hbko突变体aav2颗粒转导。为了测量转导效率，将两种类型的aav2颗粒的病毒基因组进行修饰以包含使用遍在cba启动子的转基因从而驱动可溶性flt(人vegf受体1)表达。转导后48小时，使用基于elisa的免疫测定法定量产生的flt的量来测量转导效率。图2证明hbko突变体显示出在培养物中转导人293细胞的能力大大降低。使用相等数目的aav2颗粒和293细胞，所述hbko突变体相比于野生型显示转导效率降低99.6％。
[0938]
为了在多种人细胞系中测量此效果，如上所述转导了293和hela细胞。对于这些测定法，修饰所述载体以从cba启动子表达egfp而不是flt。图3显示野生型aav2能够转导两种细胞系，如通过egfp荧光所测量的。相比之下，hbko突变体在两种细胞系的转导中具有引人注目的降低。这些结果证实hbko突变体在培养物中转导人胚肾和宫颈癌细胞系的能力急剧降低。
[0939]
实施例2：玻璃体内注射后对比视网膜下注射后，用于hspg结合所需的精氨酸残基的突变对于的aav2-介导的转导具有相反的作用
[0940]
在小鼠中测试了玻璃体内和视网膜下注射后hbko突变体aav2颗粒转导眼细胞的能力。图4a和4b比较了玻璃体内或视网膜下注射后野生型和hbko aav2颗粒的转导效率。对于这些实验，通过测量用携带转基因的aav2颗粒转导后可溶性flt(sflt)的表达而测定转导效率，所述转基因使用遍在cba启动子以驱动flt的表达。使用玻璃体内注射，hbko突变体显示出转导细胞的能力大大降低(图4a)。
[0941]
令人惊讶地，hbko突变体显示了在视网膜下注射后转导增强(图4b)。当注射的aav2载体基因组的量变化10倍(108和109vg，如标记的)时，此增加可始终观察到。这些结果与在培养的细胞系中和在玻璃体内注射后观察到的那些形成对比。这些数据指向hspg结合能力在介导通过不同类型的眼内注射转导不同眼细胞类型和视网膜层中的重要性。
[0942]
为了使视网膜细胞的转导可视化，使用携带由普遍cba启动子表达egfp的转基因的野生型或hbko突变体aav2颗粒。如图5中所示，野生型aav2颗粒在玻璃体内注射后能够转导视网膜，如通过gfp荧光所证明的那样。然而，aav2 hbko突变体颗粒在玻璃体内注射后未显示出可检测的gfp荧光。这些结果与图4a中存在的相一致。
[0943]
图6定量了视网膜下注射后野生型(aav2 cba)和hbko突变体(aav2cba hbko)aav2颗粒的转导效率。为了测量转导，两种aav2颗粒具有载体基因组，其包含使用普遍cba启动子表达flt的转基因。将两种量的载体基因组用于注射，如图6中指示。这些结果证实图4b中所示的观察结果，并证明令人惊讶的发现，即突变用于hspg结合所需的残基增加了在视网膜下注射后aav2转导细胞的能力。
[0944]
为了使转导可视化，使用携带由普遍cba启动子表达egfp的转基因的野生型或hbko突变体aav2颗粒。如图7中所示，视网膜中的gfp荧光在用hbko突变体aav2颗粒转导后与野生型相比得到增强。
[0945]
因为已知视网膜下注射靶向具有感光细胞的细胞层，研究了hbko突变体aav2颗粒转导感光细胞的能力。在眼中，已知视紫红激酶(rk)启动子特异性地驱动感光细胞如视杆细胞和视锥细胞中的表达(khani,s.c.等invest.ophthalmol.vis.sci.48(9):3954-61)。因此，生成了具有载体基因组的野生型和hbko突变体aav2颗粒，所述基因组携带使用rk启动子驱动flt的表达的转基因。如图8所示，hbko突变体aav2颗粒在视网膜下注射后与野生
型相比显示出感光细胞的转导的增强。此观察结果在用10倍不同量的载体基因组(108和109vg，如标记的)注射后始终观察到。这些结果证明了令人惊讶的结果，即突变用于hspg结合所需的残基增强了视网膜下注射后aav2颗粒转导视网膜感光细胞的能力。这些残基的突变代表了增强用于aav2-介导的基因治疗的感光细胞转导的潜在方式。
[0946]
aav是单链、无包膜的dna病毒，其是细小病毒家族的成员。aav的不同血清型包括aav1、aav2、aav4、aav5、aav6等显示出不同的组织分布概貌。这些aav衣壳的不同的组织向性使基于aav的载体用于肝、骨骼肌、脑、视网膜、心和脊髓的体外和体内的普遍的基因转移应用成为可能(wu,z.，等，(2006)molecular therapy,14:316-327)。病毒对宿主细胞的附接需要病毒衣壳与细胞受体分子的特异性相互作用。先前已显示aav2衣壳使用硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)、v 5整联蛋白和人成纤维细胞生长因子受体1作为初级和次级受体以介导基于aav2的基因治疗载体的细胞进入(summerford,c.和r.j.samulski(1998)j.virology,72:1438-1445；summerford,c.等，(1999)nat.medicine,5:78-82；qing,k.等，(1999)nat.medicine,5:71-77)。aav2衣壳蛋白的突变分析已显示一组碱性氨基酸，即精氨酸r484、r487、r585、r588和赖氨酸k532有助于aav2载体的乙酰肝素结合和对细胞的体外转导和体内肝转导。这些氨基酸残基中的突变导致基于aav2的载体通过静脉内施用途径的肝转导大大降低和心及骨骼肌基因转移的增加(kern,a.等，(2003)j.virology,77:11072-11081；muller,o.j.等，(2006)cardiovascular research,70:70-78)。
[0947]
研究了这些碱性氨基酸对于aav2载体通过载体施用的玻璃体内途径和视网膜下途径两者在视网膜中的转导的作用。r585和r588的突变显著地消除了hek293细胞和hela细胞的体外转导(图2和3)。dalkara d等，((2009)molecular therapy,17:2096-2102)表明玻璃体内递送的aav2载体由于与视网膜的内界膜中富含的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的结合而未能穿透入外视网膜。如本实施例所示，在玻璃体内递送后，r585/r588突变的载体与野生型aav2载体相比转导内视网膜的能力较差(图4a和5)，这表明与hspg的结合对于视网膜的玻璃体内转导是重要的。视网膜下递送基于aav2的载体主要导致视网膜色素上皮(rpe)转导和一些感光细胞转导。令人惊讶地，发现r585/r588突变的载体转导外视网膜为野生型aav2载体的至少10倍(图4b、6和7)。使用感光细胞特异性视紫红激酶启动子(rk)，感光细胞中的转基因表达以aav2 r585/r588突变体载体显著增加(图8)。这些基于aav2衣壳上的碱性氨基酸残基中的突变的载体会高度有益于外视网膜特别是感光细胞的转导，用于治疗多种视网膜病症。
[0948]
实施例3：纹状体内aav2hbko载体递送后普遍的gfp表达
[0949]
通过引入至aav2衣壳的定点突变，生成了不能结合肝素的aav2 hbko突变体载体。使用单一纹状体内注射在野生型小鼠和hd小鼠模型(yac128)二者中评价了此hbko载体的转导概貌。
[0950]
方法
[0951]
aav2精氨酸突变体质粒的构建
[0952]
使用quikchange lightning多重定点突变试剂盒(agilent technologies)突变了aav2 rep/cap质粒pim45bd。设计pcr突变引物以在残基585和588引入精氨酸至丙氨酸的变化。通过测序证实了阳性突变体。
[0953]
aav载体的产生
[0954]
通过人胚肾癌瘤293细胞(hek-293)的三重转染(使用磷酸钙)产生重组aav载体，如先前所述(xiao等(1998)j.virol.72:2224-2232)。简言之，使用了含有来自血清型2的rep基因和来自血清型1或2的衣壳基因的质粒连同辅助腺病毒质粒(stratagene,palo alto,ca)。转基因处于鸡β-肌动蛋白(cba)启动子的控制下。转染后72小时收集病毒并如先前所述进行柱纯化(xiao等(1998)j.virol.72:2224-2232)。
[0955]
动物
[0956]
使用由genzyme(建新)，赛诺菲公司(sanofi company)(卫生和人类服务部(department of health and human services),nih publication 86-23)的动物保护和利用委员会(institutional animal care and use committee)批准的规程进行所有步骤。使用的小鼠包括yac128小鼠(在纯fvb/nj背景上携带全长人突变体htt转基因及128cag重复的酵母人工染色体)和野生型fvb/nj同窝小鼠(slow等(2003)hum.mol.genet.12:1555-1567；van raamsdonk等(2005)hum.mol.genet.14:3823-3835)。yac128小鼠和fvb/nj同窝小鼠二者从位于charles river laboratories的genzyme群落获得。小鼠维持在12小时光/暗循环，食物和水可任取(ad libitum)。所述行为测试在动物的光循环期间(在上午8时-下午4时的时间)进行。所有实验的n-值示于下表2和3中。
[0957]
表2.用表达gfp的aav颗粒处理的野生型小鼠(实验1)
[0958]
处理n-值(wt小鼠)剂量(drps)aav2hbko-cba-gfp66x109aav2-cba-gfp66x109[0959]
表3.用表达htt mirna和gfp的aav颗粒处理的yac128小鼠(实验2)
[0960]
处理n-值(yac128小鼠)剂量(drps)aav2hbko-cba-mirna-htt-gfp86x109aav1-cba-mirna-htt-gfp81.5x10
10
未处理的8n/a
[0961]
手术步骤
[0962]
用3％异氟醚将动物麻醉并置于立体定位架。颅内注射如先前所述进行(stanek等(2014)hum.gene ther.25:461-474))。简言之，使用10μl hamilton注射器以0.5μl/分钟的速率将3μl的重组病毒载体注入纹状体(ap,+0.50；ml,
±
2.00；dv,-2.5从前囟和硬脑膜；门牙棒(incisor bar),0.0)。完成输注后将针在原处保留1分钟。手术前一小时和手术后24小时，对该小鼠经皮下施用酮洛芬(ketoprofen)(5mg/kg)用于止痛。
[0963]
动物灌注和组织收集
[0964]
用磷酸盐缓冲盐水(pbs)通过心脏灌注小鼠以除去所有血液。对于实验1，将脑沿冠状面切割，后固定于4％多聚甲醛，然后是30％蔗糖。使用低温恒温器切割20-μm冠状切片。对于实验2，沿中线矢状切割脑，并将左半球进行后固定于4％多聚甲醛然后是30％蔗糖，然后使用低温恒温器切片成20-μm切片。使用小鼠脑模具(matrix)(harvard apparatus,holliston,ma)将右半球(用于生化测定法)沿冠状轴线切割，并使用3mm的活检穿孔器解剖纹状体和皮质区。然后将脑组织在液氮中速冻并储存在-80℃直至使用。
[0965]
定量实时pcr(taqman)
[0966]
通过定量实时rt-pcr测量rna水平。纹状体穿孔物用于所有rt-pcr分析。使用
qiagen rneasy mini试剂盒提取总rna，然后根据制造商的说明使用one-step rt-pcr master mix试剂盒(applied biosystems)反转录和扩增。进行taqman定量rt-pcr反应并在7500实时pcr系统(applied biosystems)上进行分析。htt mrna的表达水平标准化至次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶1(hprt1)mrna水平。使用小鼠脑cdna的5倍连续稀释物生成标准曲线。每个样品一式两份运行。通过使用标准曲线或δδc
t
方法并标准化至hprt1 mrna水平来确定相对基因表达。对于人htt的检测，使用如下引物：5’ctccgtccggtagacatgct 3’和5’ccattttgagggttctgatttcc 3’。对于小鼠htt的检测，使用如下引物：5’tgctacacctgacagcgagtct 3’和5’atcccttgcggatcctatca 3’。
[0967]
western印迹
[0968]
通过western印迹分析测量蛋白质水平。皮质穿孔物用于所有western印迹分析。将组织(以t-per裂解缓冲液(pierce)中的50mg/ml的终浓度并含有完全蛋白酶抑制剂混合物(roche))匀浆。将匀浆物通过在4℃以10,000
×
g离心6分钟澄清。通过使用bsa测定法(pierce)测量蛋白质浓度。将二十至三十微克的匀浆物在3-8％novex tris-乙酸凝胶上解析和然后转移至硝酸纤维素膜。将膜用小鼠抗亨廷顿蛋白单克隆抗体(mab2166；1:2,000稀释，millipore)和兔多克隆抗β-微管蛋白抗体(1:750稀释，santa cruz biotechnology)探测。然后将膜与红外第二抗体(1:20,000稀释，rockland)温育，并使用odyssey(li-cor biosciences)通过定量荧光使所述蛋白质可视化。为了控制加载量差异，将htt蛋白质标准化至β微管蛋白并表示为未处理的或盐水处理的动物的百分比。分子量标记物用于验证蛋白质的身份。
[0969]
免疫组化
[0970]
将冷冻脑切片用兔抗gfap抗体染色以染色星形胶质细胞(1:2,500；dako,glostrup,germany)，或用抗iba1抗体染色以使小胶质细胞(1:500；wako chemicals usa,richmond,va)可视化。所用的二级抗体是缀合有fitc或cy3的驴抗物种特异性抗体。使用nikon eclipse e800荧光显微镜(nikon,melville,ny)使切片可视化。
[0971]
统计学
[0972]
将平均值用于统计学分析。数据表示为平均值
±
sem。对于使用两组的研究，用student’s t-检验进行统计学比较。对于超过两个组的比较，使用单因素方差分析(one-way anova)，然后是tukey多重比较事后检验(prism graphpad)。将p《0.05视为统计学上显著的差异。
[0973]
结果
[0974]
如上所述，在实验1中将aav2-egfp和aav2hbko-gfp载体注入野生型小鼠(表2)。注射后30天处死所有动物。荧光显微术揭示aav2和aav2hbko载体二者驱动gfp转基因在转导的神经元中的表达(图9a和9b)。gfp表达受限于aav2的注射路径(track)，其具有最小的超过注射部位的扩展(图9b)。然而，当与传统aav2相比时，aav2hbko驱动更稳固而广泛的gfp表达，具有在远超注射位点观察到的表达(图9a)。这些结果证明了使用aav2hbko载体递送至cns的转基因的稳固而普遍的表达。
[0975]
实施例4：比较在纹状体内注射入yac128小鼠脑后aav2hbko-和aav1-介导的gfp表达
[0976]
如上所述，在实验2中将aav2hbko和aav1血清型载体注入yac128小鼠(表3)。这些
载体驱动靶向人htt和gfp报告蛋白的人工mirna的表达。aav1和aav2hbko载体两者在注射入纹状体后30天显示出稳固的gfp分布(图10a和10b)。然而，gfp表达的图样在两种载体血清型之间似乎明显不同。gfp的aav1表达(图10a)比aav2hbko gfp表达(图10b)更不调和(patchy)且较不均一。载体转导在aav2hbko脑中看起来仅是神经元的，相比于aav1血清型其转导神经元和神经胶质细胞(主要是星形胶质细胞)两者。这些结果证明当与传统aav1相比时aav2hbko显示出非常不同的表达和转导概貌。
[0977]
实施例5：aav2hbko-mirna-htt注射入yac128小鼠导致htt mrna的减少
[0978]
接下来，评估了aav1和aav2hbko载体血清型在yac128小鼠纹状体中表达使htt表达沉默的mirna的能力。成年yac128小鼠接受了双侧纹状体内注射aav2/1-mirna-htt或aav2hbko-mirna-htt，并在处理后30天分析脑。在用aav2/1-mirna-htt和aav2hbko-mirna-htt注射的小鼠中突变体人htt mrna的纹状体水平与未处理的对照相比显著降低(图11a)。皮质脑穿孔物的western印迹分析在两个治疗组中都显示出趋向htt降低的趋势；然而，未处理的对照样品中的变异性使得数据未到达统计学显著性(图11b)。这些结果证明了使用aav1和aav2hbko载体通过rnai进行基因敲低的功效。
[0979]
实施例6：aav2hbko-mirnahtt注射入yac128小鼠不引起神经性炎症
[0980]
为确定aav的注射是否带来神经性炎症，在处理后30天检查了神经炎性标志物胶质纤维酸性蛋白质(gfap，星形胶质细胞的标记物)和iba1(小胶质细胞的标志物)的水平。在aav2hko处理后与未处理的脑相比，未观察到iba1水平的显著增加(参考图12a和12b)。然而aav2/1处理确实导致iba1水平在注射位点的增加(图12c)，这之前已观察到。在注射后30天任何处理的脑中与未处理的对照相比未观察到gfap水平的显著增加(图13a-13c)。这些结果说明，当与aav1血清型相比，aav2hbko能够驱动定向于人htt的mirna的表达并在缺乏小胶质细胞活化的情况下产生htt减少(reduction)。
[0981]
结论
[0982]
当前aav载体血清型在单一位点施用后显示脑中有限的分布(例如，christine,c.w.等(2009)neurology 73:1662-1669；mandel,r.j.(2010)curr.opin.mol.ther.12:240-247)。如在本文中详细讨论的，发明人已发现，具有与细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)的降低的结合的aav载体的施用增强了cns中的aav转导。这些结果证明具有修饰的hspg结合的aav用于cns基因治疗的用途，其中广泛的载体分布是期望的。而且，发明人还发现hspg结合降低的aav2载体呈现理想的安全概貌(因为它们仅靶向神经元)，同时实现普遍而稳固的转导效率。因此所述载体可用于需要来自(脑)实质内递送的普遍的神经元转导的cns适应症。
[0983]
实施例7：aavrh8r和aavrh8r突变体载体的体外和视网膜下转导
[0984]
方法
[0985]
aavrh8r精氨酸修饰的质粒的构建
[0986]
使用quikchange lightning多重定点诱变试剂盒(agilent technologies)突变了aavrh8r rep/cap质粒。设计pcr诱变引物以引入丙氨酸586至精氨酸(aavrh8r-a586r)或精氨酸533至丙氨酸(aavrh8r-r533a)的变化。通过测序证实了阳性突变体。
[0987]
raav载体的生成
[0988]
使用paavrh8r、paavrh8r-a586r或paavrh8r-r533a rep/cap质粒和padhelper通
过293细胞的三重转染产生了表达增强的绿色荧光蛋白(egfp)或可溶的vegf受体杂交体(sflt02)的重组aav载体。转基因处于鸡β-肌动蛋白(cba)启动子的控制下。
[0989]
体外转导测定法
[0990]
将hela、helarc32或ns1细胞铺板入24孔板(1-2x105个细胞/孔)。铺板后24小时，以1x 104vg/细胞-1x 105vg/细胞(+)ad5ts149感染细胞。感染后48小时通过egfp荧光或通过elisa以定量培养基中的sflt02(r&d systems的人可溶性vegf r1 elisa)来测量转导效率。
[0991]
动物
[0992]
购买由jackson laboratories(bar harbor,me)获得的成年c57bl/6小鼠并维持在动物饲养室中。在研究期间使所述动物自由接触食物和水。所有步骤在由动物保护和利用委员会批准的规程下进行。
[0993]
视网膜下注射
[0994]
局部施用托吡卡胺(alcon,fort worth,tx)诱导瞳孔散大和睫状肌麻痹。使用经由鼻锥递送至动物的800ml/分钟的氧气中运载的3.5％异氟醚诱导并保持麻木。使用环头钳(world precision instruments,sarasota,fl)固定眼，且使用30号针头将试点切口置于(角膜)缘下大约2mm的巩膜上。通过切口导入33号钝尖针头并向后进针直到尖端穿透后视网膜神经上皮层。将一微升的测试物品在1秒递送。将针头保持在原位约五秒然后抽出。允许动物从麻醉恢复然后回到它的笼。
[0995]
视网膜裂解物中sflt02的定量
[0996]
通过r&d systems使用人可溶性vegf r1 elisa试剂盒测量小鼠视网膜裂解物中的sflt02。
[0997]
结果
[0998]
为了研究衣壳表面精氨酸残基在视网膜的aavrh8转导中的作用，生成了具有衣壳蛋白的aavrh8载体，所述衣壳蛋白携带有对应于涉及hspg结合的aav2精氨酸的残基中的突变。图14比较了对于aav2与hspg的结合关键的五个衣壳残基与aavrh8r中的对应残基。如图15中所示，构建了两个aavrh8r突变体，其每一个携带这些残基中的氨基酸取代：a586r和r533a(编号基于vp1氨基酸序列)。
[0999]
为了评估将精氨酸残基添加至aavrh8r衣壳对于体外转导的作用，用aavrh8r-sflt02或在位置a586添加有精氨酸(aavrh8r a586r)的修饰的aavrh8r-a586r-sflt02载体来感染hela细胞，二者均以1x 104drp/细胞进行。感染后48小时，通过测量细胞培养基中的sflt02而评估转导效率。aavrh8r-a586r呈现出与未修饰的aavrh8r相比数倍高的转导(图16a)。
[1000]
为了评价去除衣壳精氨酸对体外转导的作用，以aavrh8r或aavrh8r-r533a载体(均以1x 104drp/细胞)感染helarc32细胞。当与aavrh8r相比时，aavrh8r-r533a具有显著降低的转导(图16b)。
[1001]
使用egfp表达作为转导效率的量度进行了类似的实验。aavrh8r-a586r-egfp与aavrh8r相比呈现基本上改进的ns1细胞的转导(将图17b与图17a相比)。反之，aavrh8r-r533a-egfp载体与aavrh8r相比对于hela细胞具有降低的转导(将图17d与图17c相比)。
[1002]
这些实验共同表明将精氨酸添加至aavrh8r衣壳改进aavrh8r体外转导，而从
aavrh8r衣壳去除精氨酸则削弱体外转导。这些结果证明aavrh8r的体外转导被衣壳上的精氨酸残基强烈地影响。
[1003]
为了确定精氨酸对于aavrh8r视网膜下转导的作用，以1x 108drp的由cba启动子表达sflt02的aavrh8r、aavrh8r-a586r或aavrh8r-r533a注射c57bl6小鼠。载体施用后30天将小鼠处死，并在视网膜裂解物中测量sflt02。
[1004]
与aavrh8r相比，小鼠视网膜的aavrh8r-a586r转导大幅降低，而且实际上与aav2相当，其在此相同的位置r585也具有精氨酸(图18a)。与aavrh8r相比，小鼠视网膜的aavrh8r-r533a转导得到改进(图18b)。
[1005]
这些数据凸显衣壳精氨酸对于aavrh8r的视网膜下转导的影响并表明通过从aavrh8r衣壳去除精氨酸改进了视网膜下转导。这些结果证明aavrh8r的视网膜下转导被衣壳上的精氨酸残基强烈的影响。
[1006]
实施例8：通过在位置586处添加精氨酸改进了aavrh8r的玻璃体内转导
[1007]
方法
[1008]
玻璃体内注射
[1009]
使用经鼻锥递送至动物的运载于800ml/分钟的氧气中的3.5％异氟醚来诱导并保持麻木。使用装配有33号斜式针头的hamilton注射器(hamilton co.,reno,nv)将一微升的测试物品注入玻璃状液。引导针头在(角膜)缘(limbus)下大约2 mm通过巩膜并小心地前进至玻璃体腔以避免接触晶状体。将测试物品在1-2秒的时间递送。注射后，将针头保持在原位约五秒然后抽出。允许动物从麻醉恢复然后回到它的笼。
[1010]
视网膜裂解物中sflt02的定量
[1011]
使用r&d systems的人可溶性vegf r1 elisa试剂盒测量了小鼠视网膜裂解物中的sflt02。
[1012]
结果
[1013]
为了评价将精氨酸添加至aav衣壳对于玻璃体内转导的作用，用1 x 109drp的aav2、aavrh8r或aavrh8r-a586r注射c57bl6小鼠，各自携带由cba启动子表达sflt02的构建体。载体施用30天后将小鼠处死，并在视网膜裂解物中测量sflt02。与aavrh8r相比，小鼠视网膜的aavrh8r-a586r转导得到改进，而且实际上与aav2相当，其在此相同的位置r585也具有精氨酸(图19)。此数据指示可通过将精氨酸添加至aav衣壳而改进视网膜的玻璃体内转导。基于这些结果和aav衣壳间的序列同源性(图20)，由携带aav1、aav6、aav8、aav9和aavrh10衣壳的aav颗粒的视网膜的玻璃体内转导可类似地改善视网膜转导。
[1014]
序列
[1015]
除另行说明外，所有多肽序列以n-末端至c-末端呈示。除另行说明外，所有核酸序列以5’至3’呈示。
[1016]
aav2 vp1氨基酸序列
[1017]
[1018][1019]
aav2 vp1 hbko氨基酸序列
[1020][1021]
aav2 vp2氨基酸序列
[1022][1023][1024]
aav2 vp2 hbko氨基酸序列
[1025][1026]
aav2 vp3氨基酸序列
[1027][1028]
aav2 vp3 hbko氨基酸序列
[1029][1030][1031]
aav3 vp1氨基酸序列
[1032][1033]
用于scaav载体的突变itr
[1034][1035]
aavrh8r vp1氨基酸序列
[1036][1037][1038]
aavrh8r a586r突变体vp1氨基酸序列
[1039][1040]
aavrh8r r533a突变体vp1氨基酸序列
[1041][1042][1043]
aav1 vp1氨基酸序列
[1044][1045]
aav6 vp1氨基酸序列
[1046][1047][1048]
aav8 vp1氨基酸序列
[1049][1050]
aav9 vp1氨基酸序列
[1051][1052]
aavrh10 vp1氨基酸序列
[1053]