EGFR基因T790M和C797S顺反式突变的检测试剂盒的制作方法

no:8所示；c797s野生探针，核苷酸序列如seq id no:9所示；c797s突变探针，核苷酸序列如seq id no:10和seq id no:11所示。
11.其中，上述egfr基因t790m和c797s顺反式突变的检测试剂盒中，所述t790m野生探针的3’端标记有hex
‑
猝灭基团，t790m突变探针的3’端标记有fam
‑
猝灭基团，c797s野生探针的3’端标记有cy5
‑
猝灭基团，c797s突变探针的3’端标记有rox
‑
猝灭基团。
12.具体的，上述egfr基因t790m和c797s顺反式突变的检测试剂盒引物和探针序列如下表1所示。
13.表1检测egfr基因t790m和c797s顺反式突变的试剂盒引物和探针序列
14.[0015][0016]
其中，上述egfr基因t790m和c797s顺反式突变的检测试剂盒的组成如下所示：
[0017][0018]
上述试剂盒的组成中，所述的5
×
hi
‑
dpcr buffer和hi
‑
dpcr酶均为购自qiagen的货号为55114，qiaamp circulating nucleic kit的试剂盒；所述油相a为江苏圣极基因科技有限公司货号为e002的产品，所述油相b为江苏圣极基因科技有限公司货号为e003的产品。
[0019]
进一步的，上述egfr基因t790m和c797s顺反式突变的检测试剂盒中，判定方法为：
[0020]
芯片检测结果fam和rox通道检出阳性点数≥3，则判定该通道检测为阳性，否则为阴性；hex和cy5通道检出阳性点数≥10，则判定该通道检测为阳性，否则为阴性；
[0021]
如果待检样本hex通道检测结果为阳性，且fam通道检测结果为阴性，则判定该样本为egfr基因t790m突变阴性；如果待检样本cy5通道检测结果为阳性，且rox通道检测结果为阴性，则判定该样本为egfr基因c797s突变阴性；
[0022]
如果待检样本hex通道检测结果为阳性，且fam通道检测结果为阳性，则判定该样本为egfr基因t790m突变阳性；如果待检样本cy5通道检测结果为阳性，且rox通道检测结果为阳性，则判定该样本为egfr基因c797s突变阳性。
[0023]
本发明的有益效果为：
[0024]
(1)本发明采用数字pcr方法，结合特异性引物和荧光探针，检测外周血ctdna样本中的egfr基因t790m和c797s突变；提供egfr基因t790m和c797s突变的定性、顺反式和定量检测结果，及时监测患者新的基因突变的发生，为临床治疗方案的制定和调整提供依据。
[0025]
(2)本发明中pcr扩增体系中同时含有udg酶，可以选择性的水解含有du的pcr片段中的尿嘧啶糖苷键，防止由pcr产物污染导致的假阳性结果。
[0026]
(3)本发明中的探针均采用淬灭基团，荧光淬灭剂比直接荧光测定法更为灵敏，具有更高的选择性。
具体实施方式
[0027]
本发明提供了一种数字pcr方法检测egfr基因t790m和c797s顺反式突变的引物和探针、试剂盒。
[0028]
本发明方法的检测原理是通过数字pcr进样仪自动化地将pcr反应预混液在数字pcr芯片的微腔室中均匀分割成21000多个尺寸均一的独立液滴，其中pcr反应预混液包含待检测核酸分子、t790m突变检测引物和检测探针、c797s突变检测引物和检测探针；每个液滴中包含0个、1个或几个核酸分子，每个液滴独立地进行pcr扩增反应；反应结束后对每个液滴的荧光信号进行检测和计数，统计含不同荧光信号微滴的数量及比值，再基于泊松分布原理计算出待检核酸序列的数量及其在复杂样本中所占的比例。
[0029]
本发明在egfr基因t790m和c797s顺反式突变数字pcr检测pcr扩增体系中针对egfr基因t790m和c797s突变设计了不同的特异性的突变探针和野生探针，探针序列如seq id no:7
‑
seq id no:11所示。pcr扩增时，突变探针和野生探针分别与相应的靶点相匹配，并被taq酶剪切，释放出荧光信号。通过区分不同的荧光信号从而实现egfr基因t790m和c797s突变的定性和定量检测。
[0030]
所述的检测egfr基因t790m和c797s突变的探针3’端都标记有荧光淬灭基团，各荧光信号表示的意义如下表2所示。
[0031]
表2荧光信号表示意义
[0032][0033]
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
[0034]
实施例
[0035]
使用的主要仪器有：冰箱，移液器，离心机，混匀仪，全自动样品处理系统loader s200、pcr扩增仪cycler s200、生物芯片阅读仪imager s200。
[0036]
采用本发明设计的特异性的引物和探针，序列如表1所示；
[0037]
具体的检测方法如下所示：
[0038]
1、检测样本处理与dna提取
[0039]
2000μl血浆样本进行核酸提取。阴性对照品需要与临床样本一同进行核酸提取。采用游离dna核酸提取试剂盒(磁珠法)，具体的操作参见试剂盒产品说明书。
[0040]
2、检测步骤
[0041]
以下仅以血浆样本为例进行说明。
[0042]
(1)使用qiagen：qiaamp circulating nucleic kit(货号：55114)试剂盒。参照相应的提取试剂盒说明书进行血浆样本的dna提取。
[0043]
(2)取出本发明试剂盒中的5
×
hi
‑
dpcr buffer、hi
‑
dpcr酶、egfr(t790m和c797s)突变检测体系，室温融化后振荡混匀，离心数秒。
[0044]
(3)配制反应体系(详见表3)，在八连排管中制备dpcr反应液(1反应/管，30μl/反应)。
[0045]
表3反应体系表
[0046]
组分体积(1个反应)5
×
dpcr buffer6μlhi
‑
dpcr酶3μlegfr(t790m和c797s)突变检测体系6μl总体积15μl
[0047]
(4)加样：分别取待测的样本和阴性对照品的核酸提取溶液、以及阳性对照品各15μl分别加入到各个dpcr反应液中，并用移液器缓慢吹打混匀30s；然后封膜离心3s，备用。最后撕去八连排管封膜，将其安装于全自动样品处理系统的96孔板位，并固定。
[0048]
(5)芯片进样:按照表4比例装配油相(24个反应)。
[0049]
表4
[0050]
组分用量(24个反应)油相a2ml油相b1ml
[0051]
所述油相a为江苏圣极基因科技有限公司货号为e002的产品，所述油相b为江苏圣极基因科技有限公司货号为e003的产品。
[0052]
(6)按上表将油相a和油相b分别加入到油槽板的油槽a1、油槽b1；然后将油槽板安装于全自动样品处理系统的油槽板位，并固定。取一盘数字pcr芯片(24颗芯片)，安装于全自动样品处理系统的芯片位。
[0053]
(7)芯片扩增：芯片进样完成后，取出芯片；然后将芯片置于pcr扩增仪的芯片槽内，进行热循环扩增反应。反应程序详见表5。
[0054]
表5 pcr反应程序
[0055][0056]
3、检测结果判定
[0057]
(1)芯片阅读分析
[0058]
热循环反应结束后将芯片移至生物芯片阅读仪上，建立2通道阅读计划，设定“mut”实验类型，编辑t790m和c797s突变率公式：
[0059]
t790m突变率＝fam通道定量浓度/(fam通道定量浓度+hex通道定量浓度)
×
100％；
[0060]
c797s突变率＝rox通道定量浓度/(rox通道定量浓度+cy5通道定量浓度)
×
100％。
[0061]
然后按照生物芯片阅读仪使用操作说明书的要求进行阅读分析；并测算样品模板浓度和突变率。
[0062]
(2)质量控制：
①
阴性对照结果为：fam、hex、rox、cy5通道均无阳性点；
②
阳性对照结果为：fam、hex、rox、cy5通道均有阳性点，且t790m突变率为10％左右，c797s突变率为10％左右。同时满足
①
和
②
条件，方可进行结果判读，否则实验结果无效，需重新检测。
[0063]
(3)阳性判断值或者参考区间：利用roc曲线法最终确定参考值：突变信号通道(fam和rox)阳性点数为3；野生信号通道(hex和cy5)阳性点数为10。
[0064]
(4)芯片检测结果fam和rox通道检出阳性点数≥3，则判定该通道检测为阳性，否则为阴性；hex和cy5通道检出阳性点数≥10，则判定该通道检测为阳性，否则为阴性。
[0065]
(5)如果待检样本hex通道检测结果为阳性，且fam通道检测结果为阴性，则判定该样本为egfr基因t790m突变阴性；如果待检样本cy5通道检测结果为阳性，且rox通道检测结果为阴性，则判定该样本为egfr基因c797s突变阴性。
[0066]
(6)如果待检样本hex通道检测结果为阳性，且fam通道检测结果为阳性，则判定该样本为egfr基因t790m突变阳性；如果待检样本cy5通道检测结果为阳性，且rox通道检测结果为阳性，则判定该样本为egfr基因c797s突变阳性。
[0067]
试验例1检测egfr基因t790m和c797s突变的不同检测方法的准确度对比
[0068]
收集30份血浆样本同时进行ngs和本试剂盒的对比检测，保证样本中被测物的稳定。使用qiagen：qiaamp circulating nucleic kit(货号：55114)试剂盒进行血浆样本提取。提取的dna立即用原液检测，无需稀释。按照上述方法进行egfr基因c797s和t790m顺反式突变的数字pcr检测，并与ngs检测结果对比。
[0069]
结果表明：数字pcr结果与ngs检测结果完全一致，说明本发明可准确的检测血浆样本中的c797s和t790m顺反式突变。
[0070]
试验例2检测egfr基因t790m和c797s突变的精密度
[0071]
使用准确度试验中的1号，2号，3号样本，共计3个样本。通过准确度测试计算得到突变情况，按照突变比例，将3个样本进行样本稀释，采用3中不同的突变比例(5％，1％，0.5％)，每个样本连续检测5天，每次实验重复检测3次，共计检测15次。
[0072]
结果表明，对同一或相似被测对象重复测量，得到测量示值或测得量值间的一致程度≥90％，符合卫生部行业标准。
[0073]
试验例3检测egfr基因t790m和c797s突变的最低检测限
[0074]
使用准确度试验中的4号，5号，6号样本，共计3个样本。通过准确度测试计算得到突变情况，将样本分别稀释到100copies/ml，50copies/ml，30copies/ml，20copies/ml，10copies/ml。
[0075]
将上述稀释的样本上机检测，重复3次。
[0076]
结果表明，最低检测限可达30copies/ml。
[0077]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。