用于促进CHO细胞悬浮的CRISPR-Cas13d系统以及重组CHO细胞的制作方法

用于促进cho细胞悬浮的crispr-cas13d系统以及重组cho细胞
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于促进cho细胞悬浮的crispr-cas13d系统以及重组cho细胞。


背景技术：

[0002]
生物制药离不开细胞表达系统，而最常用的细胞系则是中国仓鼠卵巢细胞(chinese hamster ovary，cho)表达系统。
[0003]
1987年，基因泰克公司的tpa被fda批准，这是第一个cho细胞表达的上市药品。之后，cho细胞作为哺乳动物蛋白表达系统全面走入制药行业。cho细胞大规模培养技术及其生物反应器工程可广泛应用于抗体、基因重组蛋白质药物、病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产。
[0004]
cho细胞最初是上皮贴壁形成纤维细胞，在培养器皿面形成单细胞层，培养空间极其有限，传代时受到蛋白水解酶、机械力等造成的创伤，传代后细胞生长速率下降。经多次传代筛选后，cho也可悬浮生长。但是，将贴壁细胞转化为悬浮细胞需要多次驯化，效率很低。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种用于促进cho细胞悬浮的crispr-cas13d系统以及重组cho细胞。
[0006]
本发明提供了用于抑制igfbp4基因表达的物质的应用，为如下(ⅰ)和/或(ⅱ)和/或(ⅲ)：
[0007]
(ⅰ)促进cho细胞增殖；
[0008]
(ⅱ)促进cho细胞悬浮；
[0009]
(ⅲ)促进cho细胞由贴壁细胞向悬浮细胞转化。
[0010]
本发明还提供了一种促进cho细胞增殖和/或促进cho细胞悬浮的方法，包括如下步骤：在cho细胞中导入抑制igfbp4基因表达的物质。
[0011]
本发明还提供了一种促进cho细胞由贴壁细胞向悬浮细胞转化的方法，包括如下步骤：在cho细胞中导入抑制igfbp4基因表达的物质。
[0012]
以上任一所述用于抑制igfbp4基因表达的物质可为下述任一所述的crispr-cas13d系统。
[0013]
本发明还保护一种sgrna，命名为sgrna
igfbp4-1
，其靶序列结合区如序列表的序列3中第1至22位核苷酸所示。具体来说，所述sgrna
igfbp4-1
如序列表的序列3所示。
[0014]
本发明还保护一种特异dna分子，其转录得到所述sgrna
igfbp4-1
。
[0015]
本发明还保护一种特异重组质粒，其表达所述sgrna
igfbp4-1
和cas13d蛋白。
[0016]
本发明还保护表达sgrna
igfbp4-1
和cas13d蛋白的重组慢病毒。所述重组慢病毒的制
备方法具体如下：将cas13d-igfbp4-1质粒、pspax2质粒和vsvg质粒共转染哺乳动物细胞(具体可为293t细胞)，然后培养细胞并收集上清，即为重组慢病毒病毒液。
[0017]
本发明还保护一种crispr-cas13d系统，为如下(b1)或(b2)或(b3)或(b4)或(b5)：
[0018]
(b1)包括sgrna
igfbp4-1
和cas13d蛋白；
[0019]
(b2)包括所述特异dna分子和cas13d基因；
[0020]
(b3)包括具有所述特异dna分子的质粒和具有cas13d基因的质粒；
[0021]
(b4)包括所述特异重组质粒；
[0022]
(b5)包括所述重组慢病毒。
[0023]
以上任一所述特异重组质粒具体可为cas13d-igfbp4-1质粒。
[0024]
cas13d-igfbp4-1质粒如序列表的序列2所示。
[0025]
对于(b4)来说，所述crispr-cas13d系统还包括pspax2质粒和vsvg质粒。具体的，所述crispr-cas13d系统还包括用于慢病毒包装的哺乳动物细胞(具体可为293t细胞)。
[0026]
本发明还保护将所述重组慢病毒导入cho细胞得到的重组cho细胞。所述重组cho细胞的增殖能力和/或悬浮能力显著提高，可以作为生物反应器用于生物制药。
[0027]
以上任一所述igfbp4基因为编码igfbp4蛋白的基因。
[0028]
igfbp4蛋白为如下(c1)或(c2)：
[0029]
(c1)序列表的序列4所示的蛋白质；
[0030]
(c2)来源于cho细胞且与(c1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
[0031]
igfbp4基因为如下(d1)或(d2)或(d3)：
[0032]
(d1)编码区如序列表的序列1中第1-765位核苷酸所示的dna分子；
[0033]
(d2)序列表的序列1所示的dna分子；
[0034]
(d3)来源于cho细胞且与(d1)或(d2)具有98％以上同一性且编码igfbp4蛋白的dna分子。
[0035]
以上任一所述cas13d基因为编码cas13d蛋白的基因。
[0036]
cas13d蛋白为如下(e1)或(e2)：
[0037]
(e1)序列表的序列5所示的蛋白质；
[0038]
(e2)来源于cho细胞且与(e1)具有98％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。
[0039]
cas13d基因为如下(f1)或(f2)：
[0040]
(f1)编码区如序列表的序列2中第2646-5552位核苷酸所示的dna分子；
[0041]
(f2)来源于cho细胞且与(f1)具有98％以上同一性且编码cas13d蛋白的dna分子。
[0042]
本发明的发明人筛选特定的靶点，设计了特定的sgrna，通过crispr/cas13d系统有效抑制了cho细胞中的igfbp4基因表达，得到了重组cho细胞。与野生型cho细胞相比，可极大缩短cho细胞适应悬浮生长的时间，重组cho细胞的增殖能力和/或悬浮能力极其显著的提高。所述重组细胞可以作为生物反应器，大大提高生物制品的产量。本发明对于生物制药领域具有巨大的应用前景。
附图说明
[0043]
图1为cas13d-igfbp4-1质粒的结构示意图。
[0044]
图2为实施例3中试验第17天的细胞照片。
[0045]
图3为实施例3中western blot的结果图。
[0046]
图4为实施例3中实时定量pcr检测的结果。
[0047]
图5为实施例3中各个时间点的细胞浓度统计结果。
具体实施方式
[0048]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0049]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。无缝连接试剂盒：北京擎科新业生物技术有限公司，货号为tsv-s2。pspax2质粒：addgene，addgene#12260。vsvg质粒(全称为pcmv-vsv-g)：addgene，addgene#8454。ef1a-casrx-2a-egfp质粒：addgene，addgene#109049。lenticrispr v2质粒：addgene，addgene#52961。megatran 1.0转染试剂：origen，tt200004。cho细胞：国家生物医学实验细胞资源库。
[0050]
如无特殊说明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0051]
实施例1、重组质粒的构建
[0052]
一、构建慢病毒表达载体lenticrispr-cas13d-egfp
[0053]
1、以ef1a-casrx-2a-egfp质粒为模板，采用f1和r1组成的引物对进行pcr扩增，回收pcr扩增产物(约3.8kb)，pcr扩增产物中具有cas13d蛋白和egfp蛋白的编码基因。
[0054]
f1：5'-cagaacacaggaccggtatgagccccaagaagaag-3'；
[0055]
r1：5'-gtttgttgcgccggatcccttgtacagctcgtccat-3'。
[0056]
2、取lenticrispr v2质粒，采用限制性内切酶xhoⅰ和hindⅲ进行双酶切，回收线性大片段(约8.8kb)。
[0057]
3、采用无缝连接试剂盒，将步骤1得到的扩增产物和步骤2得到的线性大片段连接，得到环形质粒，即为慢病毒表达载体lenticrispr-cas13d-egfp，简称lenticrispr-cas13d-egfp质粒。
[0058]
二、构建cas13d-igfbp4-1质粒和cas13d-igfbp4-2质粒
[0059]
发明人通过分析仓鼠igfbp4基因序列(如序列表的序列1所示，序列1中编码框为第1-765位)，选择确定了靶向igfbp4 mrna的特异性序列。
[0060]
igfbp4-1正义链：5'-tggctttatatatcttcaccaagtgctggtgtgtggatcgcagttttagagctagaaatagc-3'；
[0061]
igfbp4-1反义链：5'-gctatttctagctctaaaactgcgatccacacaccagcacttggtgaagatatataaagcca-3'。
[0062]
igfbp4-2正义链：5'-tggctttatatatcttcaccggtccgagtcctggctctctggttttagagctagaaatagc-3'；
[0063]
igfbp4-2反义链：5'-gctatttctagctctaaaaccagagagccaggactcggaccggtgaagatatataaagcca-3'。
[0064]
igfbp4-1正义链、igfbp4-1反义链、igfbp4-2正义链和igfbp4-2反义链均为单链
dna分子。分别合成igfbp4-1正义链和igfbp4-1反义链，然后混合并进行退火，得到双链dna分子，命名为dna分子igfbp4-1。分别合成igfbp4-2正义链和igfbp4-2反义链，然后混合并进行退火，得到双链dna分子，命名为dna分子igfbp4-2。
[0065]
取lenticrispr-cas13d-egfp质粒，用限制性内切酶bsmb i进行酶切，回收线性载体。
[0066]
采用无缝连接试剂盒，将dna分子igfbp4-1与线性载体连接，得到重组质粒lenticrispr-cas13d-egfp-igfbp4-1，简称cas13d-igfbp4-1质粒。采用无缝连接试剂盒，将dna分子igfbp4-2与线性载体连接，得到重组质粒lenticrispr-cas13d-egfp-igfbp4-2，简称cas13d-igfbp4-2质粒。
[0067]
经测序，cas13d-igfbp4-1质粒的全序列如序列表的序列2所示。与cas13d-igfbp4-1质粒相比，cas13d-igfbp4-2质粒的差异仅在于将“aagtgctggtgtgtggatcgca”替换为了“ggtccgagtcctggctctctg”。
[0068]
cas13d-igfbp4-1质粒的结构示意图见图1。cas13d-igfbp4-1质粒表达序列表的序列3所示的sgrna
igfbp4-1
。cas13d-igfbp4-1质粒中，第2646-5552位核苷酸为cas13d基因(2907bp)，第5688-6404位核苷酸为egfp基因(717bp)，第6470-7066位核苷酸为puror基因(597bp)。
[0069]
实施例2、利用哺乳动物细胞表达慢病毒，得到重组慢病毒病毒液
[0070]
1、将293t细胞接种于培养皿(直径为6cm)，采用dmem培养基培养24h(此时细胞密度为50％-70％，细胞数量约为1
×
106个)。
[0071]
2、将1μg cas13d-igfbp4-1质粒、0.5μg pspax2质粒和0.5μg vsvg质粒加至200μl不含血清双抗的dmem培养基中，振荡混匀，然后加入10μl megatran 1.0转染试剂，再次振荡混匀，然后室温静置10min。此为1个培养皿的加入量。
[0072]
3、将步骤2得到的混合液加入至完成步骤1的培养皿中，37℃培养48h。
[0073]
4、完成步骤3后，收集上清液，即为igfbp4-1病毒液。
[0074]
用cas13d-igfbp4-2质粒代替cas13d-igfbp4-1质粒，依次进行上述步骤1至4，得到igfbp4-2病毒液。
[0075]
实施例3、重组cho细胞的制备和增殖/悬浮性能比较
[0076]
1、采用dmem培养基在6cm培养皿中培养cho细胞，至密度约为60％，每个培养皿中的细胞数量约为1
×
106个。
[0077]
2、igfbp4-1组：完成步骤1后，加入300μl实施例1制备的igfbp4-1病毒液并培养24小时；然后更换新的dmem培养基，再加入300μl实施例1制备的igfbp4-1病毒液并培养24小时；然后采用含1μg/ml嘌呤霉素的dmem培养基培养7天(每隔一天更换新的含1μg/ml嘌呤霉素的dmem培养基)；然后采用dmem培养基培养(每隔一天更换新的dmem培养基)。只有重组cho细胞才可以在含有嘌呤霉素的培养基中存活，野生型cho细胞被嘌呤霉素杀死。步骤2中连续计天数，试验第1天第一次加入病毒液，试验第2天第二次加入病毒液，试验第3天至第9天采用含1μg/ml嘌呤霉素的dmem培养基培养，试验第10天开始采用dmem培养基培养。
[0078]
3、igfbp4-2组：用igfbp4-2病毒液代替igfbp4-1病毒液，其他同igfbp4-1组。
[0079]
4、野生型组：不加入病毒液，其他同igfbp4-1组。
[0080]
步骤2、3、4为平行操作。
[0081]
二、每天取样细胞，拍照并统计细胞直径大小。
[0082]
试验第17天的细胞照片见图2。感染igfbp4-1病毒液后，得到了具有egpf荧光的重组cho细胞，且重组cho细胞主要为悬浮状态。感染igfbp4-2病毒液后，得到了具有egpf荧光的重组cho细胞，且重组cho细胞主要为贴壁状态。
[0083]
三、western印迹检测
[0084]
试验第12天，收集细胞。提取细胞总蛋白，进行western blot。western blot采用的抗体为igfbp4抗体(abcam，ab239594)或β-actin抗体(santa cruz biotechnology,sc-47778hrp)。β-actin作为内参。
[0085]
结果见图3。感染igfbp4-1病毒液后的重组cho细胞的全蛋白中基本观察不到igfbp4蛋白。感染igfbp4-2病毒液后的重组cho细胞的全蛋白中的igfbp4蛋白丰度相对正常cho细胞无显著差异。
[0086]
四、逆转录和实时定量pcr检测
[0087]
试验第12天，收集细胞。提取细胞的总rna，然后反转录得到cdna。以cdna为模板，采用实时定量pcr检测igfbp4基因的表达水平。以β-actin基因为内参基因。利用2-δδct
公式计算基因的igfbp4基因的相对表达量。
[0088]
用于检测igfbp4基因的引物如下：
[0089]
上游引物：5'-tcccaacaacagcttcaacc-3'；
[0090]
下游引物：5'-cttgctccgatctcgcattt-3'。
[0091]
用于检测β-actin基因的引物如下：
[0092]
上游引物：5'-gccttccttcttgggtatgg-3'；
[0093]
下游引物：5'-caatgcctgggtacatggtg-3'。
[0094]
结果见图4。与正常cho细胞相比，感染igfbp4-1病毒液后的重组cho细胞的igfbp4基因表达水平极其显著下降，感染igfbp4-2病毒液后的重组cho细胞的igfbp4基因表达水平无显著差异。
[0095]
五、细胞增殖性能的比较
[0096]
细胞培养条件均为：置于37℃、5％co2培养箱中150rpm振荡培养。
[0097]
sfm4cho培养基：thermo fisher scientific。
[0098]
1、igfbp4-1组细胞的增殖性能
[0099]
(1)igfbp4-1组完成步骤一后，收集细胞。
[0100]
(2)取步骤(1)得到的细胞，进行消化和计数，然后接种至含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为5
×
105个细胞/ml，然后培养72小时。
[0101]
(3)完成步骤(2)后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
[0102]
(4)取步骤(3)得到的细胞，悬浮于30ml含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为5
×
105个细胞/ml，然后培养至细胞浓度为1
×
106细胞/ml。
[0103]
(5)完成步骤(4)后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
[0104]
(6)取步骤(5)得到的细胞，悬浮于30ml含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为5
×
105细胞/ml，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养48小时后(试验第2天时间点)细胞浓度达到1.3
×
106细胞/ml。
[0105]
(7)步骤(6)中培养48小时后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
[0106]
(8)取步骤(7)得到的细胞，悬浮于30ml含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为3
×
105细胞/ml，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第5天时间点)细胞浓度达到1.35
×
106细胞/ml。
[0107]
(9)步骤(8)中培养72小时后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
[0108]
(10)取步骤(9)得到的细胞，悬浮于30ml含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为3
×
105细胞/ml，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第8天时间点)细胞浓度达到1.46
×
106细胞/ml。
[0109]
2、igfbp4-2组细胞的增殖性能
[0110]
(1)igfbp4-2组完成步骤一后，收集细胞。
[0111]
(2)取步骤(1)得到的细胞，进行消化和计数，然后接种至含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为5
×
105个细胞/ml，然后培养72小时。
[0112]
(3)完成步骤(2)后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
[0113]
(4)取步骤(3)得到的细胞，悬浮于30ml含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为5
×
105个细胞/ml，然后培养至细胞浓度为1
×
106细胞/ml。
[0114]
(5)完成步骤(4)后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
[0115]
(6)取步骤(5)得到的细胞，悬浮于30ml含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为5
×
105细胞/ml，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第3天时间点)细胞浓度仍未达到1
×
106细胞/ml。
[0116]
(7)步骤(6)中培养72小时后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
[0117]
(8)取步骤(7)得到的细胞，悬浮于30ml含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为5
×
105细胞/ml，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第6天时间点)细胞浓度仍未达到1
×
106细胞/ml。
[0118]
(9)步骤(8)中培养72小时后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
[0119]
(10)取步骤(9)得到的细胞，悬浮于30ml含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为5
×
105细胞/ml，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第9天时间点)细胞浓度刚刚达到1
×
106细胞/ml。
[0120]
3、野生型组细胞的增殖性能
[0121]
(1)野生型组完成步骤一后，收集细胞。
[0122]
(2)取步骤(1)得到的细胞，进行消化和计数，然后接种至含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为5
×
105个细胞/ml，然后培养72小时。
[0123]
(3)完成步骤(2)后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
[0124]
(4)取步骤(3)得到的细胞，悬浮于30ml含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为5
×
105个细胞/ml，然后培养至细胞浓度为1
×
106细胞/ml。
[0125]
(5)完成步骤(4)后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
[0126]
(6)取步骤(5)得到的细胞，悬浮于30ml含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为5
×
105细胞/ml，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第3天时间点)细胞浓度仍未达到1
×
106细胞/ml。
[0127]
(7)步骤(6)中培养72小时后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
[0128]
(8)取步骤(7)得到的细胞，悬浮于30ml含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度
为5
×
105细胞/ml，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第6天时间点)细胞浓度仍未达到1
×
106细胞/ml。
[0129]
(9)步骤(8)中培养72小时后，1200rpm离心5分钟，收集细胞。
[0130]
(10)取步骤(9)得到的细胞，悬浮于30ml含10％fbs的sfm4cho培养基，使细胞浓度为5
×
105细胞/ml，然后培养，每24小时检测细胞浓度，培养72小时后(试验第9天时间点)细胞浓度达到1.23
×
106细胞/ml。
[0131]
各组细胞在上述各个步骤中的各个时间点的细胞浓度见图5。
[0132]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。