阳离子多聚体DNA复合物及促进目标质粒转染细胞及表达的方法与流程

本发明涉及一种促进质粒转染细胞及表达的方法，具体的，尤其涉及一种利用阳离子多聚体dna复合物促进目标质粒转染细胞及表达的方法，属于基因工程技术领域。

背景技术：

基因递送是指将外源特定基因通过适合的方式导入到靶细胞内并表达出特定蛋白的过程，它作为基因工程的重要环节之一，被广泛应用于细胞工程、蛋白质工程和酶工程等领域中，例如重组蛋白质的开发和生产、传统蛋白质和酶的规模化生产与制备等；除此之外，它也被应用于一些生物药品的制备中，例如生物疫苗的制备、特定生物多肽和蛋白质药物的制备等。基因递送的关键在于载体的选择，目前，用于基因递送的载体主要分为病毒载体和非病毒载体。非病毒载体主要包括改性天然高分子和合成高分子两大类。其中，改性天然高分子类主要包括一些脂质类、多糖类和蛋白类载体；合成高分子类主要是指一些可以生物降解的聚阳离子性的高分子载体。非病毒载体具有无传染性、来源广、材料易得、装载容量大、操作简便和可大量制备等优点，因此在工业化生产中被广泛运用于大量制备酶或蛋白质。非病毒载体作为基因递送的载体之一，具有无传染性、来源广、装载容量大、操作简便和可大量制备等优点，被广泛应用于工业化生产酶或其它蛋白质。但由于非病毒载体有限的使用量和转染效率，在一定程度上限制了其应用。其中，聚乙烯酰胺(pei)因其较高效的转染效率已成为了目前基因递送的常用非病毒载体之一，它是分子量在200da至1500kda左右的合成高分子材料，主要有分支状和线性两种结构形式，其中分子量更小的线性pei具有更加优良的递送效果。转染时，将线性pei与待转dna分子共孵育，pei通过形成表面带有阳离子的球状聚合物将dna分子包裹入内，与细胞膜表面的阴离子结合后将dna分子递送入细胞，并能通过质子海绵作用进行胞内体逃逸，使外源质粒免于被酶降解从而被顺利递送至细胞核内进而高效表达。但在实际运用当中，pei的转染效率在某些细胞中十分有限，并且pei本身具有一定细胞毒性，有限的添加剂量也在一定程度上影响了转染效率。由此可见，运送载体的局限性在一定程度上限制了基因递送在各个领域上进一步的应用和发展，因此，本发明提出一种用于促进质粒表达的基因递送增强试剂有利于推动各相关领域的快速发展。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供一种阳离子多聚体dna复合物以及利用阳离子多聚体dna复合物促进目标质粒转染细胞及表达的方法，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种阳离子多聚体dna复合物，它是由辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂孵育形成。

本发明实施例提供了一种利用阳离子多聚体dna复合物促进质粒表达的方法，其包括：

以包含目标基因的质粒、辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后共转染宿主细胞；

或者，先以包含目标基因的质粒和辅助dna中的任意一者与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染宿主细胞，之后再在设定时间内以目标基因的质粒和辅助dna中的另一者与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染所述宿主细胞。

在一些优选实施例中，所述方法包括：

将包含目标基因的质粒、辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染宿主细胞；

或者，先以包含目标基因的质粒与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染宿主细胞，之后再在选定时间内以辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染所述宿主细胞，所述设定时间小于12h；

或者，先以辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染宿主细胞，之后再在选定时间内以包含目标基因的质粒与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染所述宿主细胞，所述设定时间小于9h。

进一步地，所述方法包括：

将包含目标基因的质粒和/或辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂在选定缓冲液中混合反应，形成阳离子多聚体dna复合物；以及

以所述阳离子多聚体dna复合物转染宿主细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果至少在于：

本发明提供的利用阳离子多聚体dna复合物促进质粒对体外细胞的转染效率，促进质粒表达的方法，即设计一种辅助dna分子，将其与(表达egfp绿色荧光蛋白基因的)目标(质粒)dna共转染细胞，通过荧光显微镜观察和流式细胞仪分析发现，在共转染的条件下，辅助dna分子与带正电荷的细胞转染试剂形成的阳离子多聚体dna复合物能高效地提高阳离子多聚体递送外源基因的能力并显著提高外源目标蛋白的表达量至少5倍以上，表明阳离子多聚体dna复合物能够作为转染增强剂促进目标质粒的表达；并且材料易获得，实施过程简单，对推动酶或蛋白质的规模化生产和细胞工程、蛋白质工程、酶工程等领域的发展有着至关重要的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中的pcmv-egfp目标质粒图谱。

图2a是本发明实施例1中共转染不同dna分子时，pcmv-egfp目标质粒表达荧光显微镜观察结果图。

图2b是本发明实施例1中共转染不同dna分子时目标质粒表达荧光流式分析结果图。

图3a是本发明实施例1中转染不同质量puc-u6-backbone辅助质粒时，pcmv-egfp目标质粒表达荧光显微镜观察结果图。

图3b是本发明实施例1中转染不同质量puc-u6-backbone辅助质粒时，pcmv-egfp目标质粒表达荧光流式分析结果图。

图4a是本发明实施例1中不同时间间隔点转染辅助质粒时，pcmv-egfp目标质粒表达荧光显微镜观察结果图。

图4b是本发明实施例1中不同时间间隔点转染辅助质粒时，pcmv-egfp目标质粒表达流式分析结果图。

具体实施方式

鉴于现有技术的不足，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，其主要是提供一种促进(质粒)dna对体外细胞的转染效率的方法，即设计提供另外一种辅助dna分子，将其与(表达egfp绿色荧光蛋白基因的)目标(质粒)dna共转染细胞，通过荧光显微镜观察和流式细胞仪分析发现，在共转染的条件下，辅助dna分子与带正电荷的细胞转染试剂(如聚乙烯亚胺pei)形成的pei-dna聚合物能明显提高外源目标蛋白的表达量至5倍以上，表明阳离子多聚体dna复合物能够作为转染增强剂促进目标质粒的表达。

如下将对该技术方案、其实施过程及原理等作进一步的解释说明。

本发明实施例的一个方面提供了一种阳离子多聚体dna复合物，它是由辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂孵育形成。

在一些优选实施例中，所述细胞转染试剂包括聚阳离子性高分子化合物，优选自线性聚乙烯亚胺，尤其优选为分子量为25kda的线性聚乙烯亚胺，但不限于此。

在一些优选实施例中，所述辅助dna包括环状质粒、线性质粒、双链dna、单链dna和细胞基因组酶切片段等中的任意一种，优选为puc-u6-backbone，但不限于此。

本发明中的辅助dna为普通核苷酸片段，不限长短、形式和结构，来源广泛，更易获得，不需要特殊处理，操作更加简单，本发明的辅助dna与阳离子聚合物pei共孵育后能显著提高目标基因的转染及表达效率，并且毒性小，效率高。

本发明实施例的一个方面提供了一种利用阳离子多聚体dna复合物促进质粒表达的方法，其包括：

以包含目标基因的质粒、辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后共转染宿主细胞；

或者，先以包含目标基因的质粒和辅助dna中的任意一者与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染宿主细胞，之后再在设定时间内以目标基因的质粒和辅助dna中的另一者与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染所述宿主细胞。

在一些优选实施例中，所述方法包括：

将包含目标基因的质粒、辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染宿主细胞；

或者，先以包含目标基因的质粒与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染宿主细胞，之后再在选定时间内以辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染所述宿主细胞，所述设定时间小于12h，优选小于9h，更优选为6h以内，进一步优选为3h以内；

或者，先以辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染宿主细胞，之后再在选定时间内以包含目标基因的质粒与带正电荷的细胞转染试剂共孵育后转染所述宿主细胞，所述设定时间小于9h，优选为6h以内，更优选为3h以内。

在一些优选实施例中，所述方法包括：

将包含目标基因的质粒和/或辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂在选定缓冲液中混合反应，形成阳离子多聚体dna复合物；以及

以所述阳离子多聚体dna复合物转染宿主细胞。

在一些更具体的实施例中，所述方法包括：以选定缓冲液分别将包含目标基因的质粒和/或辅助dna、细胞转染试剂配置为第一转染液、第二转染液；

将第二转染液分批加入第一转染液，从而反应形成阳离子多聚体dna复合物。

进一步地，所述方法具体包括：将第二转染液滴加入第一转染液，共孵育从而反应形成阳离子多聚体dna复合物。

进一步地，所述选定缓冲液包括hbs缓冲液，但不限于此。

在一些优选实施例中，所述含目标基因的质粒和/或辅助dna与细胞转染试剂的质量体积比为1：0.6～2。

进一步地，所述辅助dna与包含目标基因的质粒的质量比为1:1～5。

在一些优选实施例中，所述细胞转染试剂包括聚阳离子性高分子化合物，优选自线性聚乙烯亚胺，尤其优选为分子量为25kda的线性聚乙烯亚胺，但不限于此。

在一些优选实施例中，所述辅助dna包括环状质粒、线性质粒、双链dna、单链dna和细胞基因组酶切片段等中的任意一种，优选为puc-u6-backbone，但不限于此。

本发明中的辅助dna为普通核苷酸片段，不限长短、形式和结构，来源广泛，更易获得，不需要特殊处理，操作更加简单，本发明的辅助dna与阳离子聚合物pei共孵育后能显著提高目标基因的转染及表达效率，并且毒性小，效率高。

在一些优选实施例中，所述含目标基因的质粒包括pcmv-egfp质粒，但不限于此。

为使方案进一步优化，本发明涉及多方面的验证，包括不同形式的辅助dna，辅助dna用量以及转染时机等，具体技术方案如下：

本发明中涉及的带正电荷的细胞转染试剂为50mmol的线性聚乙烯亚胺(pei)。转染前一天铺24孔板，待细胞密度达到70％-80％时，进行转染，dna与pei比例为1：2(μg：μl)。将待转质粒和pei试剂分别与hbs混匀配制成15ul的a、b混合液，室温静置10-15分钟后将b液逐滴加入a液内，充分混匀，室温静置10-15min后形成dna-pei复合物，将复合物逐滴加入事先换为无抗生素细胞培养基的细胞培养孔中，轻摇混匀。后续培养过程中及时更换细胞培养基以保证细胞活性。

本发明通过多种技术方案证明阳离子多聚体dna复合物能够促进质粒的表达：

第一，不同形式的辅助dna，包括环状质粒、线性质粒、双链dna片段、22bp合成寡核苷酸以及细胞基因组酶切片段。本发明中涉及的目标质粒为pcmv-egfp质粒。将目标质粒和辅助质粒用pei共转染hek293细胞，24h后利用荧光显微镜和流式分析技术比较其与目标质粒单独转染细胞的差异。结果发现辅助dna的加入都能够显著提高egfp阳性细胞的比率，且线性质粒的提高效应最显著。

第二，设定不同的辅助dna转染用量，转染及检测方法同上。结果显示，低剂量的辅助dna即可提高目标质粒的转染效率，且辅助dna剂量与荧光细胞比率成正相关，即随着辅助dna分子用量的提高荧光细胞的比率也在提高。本领域技术人员可根据实际需要选择合适的剂量进行使用。其中，24孔细胞板中辅助dna质粒合适的添加量为50ng-200ng。

第三，目标质粒与辅助dna转染细胞的顺序和时机的考量，转染及检测方法同上。结果显示，辅助dna与目标质粒共转染时效率提高最显著，且随着二者转染的时间间隔增加，效率提高效应逐渐减弱。

综上所述，阳离子多聚体dna复合物能够显著提高共转染目标基因的转染和表达。

藉由上述技术方案，本发明提供的阳离子多聚体dna复合物，以及利用阳离子多聚体dna复合物促进(质粒)dna对体外细胞的转染效率，促进质粒表达的方法，即设计一种辅助dna，将其与(表达egfp绿色荧光蛋白基因的)目标(质粒)dna共转染细胞，通过荧光显微镜观察和流式细胞仪分析发现，在共转染的条件下，辅助dna与带正电荷的细胞转染试剂形成的阳离子多聚体dna复合物能高效地提高阳离子多聚体递送外源基因的能力并显著提高外源目标蛋白的表达量至少5倍以上，表明阳离子多聚体dna复合物能够作为转染增强剂促进目标质粒的表达；并且材料易获得，实施过程简单，对推动酶或蛋白质的规模化生产和细胞工程、蛋白质工程、酶工程等领域的发展有着至关重要的意义。

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。若非特别说明，则下列实施例中使用的各种试剂均是本领域技术人员熟知的，并可以通过市场购买等途径获取。而下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

本实施例涉及一种利用阳离子多聚体dna复合物促进质粒表达的方法，具体实验方法包括如下步骤：

(1)重组质粒的制备：

a.pcmv-egfp质粒的制备

pcmv-egfp质粒包含aav2的两个itr和cmv启动子、beta-globin内含子、编码egfp基因、hghpolya序列，由实验室构建保存(参考文献：李泰明等，昆虫细胞制备aav-itr基因表达微载体，生物工程学报，2015,31(8)，1232页，1.2.1方法中的“构建pcmv-egfp质粒”)，如图1所示。

b.puc-u6backbone和pmd-19t-prdx6辅助质粒的制备

puc-u6-backbone质粒的以不含bsai酶切位点的puc57质粒为骨架，由上海生工生物工程股份有限公司合成mlui-u6-bsai-bsai-tttttt-bsteii基因序列后插入到msc多克隆位点上。该质粒包含aav2的两个itr和u6启动子、pucorigin、f1origin、绝缘子和amp序列，它没有基因编码序列。此质粒由上海生工生物工程股份有限公司构建。质粒骨架来源于pmd-19t反向质粒(购自takara公司)，具有t载质粒的基本结构元件。首先针对无关基因prdx6设计一对上下游引物后用kod酶进行高保真pcr扩增，接着用taq酶进行普通pcr得到加a后的目的基因，直接回收pcr产物利用t4连接酶与pmd-19t线性质粒连接即获得pmd-19t-prdx6。

c.小鼠细胞基因组酶切片段

将c57小鼠断颈处死，取大腿肌肉组织，用液氮研磨，然后利用试剂盒抽提细胞中的总dna(购自天根公司)。然后用酶切，dna纯化得到基因组片段。

d.22bp寡核苷酸片段

分别合成两条互补配对的长度为22bp的引物序列，加入退火缓冲液(碧云天公司)，用pcr进行缓慢降温，得到双链寡核苷酸片段。

(2)hbs缓冲液和pei转染试剂的配制方法

配制hbs缓冲液时，称取0.954g羟乙基哌嗪乙硫磺酸和1.754gnacl溶于180mlddh2o中，用1m的naoh或hcl调节ph值至7.4，再用ddh2o定容至200ml，0.22μm滤膜过滤除菌后，-20℃保存。

配制50mmol/lpei溶液时，称取0.0215gpei(分子量为25kda的线性pei)溶于9ml事先预热至75℃的ddh2o中，加hcl后搅拌3h，待pei溶解完全后加naoh调节ph值至7.4，再用ddh2o定容至10ml，0.22μm滤膜过滤除菌后，-20℃保存。每次使用前于室温将pei储存液充分溶解，以保证每次使用的浓度相同。

(3)细胞培养方法

使用高糖dmem完全培养基(添加10％胎牛血清和1％青霉素和链霉素双抗)培养hek293细胞(购自美国菌种保藏中心)，细胞贴壁生长于37℃、5％co2的恒温培养箱中。转染前一天，倒尽t25细胞培养瓶中的培养基，用1mlpbs润洗一遍后添加1ml0.05％胰酶，放于37℃培养箱中消化2-3分钟，显微镜下观察细胞成片飘落后添加1.5ml含血清的高糖dmem完全培养基，贴壁轻轻吹打后将细胞液吸入15ml离心管中，250g离心5分钟，1ml培养基贴壁轻轻重悬细胞后利用血球计数板计数，接种30万左右细胞于24孔板内进行培养，使第二天细胞密度达到70％-80％。

(4)使用pei转染试剂转染质粒方法

dna与pei的比例控制在1:2(μg：μl)。待细胞密度达到70％-80％时，将孔内培养基更换为无抗生素的高糖dmem培养基后进行转染。用hbs缓冲液分别将待转dna和pei配制成两个15μl的转染体系，记为a、b液，立即漩涡震荡混匀，瞬时离心后室温下静置10-15min.，接着一边轻轻涡旋a液一边将b液加入逐滴加入(顺序不能颠倒，若没有条件，可以滴一滴b液后迅速混匀)，室温静置10-15min.，最后将a、b混合液轻轻加至24孔板中，轻摇混匀后，放入37℃培养箱中。4h后更换完全培养基，后续培养要及时更换培养基保证细胞状态完好。

(5)不同形式dna分子共转染pcmv-egfp质粒

为研究不同dna形式与阳离子多聚体形成复合物对质粒表达的促进作用，本实施例另外采用几种不同的形式的辅助dna分子，包括：环状质粒puc-u6-backbone、双链dna(2901bp酶切片段、3669bppcr产物)、22bp合成寡核苷酸以及小鼠肌肉细胞基因组酶切片段。使用pei作为转染试剂，按上述所述转染方法将辅助dna分子和pcmvegfp等比例(200ng)共转染入hek293细胞，24h后利用荧光显微镜观察egfp蛋白的表达情况，利用流式细胞仪分析egfp荧光表达百分比和强度，比较各组之间的荧光细胞比率差异。

流式细胞分析时细胞处理方法如下：

1)吸尽24孔中的培养基，每孔加入约250ul的pbs润洗细胞；

2)每孔加入约250μl的0.05％胰酶，37℃培养箱中消化2-3分钟，直至显微镜下观察细胞成片脱落；

3)每孔加入约500μl的含10％血清高糖dmem培养基，终止消化；

4)轻轻吹打细胞后，吸出细胞液于1.5mlep管中，250g离心5分钟；

5)ep管中加入700μlpbs，轻轻贴壁吹打重悬润洗细胞后，250g离心5分钟。

ep管中加入500μlpbs，轻轻贴壁吹打润洗细胞后将细胞液转入流式管中，准备上机分析。

图2a示出了共转染不同dna分子时，pcmv-egfp质粒表达荧光显微镜观察结果，图2b示出了共转染不同dna分子时，pcmvegfp质粒表达流式分析结果，通过荧光显微镜观察和流式分析发现，本实施例中采用的几种不同形式dna均能显著促进egfp蛋白的表达，说明组成阳离子多聚体dna复合物的dna分子不局限于某一特定种类，大多数的dna分子均能和pei形成复合物后促进质粒的表达。

(6)pei共转染不同质量的辅助dna分子和pcmv-egfp质粒

设置不同的辅助质粒puc-u6-backbone的转染质量(50ng、100ng、200ng、300ng)，使用pei作为转染试剂，按上述所述转染方法将不同质量的puc-u6-backbone和200ngpcmv-egfp共转染入hek293细胞，24h后利用荧光显微镜观察egfp蛋白的表达情况，利用流式细胞仪分析egfp荧光表达百分比和强度，调控结果与单转染的结果比较。

图3a示出了转染不同质量puc-u6-backbone时，pcmv-egfp质粒表达荧光显微镜观察结果，图3b示出了转染不同质量puc-u6-backbone时，pcmv-egfp质粒表达流式分析结果(**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001.)，通过荧光显微镜观察和流式分析发现，50ngpuc-u6-backbone共转染已具有显著的促进表达作用，并且促进作用随着质量的增加逐渐增强，说明puc-u6-backbone与pei形成的阳离子多聚体dna复合物的调控作用十分明显，小剂量添加即可显著促进质粒的表达，毕竟促进作用具有剂量依赖性。

(7)不同时间间隔点先后转染puc-u6-backbone和pcmv-egfp质粒

为两个质粒设置不同的转染时间间隔点：1)先转染辅助质粒puc-u6-backbone，3h、6h、9h、12h后再转染pcmv-egfp；先转染目标质粒pcmv-egfp，3h、6h、9h、12h后再二次转染puc-u6-backbone；共转染puc-u6-backbone和pcmv-egfp；单独转染pcmv-egfp。

使用pei作为转染试剂，按上述所述转染方法将200ngpuc-u6-backbone和200ngpcmv-egfp按时间顺序先后转染入hek293细胞，24h后利用荧光显微镜观察egfp蛋白的表达情况，利用流式细胞仪分析egfp荧光表达百分比和强度。

图4a示出了不同时间间隔点转染时，pcmv-egfp质粒表达荧光显微镜观察结果，图4b示出了不同时间间隔点转染时，pcmv-egfp质粒表达流式分析结果，通过荧光显微镜观察和流式分析发现，1)当时间间隔为3和6小时时，egfp的表达量均显著提高，促进效果不受质粒转染顺序的影响；2)pcmv-egfp先转染时，促进效果比先转染puc-u6-backbone的效果好；3)当时间间隔为9小时时，先转染puc-u6-backbone不再具备促进egfp表达的功能；4)促进质粒表达的效果在时间间隔为12小时时消失；5)当两个质粒共转染时，egfp表达促进作用最强。说明puc-u6-backbone与pei形成的阳离子多聚体dna复合物的调控作用受两质粒转染时间间隔和转染顺序的影响，并且共转染时能发挥最大促进效果。

本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。

在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。

在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。

应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。

尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。