利用高保真聚合酶与UDG的基因克隆与定点突变方法与流程

本发明涉及基因工程领域，特别是高通量表达载体构建、基因定点突变等方面，更具体地说，它涉及一种利用高忠实性dna聚合酶与udg的基因克隆与基因定点突变方法。

背景技术：

dna连接酶和限制性内切酶使得体外重构特定dna成为了可能。体外重构dna又称基因克隆或基因工程，该技术极大地促进了现代蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术首先利用限制性核酸内切酶消化目标基因dna片段与质粒载体，然后dna连接酶连接环化目标基因与质粒，形成完整的重组质粒。由于限制性内切酶识别特定的dna序列，不同限制性内切酶的识别序列不同，彼此间的序列兼容性很差，特别是同时克隆多个不同基因时导致限制性内切酶的选择非常困难。

为了克服限制性内切酶克隆法的缺陷，开发了不依赖于连接酶的克隆方法。这些方法一般基于目标基因与质粒载体dna之间的一段互补的单链dna，单链dna的长度为12-25个核苷酸，从而保证互补单链dna配对后能够在常温形成稳定的双链dna(带dna缺口)。为了保证dna的正确率，扩增目标基因和载体的dna聚合酶一般采用高忠实性dna聚合酶。其中基于du修饰引物的基因克隆技术，利用带有du碱基的引物扩增目标基因和载体，然后利用尿嘧啶dna糖苷酶(udg)去除du碱基形成无碱基的核糖核酸位点，热碱处理无碱基位点断裂dna，形成单链dna。然而大部分高忠实性dna聚合酶活性受du碱基抑制。因此在基于du修饰引物的基因克隆技术中，目标基因和线性化载体片段都是用taqdna聚合酶扩增的，导致在目标基因(特别是长片段目标基因)和线性化载体片段中引入错误碱基。

技术实现要素：

为了克服du修饰引物基因克隆的上述缺陷，本发明提供了一种利用高保真聚合酶与udg的基因克隆与定点突变方法。具体技术方案如下：

一种利用高保真聚合酶与udg的基因克隆与定点突变方法，具体步骤如下：

(1)设计合成用于扩增目标基因与质粒载体的引物序列。引物的序列特征是：1)扩增目标基因与线性化载体的正向引物的5’端前10-25个碱基彼此互补配对，反向引物的5’端前10-25个碱基彼此互补配对；2)5’端前10-25个碱基中的dt碱基替换成du碱基，且相邻du碱基间隔5-10个正常碱基；3)引物3’端的18-25个碱基与目标模板dna互补配对。

(2)聚合酶链式反应(pcr)扩增含目标基因/线性化质粒dna片段。将正向引物与反向引物、目标基因dna模板分子(含目标基因的dna)/目标质粒dna、du耐受型高忠实性dna聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸(dntps)加入pcr反应缓冲液中，进行pcr反应。

(3)线性化质粒载体dna片段的限制性内切酶dpni消化。对扩增的线性化质粒载体pcr产物，用限制性核酸内切酶dpni消化野生型环状质粒模板。由于质粒模板具有多处gmatc序列，dpni处理使得质粒模板变成很多段短的dna双链，这些短的dna双链转化大肠杆菌不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性克隆。

(4)pcr片段的末端单链化。在目标基因与线性化载体pcr产物中加入热稳定性udg，在70-80度反应5-30分钟，在du碱基处形成无碱基位点并热断裂dna链，断裂的短片段dna链与互补链分离，从而在双链dna片段的两端产生长度为10-25个核苷酸的3’突出端。

(5)目标基因与线性化质粒载体dna片断间的杂交配对。udg处理后的目标基因与线性化载体缓慢降温至室温，放置5～15分钟，使二者的3’单链dna彼此杂交配对，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒。

(6)含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌。杂交混合物(即含目标基因的带缺口重组质粒、没有发生杂交配对的目标基因与线性化质粒片段)转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜。带缺口重组质粒的缺口会被大肠杆菌修复，形成含目标基因的完整重组质粒。

(7)带目的基因的重组质粒的测序鉴定。挑取单菌落，培养后菌落pcr鉴定含有目标基因的阳性克隆。培养克隆后抽提重组质粒dna，测序鉴定目标基因碱基序列是否正确。

综上所述，本发明具有以下有益效果：(1)利用耐受du碱基的高忠实性dna聚合酶进行载体与目的基因的pcr扩增反应，显著提高了扩增反应的忠实性，避免了低忠实性的taqdna聚合酶导致的额外基因突变，尤其适用于进行蛋白表达为目的的载体构建；(2)du与da碱基配对，配对结果等同于正常的dt/da配对，避免了修饰碱基引入额外错误碱基导致的基因突变；(3)热稳定性udg在60-80度仍具有酶活性，使得du碱基的去除与dna链的断裂同时进行，省略了加碱热裂解操作。

附图说明

图1为du修饰引物与udg进行的基因克隆流程图。

图2为du修饰引物与udg进行的基因定点突变流程图。

具体实施方式

在本实施例中用于扩增目标基因和线性化载体的引物具有如下特征：1)扩增目标基因及线性化载体的正向引物的5’端前15个碱基彼此互补配对，反向引物的5’端前15个碱基彼此互补配对，2)正向与反向突变引物的dt碱基替换成du碱基，且相邻du碱基间隔5个正常碱基，而且第15个碱基为du碱基。利用引物对分别pcr扩增目标基因、线性化载体。pcr产物经热稳定性udg在70-80度处理一段时间，会产生长15个核苷酸的3’单链dna尾巴。由于产生的3’单链dna尾巴的碱基序列互补配对，目标基因与线性化载体之间形成稳定的配对双链区，环化成带4个dna缺口的环状质粒。环状质粒转化大肠杆菌后，质粒载体上的dna缺口被大肠杆菌dna修复系统修复，形成完整的含有目标基因的重组dna分子。

利用高保真聚合酶与udg的基因克隆与定点突变方法具体步骤如下：

1、设计合成用于扩增目标基因与质粒载体的引物序列。引物的序列特征是：1)扩增目标基因与线性化载体的正向引物的5’端前15个碱基彼此互补配对，反向引物的5’端前15个碱基彼此互补配对；2)5’端前15个碱基中的dt碱基替换成du碱基，且相邻du碱基间隔5个正常碱基，另外第15个碱基为du碱基；3)引物3’端的22个碱基与目标模板dna互补配对。

2、聚合酶链式反应(pcr)扩增含目标基因/线性化质粒dna片段。将正向引物与反向引物、目标基因dna模板分子(含目标基因的dna)/目标质粒dna、du耐受型高忠实性dna聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸(dntps)加入pcr反应缓冲液中，进行pcr反应。

3、线性化质粒载体dna片段的限制性内切酶dpni消化。对扩增的线性化质粒载体pcr产物，用限制性核酸内切酶dpni消化野生型环状质粒模板。由于质粒模板具有多处gmatc序列，dpni处理使得质粒模板变成很多段短的dna双链，这些短的dna双链转化大肠杆菌不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性克隆。

4、pcr片段的末端单链化。在目标基因与线性化载体pcr产物中加入热稳定性udg，在70-80度反应5-30分钟，在du碱基处形成无碱基位点并热断裂dna链，断裂的短片段dna链与互补链分离，从而在双链dna片段的两端产生长度为15个核苷酸的3’突出端。

5、目标基因与线性化质粒载体dna片断间的杂交配对。udg处理后的目标基因与线性化载体缓慢降温至室温，放置5～15分钟，使二者的3’单链dna彼此杂交配对，形成含目标基因的带缺口环状重组质粒。

6、含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌。杂交混合物(即含目标基因的带缺口重组质粒、没有发生杂交配对的目标基因与线性化质粒片段)转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜。带缺口重组质粒的缺口会被大肠杆菌修复，形成含目标基因的完整重组质粒。

7、带目的基因的重组质粒的测序鉴定。挑取单菌落，培养后菌落pcr鉴定含有目标基因的阳性克隆。培养克隆后抽提重组质粒dna，测序鉴定目标基因碱基序列是否正确。

本实施例达到的有益效果：(1)利用耐受du碱基的高忠实性dna聚合酶进行载体与目的基因的pcr扩增反应，显著提高了扩增反应的忠实性，避免了低忠实性的taqdna聚合酶导致的额外基因突变，尤其适用于进行蛋白表达为目的的载体构建；(2)du与da碱基配对，配对结果等同于正常的dt/da配对，避免了修饰碱基引入额外错误碱基导致的基因突变。(3)热稳定性udg在60-80度仍具有酶活性，使得du碱基的去除与dna链的断裂同时进行，省略了加碱热裂解操作。