生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针及其制备方法与应用与流程

本发明属于生物标记及成像技术领域，特别涉及基于生物正交反应且具有时间分辨荧光响应性探针及其制备方法，具体涉及生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针及其制备方法与应用。

背景技术：

生物正交反应是一类能够在活体细胞内不干扰生物自身生化反应条件下进行的化学反应，主要包括有含有叠氮与炔基或磷酸基团、四嗪与烯烃或者反式环辛烯等，具有选择性高、反应迅速等特点。因此，发展生物正交反应探针在拓宽生物应用方面是十分必要的。

目前，该反应结合有机荧光小分子探针及其成像技术已广泛应用于生物标记及其成像领域。其中，对于糖蛋白的标记和成像在肿瘤细胞转移的基础研究、生物医学诊断方面具有重要意义。细胞膜表面的糖蛋白(glycans)、糖磷脂作为细胞膜重要组成部分，在许多生理过程中扮演着非常重要的角色，如癌症细胞的异常增殖与转移、细胞生长、免疫保护、病毒的复制、炎症的产生等。

目前，对于糖蛋白的标记和成像方法主要是有机荧光小分子探针及纳米荧光材料等。【参见：a)j.r.ha,l.hao,g.venkateswaran,y.h.huang,e.garcia,s.persad,exp.cellres.2014,321,153–166；b)n.khidekel,s.b.ficarro,e.c.peters,l.c.hsiehwilson,proc.natl.acad.sci.usa2004,101,13132–13137；c)w.morelle,j.c.michalski,nat.protoc.2007,2,1585–1602.】此类方法的主要缺点是破坏了糖蛋白的结构。近些年，以diels-alder反应为主的生物正交反应荧光探针在分子识别和医学诊断等领域受到广泛的关注，因为凭借该反应具有操作简单、反应物易于合成、特异性高等优点。【a)o.t.keppler,r.horstkorte,m.pawlita,c.schmidt,w.reutter,glycobiology2001,11,11r–18r；b)d.h.dube,c.r.bertozzi,curr.opin.chem.biol.2003,7,616–625；c)t.-l.hsu,s.r.hanson,k.kishikawa,s.k.wang,m.sawa,c.h.wong,proc.natl.acad.sci.u.s.a.2007,104,2614–2619；d)j.du,m.a.meledeo,z.wang,h.s.khanna,v.d.paruchuri,k.j.yarema,glycobiology2009,19,1382–1401；e)s.stairs,a.a.neves,h.y.a.wainman,h.ireland-zecchini,k.m.brindle,f.j.leeper,chembiochem2013,14,1063–1067.】但此类探针主要缺点是：1)铜离子的毒性较大；2)荧光背景大，特别是生物细胞和组织的自发荧光，不利于大规模推广。因此，开发具有低毒、时间分辨特性的荧光探针在实际应用中仍然具有重要的意义。

技术实现要素：

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针。该稀土探针以快速准确、灵敏无毒的实现对肿瘤细胞的细胞膜成像。

本发明的另一目的在于提供上述生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针的制备方法。其制备是以7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸为原料，通过偶联等过程得到含有四嗪官能团的中间体，此中间体进一步与二乙基三胺五乙酸、六水氯化铽进行螯合获得生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针。

本发明的再一目的在于提供上述生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针，其结构式如式ⅰ所示：

其中，式ⅰ中x为一类连接基团，包括酰胺键、酯基等，且连接基团之间的间距需小于等于10nm，以保证荧光共振能量转移的有效发生；现以x＝x1或x2为例；

上述生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针的制备方法，包括如下步骤：

(1)ix1中间体的制备：对7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸进行羧基活化，活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸与4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺在n,n-二甲基甲酰胺中室温搅拌，除去溶剂并用硅胶色谱分离得含有四嗪官能团的红色固体；

(2)ix2中间体的制备：对7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸进行羧基活化，活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸与乙二胺反应的产物和4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺与丁二酸酐反应的产物在n,n-二甲基甲酰胺中室温搅拌，除去溶剂，硅胶色谱分离得到含有四嗪官能团的红色固体；

(3)ix1或ix2制备：将步骤(1)或(2)得到的含有四嗪官能团的红色固体与二乙基三胺五乙酸在二甲基亚砜中搅拌，用乙醚沉淀干燥，再在二甲基亚砜/水(体积比，1:1)中与六水氯化铽搅拌反应，乙醚沉淀干燥得稀土探针ix1或稀土探针ix2，即生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针。

步骤(1)、(2)中所述的对7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸进行羧基活化的活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺；

所述的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基丁二酰亚胺、7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸的摩尔比为5～10：5～10：1；优选为5：5：1；

优选的，步骤(1)中所述的活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸与4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺的摩尔比为2：2～5；进一步为1：1；

优选的，步骤(2)中所述的活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸与乙二胺反应的产物和4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺与丁二酸酐反应的产物的摩尔比为1：1～5；进一步为1：1；

优选的，步骤(2)中所述的活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸与乙二胺的摩尔比为1：1～4；进一步为1：1；

优选的，步骤(2)中所述的4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺与丁二酸酐的摩尔比为1：1～5；进一步为1：1；

优选的，步骤(3)中所述的含有四嗪官能团的红色固体、二乙基三胺五乙酸、六水氯化铽的摩尔比为1：1～2：1～2；进一步为1：1：1；

优选的，步骤(1)、(2)、(3)中所述的搅拌的时间均为6～48小时；进一步为12小时。

上述生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针在细胞膜成像中的应用。

优选的，所述的生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针在肿瘤细胞的细胞膜成像或斑马鱼成像中的应用。

进一步优选的，所述的肿瘤细胞为肺癌细胞。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供的生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针，具体为式ⅰ所示的结构式，可用于肿瘤细胞的细胞膜成像。此稀土探针内含有四嗪基团，与tb³⁺的特征荧光发生共振能量转移，致使荧光微弱；但稀土探针与d-甘露糖环辛烯发生生物正交反应，进而探针内的荧光共振能量转移不能够发生，致使稀土离子tb³⁺的特征荧光释放出来，同时探针溶液伴有从粉红色到无色的裸眼可见颜色变化；另外，该稀土探针具有良好的水溶性，将在解决对肿瘤细胞、斑马鱼等成像过程中所引起的自发荧光问题具有重要意义。

附图说明

图1是实施例1、2、3中生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针的制备合成路线。

图2是实施例4中生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针的光谱分析；其中，a)为ix1、ix1与tco反应前后的紫外吸收图；c)为ix2、ix2与tco反应前后的紫外吸收图；b)为ix1、ix1与tco反应前后的荧光光谱图，⁵d4-⁷f6、⁵d4-⁷f5、⁵d4-⁷f4、⁵d4-⁷f3等表示稀土离子tb³⁺的特征能级跃迁，分别对应波长为490nm、545nm、585nm、622nm的发射峰；d)为ix2、ix2与tco反应前后的荧光光谱图。

图3是实施例5中生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针反应前后的荧光寿命的变化。

图4是实施例1中所述稀土探针ix1的中间体s1核磁共振氢谱图。

图5是实施例2中所述稀土探针ix1的中间体s2的电感耦合等离子体质谱(icp-ms)图。

图6是实施例2中所述稀土探针ix1的电感耦合等离子体质谱图。

图7是实施例3中所述稀土探针ix2的中间体s3的电感耦合等离子体质谱图。

图8是实施例3中所述稀土探针ix2的中间体s4的电感耦合等离子体质谱图。

图9是实施例3中所述稀土探针ix2的电感耦合等离子体质谱图。

图10是实施例6中所述生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针ix1对肿瘤细胞的细胞膜成像，左和右图分别为孵育含有tco甘露糖(ac4manntco)和不含tco的甘露糖(ac4mannh2)的细胞中细胞激光共聚焦成像图。

图11是实施例7中所述生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针ix1对斑马鱼进行成像，上和下图分别为孵育含有tco甘露糖(ac4manntco)和不含tco的甘露糖(ac4mannh2)的斑马鱼激光共聚焦成像图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂商所建议的实验条件。

实施例中的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸需参考文献：bioconjugatechem.2004,15,1088-1094；bioconjugatechem.2011,22,1402-1409；4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺(cas号：1345955-28-3)参考文献：angew.chem.int.ed.2009,48,7013-7016；bioconjugatechem.2011,22,2263-2270。

实施例1：

(1)本发明所提供的生物正交激活的时间分辨响应型稀土探针其合成步骤分别如图1所示，具体如下：ix1中间体s1的制备：将7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸(43.6mg，0.2mmol)与n-羟基丁二酰亚胺nhs(115.0mg，1.0mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc·hcl(190.8mg，1.0mmol)溶于10mln,n-二甲基甲酰胺并在室温下搅拌过夜进行羧基活化，结束后用饱和食盐水沉淀，离心干燥得黄褐色固体(即活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸)；继续将黄褐色固体与4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺(40.2mg，0.2mmol)在n,n-二甲基甲酰胺中室温搅拌过夜，除去溶剂，硅胶色谱分离得红色固体s1(66.8mg)，产率83.3％。

表征数据(图4)：¹hnmr(500m,d6-dmso):δ＝2.99(s,2h),3.16(d,j＝5hz,1h),4.40(d,j＝5.0hz,2h),5.74(d,j＝15.0hz,2h),6.05(s,1h),6.38(s,1h),6.44(d,j＝10.0hz,1h),7.42(d,j＝10.0hz,1h),7.49(d,j＝10.0hz,2h),8.38(d,j＝15.0hz,2h),8.74(t,j＝5.0hz,1h),11.23(s,1h)。

红色固体s1的结构式如下所示：

实施例2：

(1)ix1中间体s2的制备：在室温下，去取实施例1得到的红色固体s1(20.5mg，0.05mmol)、二乙基三胺五乙酸dtpa(19.7mg，0.05mmol)溶于3ml二甲基亚砜中，搅拌过夜反应，然后用乙醚沉淀干燥得固体s2(34.3mg)，产率88.4％。

表征数据：icp-ms(图5)：calcd.for[m⁺]776.76,found:713.40.

(2)ix1的制备：在室温下，去取步骤(1)得到的固体s2(7.8mg，0.01mmol)、六水氯化铽tbcl3·6h2o(3.8mg，0.01mmol)溶于1ml二甲基亚砜/水(体积比，1:1)中，搅拌过夜反应，然后用乙醚沉淀干燥得稀土探针ix1(8.41mg)，产率90.1％。

表征数据：icp-ms(图6)：calcd.for[m⁺]931.66,found:931.20.

实施例3：

(1)ix2中间体s3、s4的制备：取实施例1中活化的7-氨基-2-酮基-4-喹啉酸(33.2mg，0.1mmol)溶于含有乙二胺(6mg，0.1mmol)的10mln,n-二甲基甲酰胺中，在室温下搅拌过夜，用tcl监测反应完成后，将4-(6-甲基-1,2,4,5-四嗪-3-基)苄胺(30.1mg，0.1mmol)与丁二酸酐(10.0mg，0.1mmol)反应的产物在n,n-二甲基甲酰胺中室温搅拌过夜，除去溶剂，硅胶色谱分离得红色固体s3。在室温下，再将红色固体s3、二乙基三胺五乙酸(39.5mg，0.1mmol)溶于4ml二甲基亚砜中，搅拌过夜反应，然后用乙醚沉淀干燥得其固体s4(68.3mg)，产率74.4％。

s3表征数据：icp-ms(图7)：calcd.for[m⁺]526.59,found:525.10.

红色固体s3的结构式如下所示：

s4表征数据：icp-ms(图8)：calcd.for[m⁺]918.92,found:917.30.

(2)ix2的制备：在室温下，去取步骤(1)得到的固体s4(9.2mg，0.01mmol)、六水氯化铽(3.8mg，0.01mmol)溶于1ml二甲基亚砜/水(体积比，1:1)中，搅拌过夜反应，然后用乙醚沉淀干燥得稀土探针ix2(9.33mg)，产率86.8％。

ix2表征数据：icp-ms(图9)：calcd.for[m⁺]1073.8,found:1073.20.

实施例4：

对实施例2、3得到的稀土探针在水与甲醇混合介质中与环辛烯(tco)反应的紫外吸收和荧光强度、荧光寿命变化分析：配置浓度为10.0μmol/l的稀土探针，再分别加入20.0μmol/l环辛烯于其中振荡反应1分钟，在测试记录该稀土探针的吸收光谱(图2a与2c)和荧光光谱(图2b与2d)的变化。通过分析吸收光谱和荧光光谱强度的变化，说明两种稀土探针具有荧光响应。同时，通过分析荧光光谱强度的变化，建议孵育细胞的探针浓度为50μmol/l。

实施例5：

对实施例2、3得到的稀土探针ix1、ix2与环辛烯反应前后荧光寿命的测试：首先，分别用时间分辨荧光分析仪测试10μmol/l的稀土探针ix1、ix2的荧光寿命，再加入20μmol/l的环辛烯，振荡反应1分钟，然后测其各自反应后的荧光寿命，其结果见图3。通过分析可知两种探针在反应后的荧光寿命都大大延长，具有实现时间分辨成像的潜能。

实施例6：

对实施例2得到的稀土探针ix1对肿瘤细胞a549(市售细胞)的细胞膜进行成像分析：首先，将50μmol/l的d-甘露糖环辛烯(ac4manntco)和50μmol/l的d-甘露糖(ac4mannh2)分别加入到细胞培养基dmem中，37℃下孵育48小时，吸出培养液，并用pbs缓冲溶液冲洗三次，再加入新的dmem培养液，两份均加入50μmol/l的稀土探针ix1，37℃下孵育8小时后，分别进行激光共聚焦显微成像，如图10，从图中可以看出，该稀土探针可以对细胞膜进行成像，获得良好的细胞成像图。图10左边为d-甘露糖环辛烯孵育的细胞双光子激光共聚焦成像图，右边为d-甘露糖孵育的细胞激光共聚焦成像图。

实施例7：

对实施例2得到的稀土探针ix1对斑马鱼进行成像分析：首先，将5mmol/l的d-甘露糖环辛烯和5mmol/l的d-甘露糖分别通过卵内注射到斑马鱼受精卵内，37℃下孵育48小时，吸出培养液，再加入新的斑马鱼培养液(氯化钠，150mmol/l；氯化钾，0.5mmol/l；氯化钙，1.0mmol/l；磷酸二氢钾，0.37mmol/l；磷酸一氢钾，0.05mmol/l；硫酸镁，2.0mmol/l；碳酸氢钾，0.71mmol/l的去离子水溶液，ph为7.4)，两份均加入50μmol/l的稀土探针ix1，37℃下孵育8小时后，分别进行双光子激光共聚焦显微成像，如图11，从图中可以看出，该稀土探针可以对斑马鱼进行成像，获得良好的成像图。图11上排图为d-甘露糖环辛烯孵育的斑马鱼激光共聚焦成像图，图11下排图为d-甘露糖孵育的斑马鱼激光共聚焦成像图。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。