一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法与流程

技术特征：

1.一种将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，包括以下步骤：

1)将cas9核酸酶表达载体转化至酿酒酵母中表达；

2)选择酿酒酵母多拷贝rdna重复单元nts2非转录区中的一个或多个靶序列，将所选择靶序列中切割位点两侧的同源臂引物设计至目的基因表达盒的pcr扩增引物的前端，合成同源臂加载引物，扩增一个或多个目的基因表达盒，纯化扩增产物作为供体dna片段；所述靶序列中切割位点两侧的同源臂引物的序列长度为15-90bp，所述酿酒酵母多拷贝rdna重复单元nts2非转录区的核苷酸序列如seqidno.1所示；

3)选择靶序列对应的转录grna的载体，与步骤2)中的供体dna片段共转化至步骤1)中表达cas9核酸酶的酿酒酵母中，筛选转化子；

4)去除筛选出的转化子中在步骤1)和步骤2)导入的载体。

2.根据权利要求1所述将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，其特征在于，步骤2)中的靶序列为所述酿酒酵母的多拷贝rdna重复单元nts2非转录区中第239-258bp、第365-384bp、第1019-1038bp和/或第1126-1145bp，依次编号为s1、s2、s3和s4。

3.根据权利要求1所述将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，其特征在于，步骤3)所述转录grna的载体为grna-rdna-s1、grna-rdna-s2、grna-rdna-s3或grna-rdna-s4，所包含的向导序列依次与所述酿酒酵母的多拷贝rdna重复单元nts2非转录区中的第239-258bp、第365-384bp、第1019-1038bp、第1126-1145bp相同。

4.根据权利要求1所述将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，其特征在于，步骤3)所述转录grna的载体为grna-rdna-d5，其所包含的向导序列为靶序列中的任意两个；所述转录grna的载体为grna-rdna-t6，其所包含的向导序列为靶序列中的任意三个。

5.根据权利要求1所述将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，其特征在于，步骤3)所述转录grna的载体为grna-rdna-q7，其所包含的向导序列为所述酿酒酵母的多拷贝rdna重复单元nts2非转录区中第239-258bp、第365-384bp、第1019-1038bp和第1126-1145bp。

6.根据权利要求1所述将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，其特征在于，步骤2)中所述所述同源臂引物的序列长度为45bp。

7.根据权利要求3所述将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，其特征在于，步骤3)所述转录grna的载体grna-rdna-s1的向导序列对应的同源臂引物序列如seqidno.2和seqidno.3所示。

8.根据权利要求3所述将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，其特征在于，步骤3)所述转录grna的载体grna-rdna-s2的向导序列对应的同源臂引物序列如seqidno.4和seqidno.5所示。

9.根据权利要求3所述将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，其特征在于，步骤3)所述转录grna的载体grna-rdna-s3的向导序列对应的同源臂引物序列如seqidno.6和seqidno.7所示。

10.根据权利要求3所述将目的基因多拷贝整合至酿酒酵母基因组的方法，其特征在于，步骤3)所述转录grna的载体grna-rdna-s4的向导序列对应的同源臂引物序列如seqidno.8和seqidno.9所示。