氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测引物组、试剂盒及检测方法与流程

本发明属于基因检测
技术领域：
，具体涉及一种氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测引物组、试剂盒及检测方法。
背景技术：
：氯吡格雷是目前治疗急性冠状动脉综合征的一种经典抗血小板药物，能降低冠心病患者尤其是支架术后患者的主要不良心血管事件的发生率。但是部分患者存在氯吡格雷抵抗，研究认为其受多种因素影响，基因多态性是最重要的内部因素。氯吡格雷是一种新型的噻吩吡啶类衍生物，是本身无活性的药物前体，在肠道被吸收(这一过程受到ABCB1基因编码的质子泵P糖蛋白调控)后，15％经过肝脏细胞色素P450氧化酶(CYP450酶)系统(CYP2C19、CYP3A4、CYP3A5等)的调节，氧化成2-氧基-氯吡格雷，然后再经水解形成一种硫醇衍生物样的活性代谢产物，选择性不可逆地抑制二磷酸腺苷受体(P2Y12)，间接抑制GPⅡb/Ⅲa受体与纤维蛋白原结合导致血小板不能进一步相互聚集，大多数经酯酶水解成无活性的羧酸衍生物。75mg/d维持剂量抑制血小板聚集率作用可在3～7d达到稳态，300mg负荷剂量达到最大效应至少需要24h，600mg负荷剂量4h即可。根据氯吡格雷的药物代谢动力学，在氯吡格雷50～150mg范围，主要代谢物药代动力学为线性增长，即血药浓度与剂量成正比。氯吡格雷的代谢受CYP2C19基因多态性影响显著。氯吡格雷为前体型药物，需经体内代谢酶转化为活性形式后，方可发挥抑制血小板的作用。其中CYP2C19酶在氯吡格雷的活化过程中起着重要作用，影响其抗血小板的作用及临床治疗效果。如图1所示，已知对临床药物代谢影响较大的CYP2C19基因突变位点有CYP2C19*2、*3、*4、*5、*7、*8、*17等，其中前6个位点突变都降低CYP2C19酶的活性，而*17位点的突变则使CYP2C19酶活性明显增加。关于基因突变检测方法有很多，各国学者对此都进行了大量研究。己经报道的方法包括直接测序法、DHPLC、PCR-SSCP/RFLP、ScorpionsARMS、TaqManPCR、ME-PCR等。这些方法各有优缺点，其中在临床和科研中较为常用的方法为直接测序法以及ARMS(Amplificationrefractorymutationsystem,扩增阻滞突变系统)法。直接测序法检测能力有限，其检测灵敏度约20％左右，而且步骤复杂，整个检测过程涉及PCR-电泳-测序-测序结果的解读等一系列的步骤，费时费力，但是该方法的优点是能够发现一些新的未知突变。ARMS方法是将分子信标(探针)与特异性的ARMS引物相结合创造出来的，ARMS引物3’端设计在突变位点，最后一个碱基与突变碱基配对，釆用无3’→5’外切酶活性的TaqDNA聚合酶，特异性的识别引物的3’末端，只有引物3’末端完全配对时，才能正常扩增，当引物3’末端发生错配时，不能有效的扩增。当引物与突变模板结合并延伸出相应的产物后，探针两端的荧光基团和淬灭基团分离而产生荧光。目前，市场上相关试剂盒包括QIAGEN公司和厦门艾德公司，价格昂贵。技术实现要素：本发明针对以上问题的提出，而研究设计一种氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测引物组、试剂盒及检测方法。本发明采用的技术手段如下：一种氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测引物组，包括以下碱基序列的引物：检测引物一：5'-ACTATCATTGATTATTTCCTG-3'；检测引物二：5'-CTATCATTGATTATTTCCGA-3'；检测引物三：5'-CGCAAGCAGTCACATAACT-3'；检测引物四：5'-AGGATTGTAAGCACCCCCTAG-3'；检测引物五：5'-GATTGTAAGCACCCCCTTA-3'；检测引物六：5'-GCTTAGAAGCCTGATCTA-3'；检测引物七：5'-TGTGTCTTCTGTTCTCAAATC-3'；检测引物八：5'-GTGTCTTCTGTTCTCAAACA-3'；检测引物九：5'-GATATAAACACCTTTACCA-3'；内控引物一：5'-AGCAAGCAGGAGTATGACG-3'；以及内控引物二：5'-GAAAGGGTGTAACGCAACT-3'。一种氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测试剂盒，包括分别装于容器中的检测引物一、检测引物二、检测引物三、检测引物四、检测引物五、检测引物六、检测引物七、检测引物八、检测引物九、内控引物一和内控引物二。进一步地，所述检测试剂盒中还包括分别装于容器中的PCR反应预混液、阳性质控品一、阳性质控品二和阳性质控品三，所述PCR反应预混液包括3'→5'外切酶活性高保真Taq酶，1.0-5.0mM的MgCl2，1.0-5.0mM的dNTPs以及SYBRGreenI，所述阳性质控品一带有CYP2C19基因rs4244285位点的突变型质粒和野生型质粒，所述阳性质控品二带有CYP2C19基因rs4986893位点的突变型质粒和野生型质粒，所述阳性质控品三带有CYP2C19基因rs12248560位点的突变型质粒和野生型质粒，所述阴性质控品为Tris-HCL缓冲液，所述的Tris-HCL缓冲液的浓度为7-13mM，pH为7.5-8.5。一种氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测方法，使用本发明所述的检测引物一和检测引物三对CYP2C19基因rs4244285位点的野生基因进行检测，使用本发明所述的检测引物二和检测引物三对CYP2C19基因rs4244285位点的突变基因进行检测，使用本发明所述的检测引物四和检测引物六对CYP2C19基因rs4986893位点的野生基因进行检测，使用本发明所述的检测引物五和检测引物六对CYP2C19基因rs4986893位点的突变基因进行检测，使用本发明所述的检测引物七和检测引物九对CYP2C19基因rs12248560位点的野生基因进行检测，使用本发明所述的检测引物八和检测引物九对CYP2C19基因rs12248560位点的突变基因进行检测。进一步地，所述的氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测方法包括以下步骤：a.将PCR反应预混液、检测引物一、检测引物三和水混合均匀，得到反应混合液一；将PCR反应预混液、检测引物二、检测引物三和水混合均匀，得到反应混合液二；将PCR反应预混液、检测引物四、检测引物六和水混合均匀，得到反应混合液三；将PCR反应预混液、检测引物五、检测引物六和水混合均匀，得到反应混合液四；将PCR反应预混液、检测引物七、检测引物九和水混合均匀，得到反应混合液五；将PCR反应预混液、检测引物八、检测引物九和水混合均匀，得到反应混合液六；将PCR反应预混液、内控引物一、内控引物二与水混合均匀，得到反应混合液七；b.对CYP2C19基因rs4244285位点进行检测时，将待测样本DNA分别加入到反应混合液一和反应混合液二中，组成反应体系一和反应体系二，进行PCR扩增反应；对CYP2C19基因rs4986893位点进行检测时，将待测样本DNA分别加入到反应混合液三和反应混合液四，组成反应体系三和反应体系四，进行PCR扩增反应；对CYP2C19基因rs12248560位点进行检测时，将待测样本DNA分别加入到反应混合液五和反应混合液六，组成反应体系五和反应体系六，进行PCR扩增反应；将待测样本DNA加入到反应体系七，组成反应体系七，进行PCR扩增反应；c.分别检测几种反应体系的荧光强度，判定检测结果。进一步地，待测样本的数量为n，则使用的反应混合液七的数量为n+1，n份反应混合液七中分别加入待测样本DNA，其余一份备用；对CYP2C19基因rs4244285位点进行检测时，使用的反应混合液一和反应混合液二的数量均为n+2+1，其中，n份反应混合液一和反应混合液二中分别加入待测样本DNA，两份中分别加入阳性质控品一和阴性质控品，其余一份备用；对CYP2C19基因rs4986893位点进行检测时，使用的反应混合液三和反应混合液四的数量均为n+2+1，其中，n份反应混合液三和反应混合液四中分别加入待测样本DNA，两份中分别加入阳性质控品二和阴性质控品，其余一份备用；对CYP2C19基因rs12248560位点进行检测时，使用的反应混合液五和反应混合液六的数量均为n+2+1，其中n份反应混合液五和反应混合液六中分别加入待测样本DNA，两份中分别加入阳性质控品三和阴性质控品，其余一份备用。进一步地，步骤c中，以SYBR信号达到设定的阈值所需的的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。与现有技术比较，本发明所述的氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测引物组、试剂盒及检测方法采用SYBR染料法，建立了针对人类相关基因CYP2C19基因多态性的多重实时PCR检测方法，能够用于快速、灵敏、有效的检测CYP2C19基因多态性，本发明的检测试剂盒及检测方法灵敏度高、特异性强、方法简单、结果准确。附图说明图1是CYP2C19基因检测结果与处理方式示意图。图2是本发明实施例检测CYP2C19(681)样品的扩增曲线图。图2中，曲线根据出峰顺序从左到右依次对应测定阳性质控品一野生型的检测结果、阳性质控品一突变型的检测结果、内控基因、野生型样品和突变型样品。图3是本发明实施例检测CYP2C19(636)样品的扩增曲线图。图3中，曲线根据出峰顺序从左到右依次对应测定阳性质控品二突变型的检测结果、野生型样品、突变型样品、阳性质控品二野生型的检测结果和内控基因。图4是本发明实施例检测CYP2C19(4195)样品的扩增曲线图。图4中，曲线根据出峰顺序从左到右依次对应测定阳性质控品三的突变型的检测结果、阳性质控品三的野生型的检测结果、内控基因、突变型样品和野生型样品。具体实施方式CYP2C19基因多态性形式如下表所示：表1基因多态性形式G618A突变为CYP2C19基因的*2突变位点，具体为cDNA的618位G突变成A；G636A突变为CYP2C19基因的*3突变位点，具体为cDNA的636位G突变成A；C4195A突变为CYP2C19基因的*17突变位点，具体为gDNA的4195位C突变成A。实施例一一种氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测引物组，包括以下碱基序列的引物：表2CYP2C19(681)基因多态性的检测引物表3CYP2C19(636)基因多态性的检测引物表4CYP2C19(4195)基因多态性的检测引物表5内控的检测引物检测引物一、检测引物二和检测引物三用于检测rs4244285位点的G681A突变；检测引物四、检测引物五和检测引物六用于检测rs4986893位点的G636A突变；检测引物物七、检测引物八和检测引物九用于检测rs12248560位点的C4195A突变。实施例二一种氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测试剂盒，包括分别装于容器中的检测引物一、检测引物二、检测引物三、检测引物四、检测引物五、检测引物六、检测引物七、检测引物八、检测引物九、内控引物一和内控引物二，还包括分别装于容器中的PCR反应预混液、阳性质控品一、阳性质控品二、阳性质控品三和阴性质控品，所述PCR反应预混液包括3'→5'外切酶活性高保真Taq酶，1.0-5.0mM的MgCl2，1.0-5.0mM的dNTPs以及SYBRGreenI，所述阳性质控品一为带有G681A位点的野生型质粒和突变型质粒，所述阳性质控品二为带有G636A位点的野生型质粒和突变型质粒，所述阳性质控品三为带有C4195A位点的野生型质粒和突变型质粒，所述阴性质控品为Tris-HCL缓冲液，所述的Tris-HCL缓冲液的浓度为7-13mM，pH为7.5-8.5。实施例三一种氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测方法，使用本发明所述的检测引物一和检测引物三对CYP2C19基因rs4244285位点的野生基因进行检测，使用本发明所述的检测引物二和检测引物三对CYP2C19基因rs4244285位点的突变基因进行检测，使用本发明所述的检测引物四和检测引物六对CYP2C19基因rs4986893位点的野生基因进行检测，使用本发明所述的检测引物五和检测引物六对CYP2C19基因rs4986893位点的突变基因进行检测，使用本发明所述的检测引物七和检测引物九对CYP2C19基因rs12248560位点的野生基因进行检测，使用本发明所述的检测引物八和检测引物九对CYP2C19基因rs12248560位点的突变基因进行检测。所述的氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测方法包括以下步骤：a.将PCR反应预混液、检测引物一、检测引物三和水混合均匀，得到反应混合液一；将PCR反应预混液、检测引物二、检测引物三和水混合均匀，得到反应混合液二；将PCR反应预混液、检测引物四、检测引物六和水混合均匀，得到反应混合液三；将PCR反应预混液、检测引物五、检测引物六和水混合均匀，得到反应混合液四；将PCR反应预混液、检测引物七、检测引物九和水混合均匀，得到反应混合液五；将PCR反应预混液、检测引物八、检测引物九和水混合均匀，得到反应混合液六；将PCR反应预混液、内控引物一、内控引物二与水混合均匀，得到反应混合液七；b.对CYP2C19基因rs4244285位点进行检测时，将待测样本DNA分别加入到反应混合液一和反应混合液二中，组成反应体系一和反应体系二，进行PCR扩增反应；对CYP2C19基因rs4986893位点进行检测时，将待测样本DNA分别加入到反应混合液三和反应混合液四，组成反应体系三和反应体系四，进行PCR扩增反应；对CYP2C19基因rs12248560位点进行检测时，将待测样本DNA分别加入到反应混合液五和反应混合液六，组成反应体系五和反应体系六，进行PCR扩增反应；将待测样本DNA加入到反应体系七，组成反应体系七，进行PCR扩增反应；c.分别检测几种反应体系的荧光强度，判定检测结果。待测样本的数量为n，则使用的反应混合液七的数量为n+1，n份反应混合液七中分别加入n份待测样本DNA，其余一份备用；对CYP2C19基因rs4244285位点进行检测时，使用的反应混合液一和反应混合液二的数量均为n+2+1，其中，n份反应混合液一中分别加入n份待测样本DNA，n份反应混合液二中分别加入n份待测样本DNA，两份反应混合液一中分别加入阳性质控品一和阴性质控品，其余一份备用，两份反应混合液二中分别加入阳性质控品一和阴性质控品，其余一份备用；对CYP2C19基因rs4986893位点进行检测时，使用的反应混合液三和反应混合液四的数量均为n+2+1，其中，n份反应混合液三中分别加入n份待测样本DNA，n份反应混合液四中分别加入n份待测样本DNA，两份反应混合液三中分别加入阳性质控品二和阴性质控品，其余一份备用，两份反应混合液四中分别加入阳性质控品二和阴性质控品，其余一份备用；对CYP2C19基因rs12248560位点进行检测时，使用的反应混合液五和反应混合液六的数量均为n+2+1，其中n份反应混合液五中分别加入n份待测样本DNA，两份反应混合液五中分别加入阳性质控品三和阴性质控品，其余一份备用，n份反应混合液六中分别加入n份待测样本DNA，两份反应混合液六中分别加入阳性质控品三和阴性质控品，其余一份备用。1.样本处理和核酸提取待测样本包括手术切除的新鲜病理组织，甲醛固定石蜡包埋的病理组织，石蜡切片，全血，血浆，血清，胸腔积液，口腔黏膜脱落细胞等。利用商品化的DNA提取试剂盒处理样本，具体操作参见试剂盒说明书，所提DNA需用紫外分光光度计测定浓度和纯度，其DNAOD260/OD280的值应在1.8～2.0，浓度应在5～50ng/μL之间，样本DNA质量不合格者不得用于检测，建议低于5ng/μL者重新取切片进行核酸提取，高于50ng/μL者予以适当稀释至规定的浓度范围，提取完的DNA建议立即进行检测，否则请于-20℃以下保存，保存时间不要超过6个月。试剂盒质控品使用前室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。2.试剂配置2.1配置说明：检测反应设置内控检测、阴性质控品检测和阳性质控品检测。2.2配置过程提前30分钟将试剂取出，室温融化，涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒待用。确定每个检测位点反应数N和内控检测数M，N＝待检样本数(n)+质控品数(2)+1；M＝待检样本数(n)+1。计算加到反应混合物中的各个试剂的量，计算如下表6：表6PCR反应体系配置表。试剂检测位点PCR反应液P引物混合液纯化水应混合液一(μL)CYP2C19(681)-G12.5*N2.0*N8.5*N应混合液二(μL)CYP2C19(681)-A12.5*N2.0*N8.5*N应混合液三(μL)CYP2C19(636)-G12.5*N2.0*N8.5*N应混合液四(μL)CYP2C19(636)-A12.5*N2.0*N8.5*N应混合液五(μL)CYP2C19(4195)-C12.5*N2.0*N8.5*N应混合液六(μL)CYP2C19(4195)-A12.5*N2.0*N8.5*N应混合液七(μL)内控12.5*M2.0*M8.5*M取7个灭菌离心管配置上述7个反应体系，试剂全部加入后涡旋振荡10秒，2000rpm离心15秒。然后将上述混合液23μL/管分装至PCR反应管中(无菌和RNase-Free)。3.加样表7样品及质控品上样表。名称成分加样量待检样本样本DNA2μLSTD1阳性质控品一(681)2μLSTD2阳性质控品二(636)2μLSTD3阳性质控品三(4195)2μLNTC1阴性质控品2μL注：STD代表阳性质控品；NTC代表阴性质控品。根据上表提示的上样比例，将已处理样本、阳性质控品和阴性质控品加入反应管中，内控引物只需检测样本DNA即可，盖紧管盖(避免气泡产生)，2000rpm离心15秒将管壁上的液体全部甩至管底，然后立即进行PCR扩增反应。阳性质控品一包含CYP2C19基因的rs4244285位点野生质粒和G618A突变质粒，构件方法为：利用PCR技术，获得CYP2C19基因rs4244285位点的野生片段和G618A突变片段，片段长度为200-300bp，将所述的野生片段和G618A突变片段与pEASY-BluntCloningKit载体(全世金CB101)连接后，通过常用的转化技术，分别转入大肠杆菌感受态细胞Trans5αChemicallyCompetentCell(全世金CD201-01)培养，分别利用天根生化科技有限公司质粒提取试剂盒(天根，DP105)提取质粒，质粒浓度为(50-100ng/ul)，获得野生质粒和G618A突变质粒。阳性质控品二包含CYP2C19基因的rs4986893位点野生质粒和G636A突变质粒，阳性质控品三包含CYP2C19基因的rs12248560位点野生质粒和C4195A突变质粒，阳性质控品二和阳性质控品三中所包含质粒的构件过程与阳性质控品一相同。4.PCR扩增程序设置表8PCR反应程序的设定5.检验结果的解读如图2至图4所示，利用ARMS引物区分野生型和突变型基因序列，通过SYBRGreen染料和扩增产物的杂交，检测反应体系的SYBR荧光强度来判定检测结果。SYBR为检测信号，以SYBR信号达到设定的阈值所需的循环次数Ct值作为判断标准，Ct值小于32为阳性，Ct值大于35为阴性，Ct值介于32到35之间为弱阳性。本实施例可在50ng野生型基因组DNA背景下准确检出1％的突变DNA，且针对性设计不同突变位点的特异性引物，使用荧光定量PCR进行检测，检测过程均为闭管反应，大大降低污染。本实施例涉及的检测人类(CYP2C19)基因多态性的荧光定量PCR方法不包括对待测样本的处理和模板提取的步骤，但对于来自甲醛固定石蜡包埋的样品与来自血浆的样品及口腔黏膜脱落细胞所获得的片段DNA依然具有与新鲜组织样本DNA相同的扩增和检测能力。以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。序列表<110>大连美纳医学检验实验室有限公司<120>氯吡格雷药物相关基因CYP2C19基因多态性检测引物组、试剂盒及检测方法<130>2019.5.31<160>11<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>CYP2C19基因的rs4244285位点G型基因的正向扩增引物<400>1actatcattgattatttcctg21<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>CYP2C19基因的rs4244285位点A型基因的正向扩增引物<400>2ctatcattgattatttccga20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>CYP2C19基因的rs4244285位点G型基因的反向扩增引物；CYP2C19基因的rs4244285位点A型基因的反向扩增引物<400>3cgcaagcagtcacataact19<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>CYP2C19基因的rs4986893位点G型基因的正向扩增引物<400>4aggattgtaagcaccccctag21<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>CYP2C19基因的rs4986893位点A型基因的正向扩增引物<400>5gattgtaagcaccccctta19<210>6<211>18<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>CYP2C19基因的rs4986893位点G型基因的反向扩增引物；CYP2C19基因的rs4986893位点A型基因的反向扩增引物<400>6gcttagaagcctgatcta18<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>CYP2C19基因的rs12248560位点C型基因的正向扩增引物<400>7tgtgtcttctgttctcaaatc21<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>CYP2C19基因的rs12248560位点A型基因的正向扩增引物<400>8gtgtcttctgttctcaaaca20<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>CYP2C19基因的rs12248560位点C型基因的反向扩增引物；CYP2C19基因的rs12248560位点A型基因的反向扩增引物<400>9gatataaacacctttacca19<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>内控基因的正向扩增引物<400>10agcaagcaggagtatgacg19<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列(ArtificialSequence)<220><223>内控基因的反向扩增引物<400>11gaaagggtgtaacgcaact19当前第1页1 2 3