醛酮还原酶BsAKR(YvgN)及其突变体和应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，涉及一种酮还原酶多种突变体及其用途，所述突变体是由野生型枯草芽孢杆菌醛酮还原酶(bacillussubtilisaldo-ketoreductase,bsakr(yvgn))出发经过突变得到的，具体涉及一种醛酮还原酶多种突变体和其制备方法。还涉及利用所述的醛酮还原酶bsakr(yvgn)及其突变体通过催化α-酮酸酯类化合物及1-苯基乙酮类化合物的还原，得到具有光学活性的s或r构型仲醇化合物的方法。
背景技术：
：手性醇的手性碳原子连有活泼的羟基官能团，使得手性醇成为精细化工、药物及农业应用的关键合成中间体。例如，手性醇(3r,5r)-6-氰基-3,5-二羟基己酸乙酯(ethyl(3r,5r)-6-cyano-3,5-dihydroxyhexanoate)是辉瑞公司研发的降血脂药阿托伐他汀钙(lipitortm)合成过程中的关键手性中间体。另外，含有其他活泼官能团的手性醇(如手性卤代醇)还可以被转化为其他具有更为广泛应用价值的手性模块，如手性环氧化合物、手性二醇、手性羟基腈类、手性羟基叠氮化合物与手性氨基醇等。α-酮酸酯类化合物做为重要的合成中间体在化工与医药领域也得到广泛的应用，并且该类醇的r-及s-型均有重要的应用价值。(r)-邻氯扁桃酸甲酯(分子式为o-cl-c6h4ch(oh)cooch3，分子量为200.62，cas号：32345-59-8)是合成血小板聚集抑制剂氯吡格雷的重要手性中间体。氯吡格雷是一种二磷酸腺苷(adp)受体阻滞剂，可与血小板膜表面adp受体结合，使纤维蛋白原无法与糖蛋白gpⅱb/ⅲa受体结合，从而抑制血小板凝集，主要用于治疗急性心肌梗死，在国内具有广泛市场。(r)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯[ethyl(r)-2-hydroxy-4-phenylbutyrate,(r)-hpbe]是制造各种血管紧张素转换酶(ace)抑制剂的重要前体，如贝那普利、依那普利和雷米普利，它们被广泛用于治疗高血压和充血性心力衰竭。ace抑制剂干扰血管紧张素i向血管紧张素ii的转化，有利于减轻心脏前负荷。同时ace抑制剂能够预防或逆转心血管重构，抑制心肌和血管的肥厚、增生。在国内抗高血压用药市场当中占据较大份额。此外，(r)-苯乙酰甲醇是(—)-麻黄碱的前体，(—)-麻黄碱是一种用于预防脊髓麻醉期间低血压的药物，同时也被对于治疗哮喘，嗜睡症。光学纯的1-苯基乙醇类化合物，尤其是α卤素取代的1-苯基乙醇类化合物是药物及其他精细化学品合成过程中的重要手性中间体。目前多种获取光学纯的手性纯的方法被开发出来，包括动力学拆分与不对称合成两大类。利用前手性羰基化合物不对称合成方法的理论收率可达100％，是获取光学纯的1-苯基乙醇类化合物的重要途径。科研人员已经通过手性金属配体作为催化剂，开发出合成光学纯的手性醇的化学合成方法，并部分应用于工业生产，然而，由于其条件苛刻且存在重金属残留问题，在药物等合成中的应用受到了限制。生物催化以其环境友好、反应条件温和、区域及立体选择性高等优势，在手性醇的合成中受到了越来越多的关注。醛酮还原酶(aldoketoreductases，akrs)是一类依赖于nad(p)+的氧化还原酶，包含了超过190个成员。其结构由(α/β)8桶状结构及loop区构成，活性中心由loop4、loop7及loopc组成，催化活性位点包括tyr、asp、lys以及his。醛酮还原酶的底物为前手性的酮，类型比较广泛，如α-酮酯、β-酮酯、脂肪链酮、环状酮等。为改善醛酮还原酶在不对称催化还原α-酮酸酯及1-苯基乙酮类化合物过程中的实用性，蛋白质理性设计及定向进化改变酶催化性质的方法被研究人员用来改造醛酮还原酶的立体选择性。在先前的文献中已经提出，通过对醛酮还原酶的loop区进行蛋白质修饰可以影响醛酮还原酶的底物谱(proteineng,dessel2014；27:245-248)。此外，zhang等对来自海栖热袍菌的热稳定醛酮还原酶进行半理性设计用于合成对映体纯的乙基-2-羟基-4-苯基丁酸，表明该akr的w21和w86在确定对映选择性中起重要作用(scirep2017；7:4007)。本实验室通过基因挖掘获取的来源于枯草芽孢杆菌的醛酮还原酶bsakr(yvgn)，野生状态下对α-酮酸酯及1-苯基乙酮类表现出较差的活性及立体选择性。通过理性设计及蛋白质定向进化提高及逆转该酶的立体选择性，实现光学纯的手性醇的生物催化制备，具有十分重要的应用价值。技术实现要素：为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种醛酮还原酶bsakr(yvgn)，还提供了通过对该醛酮还原酶进行突变得到的还原酶突变体，所述的醛酮还原酶bsakr(yvgn)和突变体可以提高其对α-酮酸酯类化合物或1-苯基乙酮类化合物的对映选择性及活性，使通过醛酮还原酶还原得到对应手性醇路线高效、可行。本发明提供了醛酮还原酶bsakr(yvgn)，通过测序确定为野生型枯草芽孢杆菌醛酮还原酶，其序列如seqidno.1所示。本发明还提供了由野生型枯草芽孢杆菌醛酮还原酶bsakr(yvgn)基因(seqidno.1)通过突变得到具有改良性质的醛酮还原酶的突变体，该酶在大肠杆菌工程菌中表达，该醛酮还原酶及其突变体，能够将α-酮酸酯类化合物还原得到具有光学活性的s或r构型仲醇。进一步地，将醛酮还原酶基因连接到表达质粒中，得重组醛酮还原酶。所述的表达质粒为：所述的重组醛酮还原酶包括与seqidno.02至少75％同一性的氨基酸序列。更进一步地，本发明提供了醛酮还原酶bsakr(yvgn)的突变体，所述的突变体是对重组醛酮还原酶(即seqidno.2)的25位或113位突变、或25位和113位同时突变获得。本发明所述的醛酮还原酶bsakr(yvgn)的突变体对应于seqidno.2的25位残基为较小的氨基酸残基，113位残基为较大氨基酸残基，这些氨基酸对于改善醛酮还原酶的活性及对映体选择性至关重要。本发明中涉及的较小的氨基酸为ala、ser、thr、val、ile与leu，优选为丝氨酸(ser)；涉及的较大氨基酸残基为pro、phe、try、leu，优选为苯丙氨酸(phe)。本发明的一些实施方案中，含有突变的醛酮还原酶突变体针对α-酮酸酯类化合物及1-苯基乙酮类化合物展现出更高的活性及立体选择性，这些突变体包含一个或两个突变，即25位或113位突变，或25位和113位同时突变，氨基酸序列25位突变为ser；氨基酸序列113位突变为phe。本发明所述的醛酮还原酶突变体，其氨基酸序列优选如seqidno.4，6，8所示。本发明的实施方式包括编码所述醛酮还原酶突变体的核酸，与编码本发明所述bsakr(yvgn)突变体的核酸序列具有至少75％的序列同一性。所述的能够编码突变体的核酸，序列如seqidno.3，5，7所示。本发明的相关实施方式还包括包含这些核酸的载体及包含该类载体的宿主细胞。本发明还提供了所述的醛酮还原酶及其突变体在还原α-酮酸酯类及1-苯基乙酮类化合物中的应用。本发明中所述的野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)与其突变体，或者是含有野生型或突变体酶的细胞可以作为催化剂催化不对称还原α-酮酸酯或1-苯基乙酮类化合物获取相应的光学纯手性产物。本发明中所述的野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)与其突变体，或者是含有野生型或突变体酶的细胞可以作为催化剂催化不对称还原α-酮酸酯类及1-苯基乙酮类化合物获取具有不同构型(s和r构型)的相应的光学纯手性产物。所述的α-酮酸酯类化合物如式i所示，1-苯基乙酮类化合物如式ii所示：其中，r1为c1-c4烷基，苯基或者带有取代基的苯基，苯基的取代基为卤素或者c1-c4烷基；r2为c1-c4烷基；r3为卤代c1-c4烷基。r4为卤素、卤代c1-c4烷基；较佳地，r1为苯基或者带有取代基的苯基，取代基为卤素；r2为c1-c2烷基；r3为卤代c1-c4烷基，所述的卤代烷基的卤素是f或cl。r4为氯、卤代c1-c4烷基；一些典型的结构如下所述：本发明的一个实施方式提供了不对称还原α-酮酸酯类及1-苯基乙酮类化合物的方法：在ph5-7的磷酸盐缓冲液溶液中，在葡萄糖脱氢酶，葡萄糖和nadp+存在下，在醛酮还原酶或其突变体的催化下，对α-酮酸酯类或1-苯基乙酮类化合物进行还原，生成光学活性手性仲醇。醛酮还原酶突变体用量为0.02-40g/l，葡萄糖脱氢酶用量为0.01-5g/l，葡萄糖用量为6-200g/l，nadp+用量为0.1-0.5mmol，α-酮酸酯类或1-苯基乙酮类化合物的浓度为3-100g/l，所述缓冲液为ph5-7的磷酸盐缓冲液，反应温度是30-40℃。该醛酮还原酶或其突变体可以多种可行的方式如细胞、粗酶粉、酶溶液、固定化酶等多种形式存在。本发明的有益技术效果：通过对枯草芽孢杆菌醛酮还原酶bsakr(yvgn)进行突变，所得到的醛酮还原酶突变体与天然存在的酮还原酶野生型相比，反转与提高了其对α-酮酸酯类及1-苯基乙酮类化合物的活性与对映选择性。附图说明图1为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)与其突变体酶的基因、含有上述基因的重组表达载体的构建。图2为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)(seqidno.2)与其突变体(seqidno.4，6，8)酶催化底物sub1还原的hplc检测结果；sub1：sub1底物对照；rac-1：产物消旋体对照图3为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)(seqidno.2)与其突变体(seqidno.4，6，8)酶催化底物sub2还原的hplc检测结果。图4为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)(seqidno.2)与其突变体(seqidno.4，6，8)酶催化底物sub3还原的hplc检测结果。图5为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)突变体(seqidno.4，8)酶催化底物sub4还原的hplc检测结果。图6为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)突变体(seqidno.4，8)酶催化底物sub5还原的hplc检测结果。图7为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)(seqidno.2)与其突变体(seqidno.4，6，8)酶催化底物sub6还原的hplc检测结果。图8为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)(seqidno.2)与其突变体(seqidno.4，6，8)酶催化底物sub7还原的hplc检测结果。图9为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)(seqidno.2)与其突变体(seqidno.4，6，8)酶催化底物sub8还原的hplc检测结果。图10为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)(seqidno.2)与其突变体(seqidno.4，6，8)酶催化底物sub9还原的hplc检测结果。图11为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)(seqidno.2)与其突变体(seqidno.4)酶催化底物sub10还原的hplc检测结果。图12为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)(seqidno.2)与其突变体(seqidno.4，6，8)酶催化底物sub11还原的hplc检测结果。图13为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)突变体(seqidno.4，6)酶催化底物sub12还原的hplc检测结果。图14为野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)(seqidno.2)与其突变体(seqidno.4，6，8)酶催化底物sub13还原的hplc检测结果。具体实施方式下面通过具体的实施方案，描述本发明的醛酮还原酶突变体，以及利用该酶还原α-酮酸酯类化合物及1-苯基乙酮类。除特别指明，本发明中所用的实验方案均为本领域技术人员所公知的方法。此外，实施例应理解为说明性的，而不是限制本发明。某些术语的定义。不对称还原是还原前手性化合物得到光学纯的相应的还原产物的一种方法，在本发明中指醛酮还原酶催化α-酮酸酯类化合物或1-苯基乙酮类化合物选择性地得到s或r构型的相应的醇。对映体过量定义为对映体混合物中一个异构体a比另一个异构体b多出来的量占总量的百分数，缩写为ee，公式为(a-b)/(a+b)*100％，对映体过量值用于表示一种手性化合物的光学纯度。ee值越高，光学纯度也越高。20种氨基酸缩写如下aspd天冬氨酸ilei异亮氨酸thrt苏氨酸leul亮氨酸sers丝氨酸thrt酪氨酸glue谷氨酸phef苯丙氨酸prop脯氨酸hish组氨酸glyg甘氨酸lysl赖氨酸alaa丙氨酸argr精氨酸cysc半胱氨酸trpw色氨酸valv缬氨酸glnq谷氨酰胺metm甲硫氨酸asnn天冬酰胺氨基酸分类，根据氨基酸侧链基团的空间位阻分为较大及较小的氨基酸，本发明中涉及的本发明中涉及的较小的氨基酸为ala、ser、thr、val、ile与leu，较大氨基酸残基为pro、phe、try、leu。实施例涉及的培养基配方。lb液体培养基：0.5％酵母提取物、1％蛋白质胨与1％氯化钠(如配置固体培养基，在灭菌前加入1.5％琼脂)，115℃高压灭菌30min。实施例1枯草芽孢杆菌基因组dna的提取a)枯草芽孢杆菌用lb液体培养过夜后，发酵液用1ml离心管3000r/min离心5min，弃上清收集菌体，可重复几次以得到足够量的细胞；b)按细菌基因组dna提取试剂盒操作说明提取蜡样芽孢杆菌基因组。实施例2野生型bsakr(yvgn)基因的克隆以实施例1获得的枯草芽孢杆菌基因组dna为模板进行pcr反应，反应体系如下：扩增程序：94℃：10min，(94℃：30s，45℃：30s，72℃：30s)30个循环，72℃，10min。引物1：bsakr(yvgn)-ecori-f：ccggaattcgatgccaacaagtttaaaa；引物2：bsakr(yvgn)-xhoi-r：ccgctcgagaaacagaagctcatcagg；限制性内切酶酶切位点用下划线标出；pcr扩增得到的dna片段用胶回收试剂盒纯化。含有pet28bmbp质粒的e.colidh5α用lb液体培养基37℃，220r/min培养过夜，质粒提取采用参照tianprepminiplasmidkit。目的片段与质粒pet28bmbp质粒限双酶切，酶切体系如下：酶切产物用胶回收试剂盒回收片段，并通过t4连接酶连接。实施例3e.colirosetta(de3)感受态细胞的制备及转化a)从种子培养基中取0.4ml接种于20mllb液体培养基中培养3h；b)3000r/min，5min分两次富集2ml菌体于1.5mlep管中，弃上清；c)加入100μl冰冷tss溶液，重新悬浮菌体，冰浴30min；d)加入20μl连接液轻轻旋转混匀，冰浴30min；e)42℃热休克60s，冰浴2min，加入600μllb液体培养基。37℃培养，150r/min振荡培养1h；f)分别取150μl涂布于lb抗性平板。实施例4突变体的构建突变库的构建是利用突变引物和侧翼引物，重叠延伸pcr进行的。(设计的突变引物如下：)pcr扩增条件：94℃：10min，(94℃：30s，45℃：30s，72℃：30s)35个循环，72℃：10min。所得基因片段经过纯化，按如下pcr扩增按实施例2中所述pcr获得目的片段并连接到pet28bmbp载体上，按实施例3所述转化到e.colirosetta(de3)中。分别得到了野生型醛酮还原酶bsakr(yvgn)与其突变体。实施例5突变体表达a)取单菌落接种于4ml卡那霉素抗性lb液体培养基中，37℃，200rpm培养6h后得到种子液；b)取20μl种子液接种于20ml卡那霉素抗性lb液体培养基中，37℃，200rpm培养至培养液od600达到0.8-1.0时加入终浓度0.5mmiptg，并将温度降至20℃诱导表达20h；c)4000rpm×15min离心培养液收集菌体，生理盐水洗涤两次后用0.1mph6.0磷酸钠缓冲液重选菌体，加入终浓度1mg/ml溶菌酶，30℃，200rpm破碎1h后，4℃下，10000rpm离心收集上清进行筛选。实施例6葡萄糖脱氢酶表达将含有pet22b-gdh质粒的e.colirosetta(de3)按照实施例5所述表达获得葡萄糖脱氢酶。实施例7粗酶液催化还原本实施例中涉及的典型底物如下所示：反应体系：如实施例5、6中所述的上清各450μl混匀，终浓度0.3mmnadp+，8mg葡萄糖，4mg底物(100μl甲醇助溶)，30℃反应6h；用等体积乙酸乙酯萃取三次。实施例8高效液相分析底物和产物高效液相分析的底物包括了sub1-13，sub1-13的结构为：检测sub1、2及产物的条件为：色谱柱：ad-h，流动相：正己烷：异丙醇＝90:10，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：25℃，检测器：uv检测器。检测sub3、4、5及产物的条件为：色谱柱：od-h，流动相：正己烷：异丙醇＝90:10，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：25℃，检测器：uv检测器。检测sub6、8及产物的条件为：色谱柱：od-h，流动相：正己烷：异丙醇＝98:2，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：25℃，检测器：uv检测器。检测sub7、9及产物的条件为：色谱柱：ob-h，流动相：正己烷：异丙醇＝95:5，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：25℃，检测器：uv检测器。检测sub10及产物的条件为：色谱柱：oj-h，流动相：正己烷：异丙醇＝95:5，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：25℃，检测器：uv检测器。检测sub11及产物的条件为：色谱柱：oj-h，流动相：正己烷：异丙醇＝90:10，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：25℃，检测器：uv检测器。检测sub12及产物的条件为：色谱柱：od-h，流动相：正己烷：异丙醇＝90:10，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：25℃，检测器：uv检测器。检测sub13及产物的条件为：色谱柱：ad-h，流动相：正己烷：异丙醇＝95:5，流速：0.8ml/min，波长：254nm，柱温：25℃，检测器：uv检测器。野生型醛酮还原酶(seqidno.2)及其突变体(seqidno.4，seqidno.6，seqidno.8)催化上述底物的检测结果如表1所示：表1醛酮还原酶bsakr(yvgn)野生型及其突变体催化还原α-酮酸酯类及1-苯基乙酮类化合物检测结果a)转化率[％]；b)还原产物醇对映体过量值(ee％)；c)还原产物醇的绝对构型；na:未检测到活性。序列表<110>沈阳药科大学<120>醛酮还原酶bsakr（yvgn）及其突变体和应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>828<212>dna<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)<400>1atgccaacaagtttaaaagatactgtaaagttacataacggagtggaaatgccttggttc60ggtcttggtgtttttaaagtagaaaatggaagtgaagcgactgaatcagtgaaagcggca120attaaaaacggctaccgcagcattgatacagcagctgtctacaaaaatgaagaaggtgtt180ggcatcgggatcaaggaatccggtgtggcaagagaagagctctttattacatcaaaagta240tggaatgaagatcaaggctacgaaacaacgcttgctgcctttgaaaaaagcttggaaaga300cttcagcttgattacttagatctatatttgatccactggcctggcaaggataaatataaa360gatacatggcgtgcgcttgaaaagctgtataaagacggcaaaatccgcgcaatcggtgtc420agcaacttccaagttcatcatttagaagaactgctgaaagacgcagaaatcaaaccgatg480gtgaaccaagtagaatttcaccctcgtttgacgcagaaagaattaagagattactgcaaa540gcgcaaggcattcagttggaagcgtggtctccgctcatgcagggacagcttttggataac600gaagtgcttgcacagattgctgaaaaacacaataaatctgtggctcaagtcattttgcgc660tgggatcttcagcatgaagttgtaacaattccaaaatccatcaaagaacaccgtatcatc720gaaaacgctgatatttttgatttcgaattgtctcaggaagacatggacaaaattgacgcg780ttaaacaaagatgagcgtgtcggtccaaatcctgatgagcttctgttt828<210>2<211>276<212>prt<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)<400>2metprothrserleulysaspthrvallysleuhisasnglyvalglu151015metprotrppheglyleuglyvalphelysvalgluasnglyserglu202530alathrgluservallysalaalailelysasnglytyrargserile354045aspthralaalavaltyrlysasnglugluglyvalglyileglyile505560lysgluserglyvalalaargglugluleupheilethrserlysval65707580trpasngluaspglnglytyrgluthrthrleualaalapheglulys859095serleugluargleuglnleuasptyrleuaspleutyrleuilehis100105110trpproglylysasplystyrlysaspthrtrpargalaleuglulys115120125leutyrlysaspglylysileargalaileglyvalserasnphegln130135140valhishisleuglugluleuleulysaspalagluilelyspromet145150155160valasnglnvalgluphehisproargleuthrglnlysgluleuarg165170175asptyrcyslysalaglnglyileglnleuglualatrpserproleu180185190metglnglyglnleuleuaspasngluvalleualaglnilealaglu195200205lyshisasnlysservalalaglnvalileleuargtrpaspleugln210215220hisgluvalvalthrileprolysserilelysgluhisargileile225230235240gluasnalaaspilepheaspphegluleuserglngluaspmetasp245250255lysileaspalaleuasnlysaspgluargvalglyproasnproasp260265270gluleuleuphe275<210>3<211>828<212>dna<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)<400>3atgccaacaagtttaaaagatactgtaaagttacataacggagtggaaatgccttggttc60ggtcttggtgttagcaaagtagaaaatggaagtgaagcgactgaatcagtgaaagcggca120attaaaaacggctaccgcagcattgatacagcagctgtctacaaaaatgaagaaggtgtt180ggcatcgggatcaaggaatccggtgtggcaagagaagagctctttattacatcaaaagta240tggaatgaagatcaaggctacgaaacaacgcttgctgcctttgaaaaaagcttggaaaga300cttcagcttgattacttagatctatatttgatccactggcctggcaaggataaatataaa360gatacatggcgtgcgcttgaaaagctgtataaagacggcaaaatccgcgcaatcggtgtc420agcaacttccaagttcatcatttagaagaactgctgaaagacgcagaaatcaaaccgatg480gtgaaccaagtagaatttcaccctcgtttgacgcagaaagaattaagagattactgcaaa540gcgcaaggcattcagttggaagcgtggtctccgctcatgcagggacagcttttggataac600gaagtgcttgcacagattgctgaaaaacacaataaatctgtggctcaagtcattttgcgc660tgggatcttcagcatgaagttgtaacaattccaaaatccatcaaagaacaccgtatcatc720gaaaacgctgatatttttgatttcgaattgtctcaggaagacatggacaaaattgacgcg780ttaaacaaagatgagcgtgtcggtccaaatcctgatgagcttctgttt828<210>4<211>276<212>prt<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)<400>4metprothrserleulysaspthrvallysleuhisasnglyvalglu151015metprotrppheglyleuglyvalserlysvalgluasnglyserglu202530alathrgluservallysalaalailelysasnglytyrargserile354045aspthralaalavaltyrlysasnglugluglyvalglyileglyile505560lysgluserglyvalalaargglugluleupheilethrserlysval65707580trpasngluaspglnglytyrgluthrthrleualaalapheglulys859095serleugluargleuglnleuasptyrleuaspleutyrleuilehis100105110trpproglylysasplystyrlysaspthrtrpargalaleuglulys115120125leutyrlysaspglylysileargalaileglyvalserasnphegln130135140valhishisleuglugluleuleulysaspalagluilelyspromet145150155160valasnglnvalgluphehisproargleuthrglnlysgluleuarg165170175asptyrcyslysalaglnglyileglnleuglualatrpserproleu180185190metglnglyglnleuleuaspasngluvalleualaglnilealaglu195200205lyshisasnlysservalalaglnvalileleuargtrpaspleugln210215220hisgluvalvalthrileprolysserilelysgluhisargileile225230235240gluasnalaaspilepheaspphegluleuserglngluaspmetasp245250255lysileaspalaleuasnlysaspgluargvalglyproasnproasp260265270gluleuleuphe275<210>5<211>828<212>dna<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)<400>5atgccaacaagtttaaaagatactgtaaagttacataacggagtggaaatgccttggttc60ggtcttggtgtttttaaagtagaaaatggaagtgaagcgactgaatcagtgaaagcggca120attaaaaacggctaccgcagcattgatacagcagctgtctacaaaaatgaagaaggtgtt180ggcatcgggatcaaggaatccggtgtggcaagagaagagctctttattacatcaaaagta240tggaatgaagatcaaggctacgaaacaacgcttgctgcctttgaaaaaagcttggaaaga300cttcagcttgattacttagatctatatttgatccactttcctggcaaggataaatataaa360gatacatggcgtgcgcttgaaaagctgtataaagacggcaaaatccgcgcaatcggtgtc420agcaacttccaagttcatcatttagaagaactgctgaaagacgcagaaatcaaaccgatg480gtgaaccaagtagaatttcaccctcgtttgacgcagaaagaattaagagattactgcaaa540gcgcaaggcattcagttggaagcgtggtctccgctcatgcagggacagcttttggataac600gaagtgcttgcacagattgctgaaaaacacaataaatctgtggctcaagtcattttgcgc660tgggatcttcagcatgaagttgtaacaattccaaaatccatcaaagaacaccgtatcatc720gaaaacgctgatatttttgatttcgaattgtctcaggaagacatggacaaaattgacgcg780ttaaacaaagatgagcgtgtcggtccaaatcctgatgagcttctgttt828<210>6<211>276<212>prt<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)<400>6metprothrserleulysaspthrvallysleuhisasnglyvalglu151015metprotrppheglyleuglyvalphelysvalgluasnglyserglu202530alathrgluservallysalaalailelysasnglytyrargserile354045aspthralaalavaltyrlysasnglugluglyvalglyileglyile505560lysgluserglyvalalaargglugluleupheilethrserlysval65707580trpasngluaspglnglytyrgluthrthrleualaalapheglulys859095serleugluargleuglnleuasptyrleuaspleutyrleuilehis100105110pheproglylysasplystyrlysaspthrtrpargalaleuglulys115120125leutyrlysaspglylysileargalaileglyvalserasnphegln130135140valhishisleuglugluleuleulysaspalagluilelyspromet145150155160valasnglnvalgluphehisproargleuthrglnlysgluleuarg165170175asptyrcyslysalaglnglyileglnleuglualatrpserproleu180185190metglnglyglnleuleuaspasngluvalleualaglnilealaglu195200205lyshisasnlysservalalaglnvalileleuargtrpaspleugln210215220hisgluvalvalthrileprolysserilelysgluhisargileile225230235240gluasnalaaspilepheaspphegluleuserglngluaspmetasp245250255lysileaspalaleuasnlysaspgluargvalglyproasnproasp260265270gluleuleuphe275<210>7<211>828<212>dna<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)<400>7atgccaacaagtttaaaagatactgtaaagttacataacggagtggaaatgccttggttc60ggtcttggtgttagcaaagtagaaaatggaagtgaagcgactgaatcagtgaaagcggca120attaaaaacggctaccgcagcattgatacagcagctgtctacaaaaatgaagaaggtgtt180ggcatcgggatcaaggaatccggtgtggcaagagaagagctctttattacatcaaaagta240tggaatgaagatcaaggctacgaaacaacgcttgctgcctttgaaaaaagcttggaaaga300cttcagcttgattacttagatctatatttgatccactttcctggcaaggataaatataaa360gatacatggcgtgcgcttgaaaagctgtataaagacggcaaaatccgcgcaatcggtgtc420agcaacttccaagttcatcatttagaagaactgctgaaagacgcagaaatcaaaccgatg480gtgaaccaagtagaatttcaccctcgtttgacgcagaaagaattaagagattactgcaaa540gcgcaaggcattcagttggaagcgtggtctccgctcatgcagggacagcttttggataac600gaagtgcttgcacagattgctgaaaaacacaataaatctgtggctcaagtcattttgcgc660tgggatcttcagcatgaagttgtaacaattccaaaatccatcaaagaacaccgtatcatc720gaaaacgctgatatttttgatttcgaattgtctcaggaagacatggacaaaattgacgcg780ttaaacaaagatgagcgtgtcggtccaaatcctgatgagcttctgttt828<210>8<211>276<212>prt<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)<400>8metprothrserleulysaspthrvallysleuhisasnglyvalglu151015metprotrppheglyleuglyvalserlysvalgluasnglyserglu202530alathrgluservallysalaalailelysasnglytyrargserile354045aspthralaalavaltyrlysasnglugluglyvalglyileglyile505560lysgluserglyvalalaargglugluleupheilethrserlysval65707580trpasngluaspglnglytyrgluthrthrleualaalapheglulys859095serleugluargleuglnleuasptyrleuaspleutyrleuilehis100105110pheproglylysasplystyrlysaspthrtrpargalaleuglulys115120125leutyrlysaspglylysileargalaileglyvalserasnphegln130135140valhishisleuglugluleuleulysaspalagluilelyspromet145150155160valasnglnvalgluphehisproargleuthrglnlysgluleu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