诱导脐带间充质干细胞成脂分化的培养方法，以及该方法所用的培养基与流程

本发明涉及细胞诱导培养
技术领域：
，具体而言，涉及一种诱导脐带间充质干细胞成脂分化的培养方法，以及该方法所用的培养基。
背景技术：
：间充质干细胞(mesenchymalstemcells，msc)是中胚层来源的、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。事实上，msc广泛存在于全身多种组织中，几乎来源于机体所有的组织器官，如骨髓、骨膜、脂肪组织、牙髓、滑膜、脐带、胎盘、羊水及胎儿组织等。不同来源的间充质干细胞具有相似的形态，表达相同的表面标记，具有相似的生物学特性方面，如可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为包括神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞在内的多组织系统的细胞。msc除了具有多向组织细胞分化能力之外，还在造血、免疫炎症反应、血管新生等人体重要功能中起重要调节作用。脐带间充质干细胞是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞。脐带间充质是一类低免疫原性细胞，且具有很强的免疫调节功能。脐带间充质干细胞拥有msc的全部特性，并且含量丰富，易于分离培养。与其他来源的msc相比，uc-msc更原始，是介于胚胎干细胞和成体干细胞之间的干细胞，其增殖和分化能力比胚胎干细胞低，但明显高于成体干细胞。脐带间充质干细胞具有多分化潜能，在特定的诱导条件下，uc-msc不仅能分化为骨、软骨、脂肪、肌腱等中胚层细胞，而且能够向内胚层组织细胞(如心肌细胞、肝细胞)和外胚层组织细胞(如神经细胞)分化。uc-msc不具致瘤性，能在不同的诱导条件及合适的体内生长微环境中，安全地定向分化为不同的组织细胞系，具有修复各种组织和器官的能力。将脐带间充质干细胞诱导分化成脂肪细胞是一个受多种因素控制的复杂过程，有多个基因参与调控，成脂方向的分化是与成脂相关的一系列转录因子被激活的结果。因子主要有：rev-erb-a、notch、kruppe1样因子-15(klf150、肝x受体(lxrs0、3-羟甲基戊二酸单酰coa合酶(hmcs)、环腺苷酸应答元件结合蛋白/抗体(creb)、stat等。成脂肪刺激物也有很多种，在培养基中添加地塞米松、3-异丁基-1-加急黄嘌呤(ibmx)、胰岛素和消炎痛等，可诱导脐带间充质干细胞向脂肪分化。脐带间充质干细胞的成脂分化是间充质干细胞一个较难实现的分化试验，诱导组分对脂肪细胞的形成有极大的影响。目前的诱导技术，成脂分化率极低，只有极少数的间充质干细胞能够分化成脂肪细胞，形成脂滴，其余大部分细胞始终无法形成脂滴。脂滴的大小也是评判成脂分化优劣的评价指标，大部分诱导分化方法只能形成极小的分散型脂滴，说明培养方案无法是间充质干细胞充分分化成脂肪细胞。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的主要目的在于通过优化脐带间充质干细胞诱导分化为脂肪过程中诱导分化组分，提高脐带间充质干细胞分化为脂肪细胞的速度和比率，提高诱导后脂肪细胞的品质。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：本发明涉及一种诱导脐带间充质干细胞成脂分化的培养基，其由基础培养基中至少额外添加如下组分得到：地塞米松0.7～1.3μmol/l、吲哚美辛400～600μmol/l、ibmx0.3～0.7mmol/l、胰岛素7～13μmol/l以及抗坏血酸酯40～60μg/ml。根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种诱导脐带间充质干细胞成脂分化方法，包括：使用如上所述的培养基培养脐带间充质干细胞。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过优化诱导组分，配合特定的培养方法，提高了诱导速度和效率，5～7天即可看到大量细胞内脂滴形成，诱导效率极高。随着诱导时间，脂滴逐渐变大，说明成脂细胞功能良好。12～14天染色，可以看到非常经典的红色油滴。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明一个实施例中培育得到的脂肪细胞的油红o染色照片，×10；图2为本发明一个实施例中培育得到的脂肪细胞的油红o染色照片，×20；图3为本发明一个实施例中培育得到的脂肪细胞的油红o染色照片，×40。具体实施方式本发明涉及一种诱导脐带间充质干细胞成脂分化的培养基，其由基础培养基中至少额外添加如下组分得到：地塞米松0.7～1.3μmol/l、吲哚美辛400～600μmol/l、ibmx0.3～0.7mmol/l、胰岛素7～13μmol/l以及抗坏血酸酯40～60μg/ml。在一些实施方式中，其由基础培养基中至少额外添加如下组分得到：地塞米松0.8～1.2μmol/l、吲哚美辛450～550μmol/l、ibmx0.4～0.6mmol/l、胰岛素8～12μmol/l以及抗坏血酸酯45～55μg/ml。在一些实施方式中，其由基础培养基中至少额外添加如下组分得到：地塞米松1μmol/l、吲哚美辛500μmol/l、ibmx0.5mmol/l、胰岛素10μmol/l以及抗坏血酸酯50μg/ml。在一些实施方式中，所述基础培养基为dmem低糖培养基；在一些实施方式中，所述dmem低糖培养基中含有8％～12％fbs以及0.08％～0.12％的谷氨酰胺。dmem低糖培养基可选择为86％～92％低糖dmem，低糖培养基适合于脐带间充质干细胞向脂肪细胞的分化。根据本发明的另一方面，本发明还涉及一种诱导脐带间充质干细胞成脂分化方法，包括：使用如上所述的培养基培养脐带间充质干细胞。在一些实施方式中，用于接种的脐带间充质干细胞为p3～p5代，细胞汇合度为70％～80％且状态良好的细胞经消化后收集得到。此培养阶段的脐带间充质干细胞生长迅速，利于分化培养。在一些实施方式中，所述消化所采用的胰酶浓度为0.20％～0.30％；还可以选择0.25％。在一些实施方式中，在消化完成，清洗细胞后，将细胞移至透气尖底细胞培养管中，离心后去除上层液体。在一些实施方式中，在培养时，细胞的接种量为每2ml培养基接种(1～5)×104个细胞。在一些实施方式中，细胞的接种量为每2ml培养基接种(2～4)×104个细胞；或3×104个细胞。在一些实施方式中，所述培养的时间为12～14天，还可以选择13天；在一些实施方式中，每2～4天换液一次。下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例11.诱导组分2.诱导培养基的配制1)诱导分化的基础培养基为89％低糖dmem、10％fbs胎牛血清和1％谷氨酰胺。其中谷氨酰胺临用时加入。2)以配制100ml完全诱导培养基计算诱导组分地塞米松、吲哚美辛、ibmx、胰岛素、抗坏血酸酯的用量，用无菌0.5mlep管分装好，-20℃保存。所有组分避光保存。3)配制时将所需体积的基础培养基、地塞米松、吲哚美辛、ibmx、胰岛素、抗坏血酸酯取出，溶化后混合，配成完全培养基，可4℃保存5-7d。3.诱导分化步骤1)取t75瓶接种的，p3-p5代长满至70-80％且状态良好的脐带间充质干细胞一瓶，移液管吸去培养基，加入2mlpbs轻轻旋转冲洗掉剩余培养基。2)加入1ml提前室温平衡的0.25％的胰酶，轻轻旋转使胰酶均匀分布。平放静止1-2min左右，举起培养瓶在灯下肉眼观察贴壁的细胞是否斑驳脱落。如消化过程较慢，可轻轻拍打培养瓶侧壁，通过震动加速细胞脱落。3)细胞基本全部脱落后，加入1ml血清，旋转混合终止胰酶的消化作用。加入10mlpbs收集细胞，将收集的细胞转移到50ml离心管内。再次加入10mlpbs，旋转培养瓶，收集剩余细胞。4)置于离心机中，配平，1000rpm离心5min，轻轻吸去上清液。加入20mlpbs再次1000rpm离心5min，轻轻吸去上清液。5)10ml基础培养基重悬细胞，用细胞计数板计数，计算出细胞密度。6)取3×104的脐带间充质干细胞于直径9cm细胞培养皿中，加入基础培养基至终体积2ml，轻轻晃动培养皿使细胞在整个培养皿中均匀分布。7)将细胞培养皿轻轻置于co2培养箱中，隔夜培养，使细胞贴壁。8)第二天吸走基础培养基，轻轻加入2ml诱导培养基，为开始诱导d0。9)每3天换液一次，同时观察细胞状态。5-7天即可看到脂滴形成。12-14天部分脂滴已经非常大，此时即应该进行染色，若延迟脂滴可能破裂。实施例21.诱导组分2.诱导培养基的配制同实施例1。3.诱导分化步骤同实施例1。实施例31.诱导组分名称含量地塞米松0.9μmol/l吲哚美辛550μmol/libmx0.6mmol/l胰岛素11μmol/l抗坏血酸酯45μg/ml2.诱导培养基的配制同实施例1。3.诱导分化步骤同实施例1。实施例41.诱导组分名称含量地塞米松1μmol/l吲哚美辛500μmol/libmx0.5mmol/l胰岛素10μmol/l抗坏血酸酯50μg/ml2.诱导培养基的配制同实施例1。3.诱导分化步骤同实施例1。实验例对实施例4培养分化所得的脂肪细胞进行油红o染色鉴定。1)将油红o工作液用中性滤纸过滤，去掉其中的杂质。2)将培养皿内诱导培养基吸走，轻轻加入2mlpbs冲洗2次。3)加入2ml4％中心甲醛固定30min，吸去甲醛，轻轻加入2mlpbs冲洗2次。4)加入1ml油红o工作液，染色30min。5)吸走油红o染液，用1mlpbs清洗2次。6)显微镜下观察，拍照。拍照结果如图1～3所示。由显微镜低倍照片可以看到，脐带间充质干细胞大量地分化为成脂细胞，分化比例非常高。高倍镜照片可以看到有大量大的脂滴存在，说明成脂分化状态非常良好。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。当前第1页12