鉴别水稻耐盐基因OsRR22野生型或突变体的特异性CAPS标记、引物及该引物用途的制作方法

本发明涉及植物生物
技术领域：
，具体涉及一种能够用于鉴别水稻耐盐基因osrr22野生型或突变体的特异性caps标记、引物及该引物用途。
背景技术：
：水稻(oryzasatival．)是世界上最重要的粮食作物之一，是全球三分之一人口的主要口粮，水稻产量是否供给充足直接影响全球粮食安全。而盐碱胁迫是制约水稻生产的主要非生物胁迫因素之一。关于盐碱胁迫，一方面，还有较大面积的盐碱地无法种植水稻，另一方面，我们面临的环境日益恶化，土地盐碱化逐年加剧，全球受盐侵害的稻田约占栽培面积的20%，提高水稻耐盐性已成为育种家的重要目标之一。截至目前，已经克隆的耐盐相关的基因有：skc1,dst,osrr22,hal2,p5cs,cmo,badh,mtld,gutd和samdc等。其中，osrr22是一个负调控基因，编码一个696个氨基酸的b型反应调节蛋白转录因子，参与细胞分裂素信号转导和代谢，它的功能缺失显著提高了耐盐性。crispr/cas是一种在细菌和古细菌中发现的获得性免疫防御系统，目前已发现的crispr/cas系统包括ⅰ、ⅱ和ⅲ型，其中ⅱ型系统的组成较简单，由其改造成的crispr/cas9技术以其易操作、低成本、高效率、高特异性和多重基因编辑等优势迅速成为了植物基因组精确编辑最为有效的工具，广泛地应用于动物、植物、微生物等基因功能和遗传改良研究。利用crispr/cas9技术定点敲除不利基因或者负调控基因，快速敲除控制不良性状的基因簇从而实现目标性状的精准改良，将会大大提高作物定向遗传改良效率。caps(cleavedamplificationpolymorphismsequence-taggedsites)技术又可称为pcr-rflp，限制性片段长度多态性聚合酶链反应技术。所用的pcr引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是：先进行pcr扩增，然后将pcr扩增产物用限制性内切酶酶切，再用琼脂糖凝胶电泳检测观察多态性。申请人日前增对自选育粳稻品种wdr58（其为秀水123///秀水123//秀水123/75-1-127，即将75-1-127与秀水123杂交，再将其后代与秀水123回交两次再自交5代所得的稳定品系），通过crispr/cas9技术定点编辑水稻耐盐基因osrr22，获得一个耐盐性显著提高的osrr22基因功能缺失纯和突变体wdr58-cas-1。为提高wdr58-cas-1突变体在耐盐育种中的利用效率，如何开发一种用于区分wdr58-cas-1突变体与野生型的分子标记，以实现耐盐基因osrr22突变体基因型的高效鉴定，在后续利用wdr58-cas-1突变体进行耐盐育种中具有重要价值。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是：提出一种用于鉴别水稻耐盐基因osrr22野生型或突变体的特异性caps标记、引物及该引物用途。本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（一）是：一种鉴别水稻耐盐基因osrr22野生型或突变体的特异性caps标记，其特征在于：包括用于检测野生型位点的标记cas-osrr22-1，所述标记cas-osrr22-1的核苷酸序列如seqidno:2所示。2、根据权利要求1所述的鉴别水稻耐盐基因osrr22野生型或突变体的特异性caps标记，其特征在于：所述突变体为wdr58-cas-1，所述标记还包括用于检测突变体wdr58-cas-1位点的标记cas-osrr22-2，所述标记cas-osrr22-2的核苷酸序列如seqidno:3所示。本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（二）是：一种用于鉴别水稻耐盐基因osrr22野生型或突变体的特异性caps标记的引物，其特征在于所述的引物为：上游引物caps-tailⅰf：5’-cttgggattgctctgtttct-3’下游引物caps-tailⅰr：5’-gtaatagcctggttggttgat-3’。本发明为解决上述技术问题提出的技术方案（三）是：上述用于鉴别水稻耐盐基因osrr22野生型或突变体的特异性caps标记的引物在水稻耐盐辅助育种中的应用。进一步的，前述应用包含以下步骤：i、提取供试水稻样品基因组dna；ii、利用所述引物caps-tailⅰ-f和caps-tailⅰ-r对步骤i中得到dna进行pcr扩增；iii、将步骤ii中得到的扩增产物经过限制性内切酶tailⅰ酶切，并对酶切产物进行分析，如果所述扩增产物能够切成255bp和400bp的特征条带，所述样品为osrr22基因突变纯合体；如果所述扩增产物不能酶切，只含有654bp的特征条带，所述样品为野生型；如果所述酶切产物同时存在654bp、255bp和400bp的特征条带，则所述样品为osrr22基因突变杂合体。进一步的，在步骤ii中，所述pcr扩增的扩增体系为：20ng水稻基因组dna模板，10ultaqpcrmastermix，10um的前后引物各1ul，补充ddh2o至20ul。pcr扩增程序为：95℃预变性5min，然后按95℃30s，55℃下30s，72℃下45s进行30个循环，最后72℃下延伸5min；在步骤iii中，所述酶切的反应体系为：2ul10×fastdigestbuffer，1ulfastdigesttailⅰ，10ulpcr产物，补充ddh2o至30ul，反应条件65℃反应5min；之后进行琼脂糖凝胶电泳检测。本发明的有益效果是：本发明中的标记、引物及该引物用途较现有水稻育种技术具有以下优点：1、开发了一种用于区分wdr58-cas-1突变体与野生型的分子标记，以实现耐盐基因osrr22突变体基因型的高效鉴定，在后续利用wdr58-cas-1突变体进行耐盐育种中具有重要价值。2、本发明提供的caps标记是根据耐盐基因osrr22在突变体和野生型之间crispr/cas9特异修饰的位点设计的基于pcr扩增和限制性内切酶的功能性标记，其基因型能直接反映植株的表型，不存在由于遗传交换而造成的误差，操作上较测序方法简捷，降低了成本。3、本发明提供的分子标记方法应用于水稻耐盐性状改良的辅助育种，可以在杂交育种、回交分离群体等进行鉴定，准确的区分杂合和纯和基因型，提高育种效率。附图说明图1是是osrr22基因靶点序列示意图；图2是鉴别水稻耐盐基因osrr22野生型和突变体的特异性caps标记及其引物设计策略；图3是caps-tailⅰpcr扩增产物经酶切后在1.5%的琼脂糖凝胶电泳结果。图2中，箭头表示上下游引物所在位置，黑框部分表示单碱基插入产生的tailⅰ的酶切位点。具体实施方式pylgrna-osu6a/lacz质粒和pylcrispr/cas9pubi-h载体均由华南农业大学生命科学学院提供（maetal.,2015,molecularplant,doi:10.1016/j.molp.2015.04.007）；水稻品系为wdr58，其为秀水123///秀水123//秀水123/75-1-127，即将75-1-127与秀水123杂交，再将其后代与秀水123回交两次再自交5代所得的稳定品系。实施例1：本实施例涉及基于crispr-cas9技术的水稻耐盐基因osrr22缺失突变体的创建。（1）引导rna靶点序列选择与引物设计根据控制水稻耐盐基因osrr22的基因组序列（genbank:br000251.1），设计1个耐盐基因osrr22的sgrna。20nt的核苷酸sgrna靶点序列按照5’-n20-ngg-3’序列进行设计，同时设计靶点序列引物rr22-grt+和rr22-osu6at-，其3’端有15-17nt分别与sgrna和u6a启动子配对。将设计好的sgrna靶点序列进行水稻基因组数据库比对排除非特异性的靶切位点，具体靶点核苷酸序列如下，见图1。rr22-grt+:5’-agagggatcaattccccgtgttttagagctagaaat-3’rr22-osu6at-:5’-acggggaattgatccctctcggcagccaagccagca-3’（2）靶点序列sgrna表达盒的构建参考ma等人的方法（maetal.,2015,molecularplant,doi:10.1016/j.molp.2015.04.007），取2-5ngpylgrna-osu6a/lacz质粒（1ul）为模板，在两个反应体系中分别进行pcr扩增：u-f和rr22-osu6at-用于扩增osu6a-靶点片段，gr-r和rr22-grt+用于扩增sgrna-靶点片段。一般使用kodplus聚合酶(toyobo)，反应体系为1ul质粒模板，2.5ul10×buffer，0.5ulkodplus聚合酶，1ul25mm的mgso4，2.5ul2mm的dntps，10um的前后引物各0.5ul，补充ddh2o至25ul；pcr扩增程序为：95℃2min，98℃10s，58℃15s，68℃20s25个循环。电泳检测pcr产物，osu6a-靶点片段为700bp左右，grna-靶点片段为131bp左右。取第一轮两个pcr产物各1μl为模板，用引物u-gal和pgs-gar按以上步骤进行第二轮pcr,30循环。产物大小为831bp.凝胶电泳检测，切胶回收，此产物即为耐盐基因osrr22靶点序列-sgrna表达盒。所述的gibsonassembly的引物为：u-f:5’-ctccgttttacctgtggaatcg-3’gr-r:5’-cggaggaaaattccatccac-3’u-gal:5’-accggtaaggcgcgccgtagtgctcgactagtatggaatcggcagcaaagg-3’pgs-gar:5’-tagctcgagaggcgcgccaatgataccgacgcgtatccatccactccaagctcttg-3’（3）靶点crispr/cas9-sgrna载体构建组装靶点序列sgrna表达盒到pylcrispr/cas9pubi-h载体，以南京诺唯赞生物科技有限公司的clonexpress快速克隆重组酶为例：按下表配制重组反应体系：ddh2oupto20μl5×ceiibuffer4μl线性化pylcrispr/cas9pubi-h载体50～200ng靶点序列-grna表达盒扩增产物20～200ngexnasetmii2μl37度30min进行反应，结束后直接进行转化，涂布含卡那霉素的lb平板筛选阳性克隆，次日挑取阳性单克隆进行测序验证。（4）农杆菌介导水稻愈伤遗传转化将步骤3构建好的crispr/cas9-grna载体通过农杆菌介导的方法侵染水稻材料wdr58的愈伤组织，具体方法参考于恒秀等（2005）进行，获得转基因水稻植株。（5）转基因水稻的dna提取及突变体的测序分析采用jrstewart等（1993）的ctab法提取步骤4中获得的转基因水稻植株的基因组dna，对潮霉素基因检测为阳性的24个植株利用测序引物rr22-ce-f和rr22-ce-r对osrr22突变位点进行pcr扩增。其中鉴定引物为：rr22-ce-f：gggtgctttgaggatggarr22-ce-r：agcctggttggttgatgtta反应体系为：20ng水稻基因组dna模板，10ultaqpcrmastermix（天根生化科技(北京)有限公司），10um的前后引物各1ul，补充ddh2o至20ul。pcr扩增程序为：95℃预变性5min，然后按95℃30s，55℃下30s，72℃下45s进行30个循环，最后72℃下延伸5min。对pcr扩增产物进行的测序结果分析表明，24个阳性转基因植株中，有22株osrr22基因发生突变，突变频率为91.7%，其中25%为纯合突变。（6）无转基因成分osrr22突变体的获得4株osrr22基因纯和突变体为插入突变，测序结果显示在osrr22基因位点的第69核苷酸位置有1bp（a）插入导致氨基酸移码突变，翻译提前终止，造成osrr22基因功能缺失。将这4株t0代突变体转基因苗移栽大田自交获得t1代种子，t1代播种苗期检测潮霉素基因的有无，保留不含有潮霉素基因而含有osrr22基因纯合突变位点的个体。水稻苗三叶一心期，放入0.75%氯化钠浓度的培养液中下处理7天后，进行耐盐性筛选。获得耐盐性比对照显著提高的突变体株系，命名为wdr58-cas-1（表1）。表1突变体株系的靶点序列差异靶点序列突变类型野生型wtagagggatcaattccccgt插入突变体wdr58-cas-1agagggatcaattcccacgt+a其中突变体wdr58-cas-1中，osrr22基因的核苷酸序列见seqidno:1。突变体wdr58-cas-1中，osrr22基因的氨基酸序列为：mllgalrmeerkglmgrerdqfprrhagprrrr*实施例2：本实施例涉及鉴别水稻耐盐基因osrr22野生型和突变体的特异性caps标记的建立（1）引物设计分别对水稻耐盐基因osrr22在粳稻品系wdr58及wdr58-cas-1突变体进行扩增测序，分析发现wdr58-cas-1突变体在osrr22基因位点的第69核苷酸位置有1bp（a）插入导致氨基酸移码突变，翻译提前终止，造成osrr22基因功能缺失从而使耐盐性得到提高。对该区域进行生物信息学分析，发现这1bp的插入产生了一个tailⅰ限制性内切酶位点（5’...acgt⊥...3’）,而野生型不含有tailⅰ的酶切位点（5’...cgt...3’），如图2。利用primerpremier5.0软件在1bp插入突变区域的两侧设计包含该位点的上下游引物caps-tailⅰ。上游引物caps-tailⅰf：5’-cttgggattgctctgtttct-3’下游引物caps-tailⅰr：5’-gtaatagcctggttggttgat-3’。（2）扩增片段理论分析野生型基因组dna能扩增出1条654bp的片段（列见seqidno:2）；突变体wdr58-cas-1型基因组dna能扩增出1条655bp的片段（列见seqidno:3）。扩增产物经过限制性内切酶tailⅰ酶切：如果能够切成255bp、400bp的特征条带即为osrr22基因突变纯合体；如果不能酶切，只含有654bp的特征条带即为野生型；如果同时存在654bp、255bp和400bp的特征条带则为osrr22基因突变杂合体。（3）分子标记的验证供试材料：1、wdr58（野生型）；2-3、wdr58-cas-1突变体/日本晴的f1（杂合型）；4、日本晴（野生型）；5、wdr58-cas-1突变体。粳稻品种wdr58和日本晴的osrr22基因都是野生型，表型为盐敏感，wdr58-cas-1是对自选育粳稻品种wdr58通过crispr/cas9技术定点编辑水稻耐盐基因osrr22，获得一个耐盐性显著提高的osrr22基因功能缺失纯和突变体。按照常规ctab法提取供试水稻品种基因组dna，利用鉴定引物caps-tailⅰ进行pcr扩增，反应体系为：20ng水稻基因组dna模板，10ultaqpcrmastermix（天根生化科技(北京)有限公司），10um的前后引物各1ul，补充ddh2o至20ul。pcr扩增程序为：95℃预变性5min，然后按95℃30s，55℃下30s，72℃下45s进行30个循环，最后72℃下延伸5min。扩增产物经过限制性内切酶tailⅰ酶切，酶切反应体系为：2ul10×fastdigestbuffer（thermoscientific™），1ulfastdigesttailⅰ，10ulpcr产物，补充ddh2o至30ul。反应条件65℃反应5min，产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并对扩增产物进行测序验证，对基因型进行判定。结果如图3所示，图中m表示d2000marker；1表示wdr58；2-3表示wdr58-cas-1突变体/日本晴的f1；表示日本晴；5表示wdr58-cas-1突变体。osrr22基因野生型水稻品种wdr58和日本晴不能被tailⅰ酶切，只有654bp的特征条带；osrr22基因纯和突变型品系wdr58-cas-1能够被tailⅰ酶切，形成255bp、400bp两条特征条带；杂合型的f1代材料被tailⅰ酶切后形成654bp、255bp和400bp三条特征条带。酶切判读结果与测序结果符合，证明本发明开发的特异性caps标记能准确鉴别野生型和突变体，同时能进一步区分突变体的纯和、杂合个体，可以应用于水稻耐盐辅助育种，提高对水稻耐盐性状的选择效率。本发明的不局限于上述实施例，本发明的上述各个实施例的技术方案彼此可以交叉组合形成新的技术方案，另外凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。序列表<110>上海市农业生物基因中心<120>鉴别水稻耐盐基因osrr22野生型或突变体的特异性caps标记、引物及该引物用途<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2092<212>dna<213>wdr58-cas-1<400>1atgcttctgggtgctttgaggatggaggagaggaagggattgatggggagggagagggat60caattcccacgtcggcatgcgggtcctcgccgtcgacgatgacccggtgtgcctcaaggt120tcttgagaccctcctccggcgctgccaataccatgtaacatcaaccaaccaggctattac180tgcgttgaagctgctcagggagaacagggacatgtttgatcttgtcatcagtgatgtcca240catgcccgacatggacggatttaagctccttgagcttgtggggcttgaaatggatctccc300agtcatcatgttatcagtaaatggagagacaaagactgtgatgaaggggataactcatgg360tgcctgtgactatcttctaaaaccggtccgaatcgaagaactaaggaacatatggcagca420tgttgttaggaggaagttcggtaatcgtgagcgaaacaatcttgatttctccaaagaatg480caataagccgcaaagcgcggatactgatcatggaccataccaacctacctgtggttcttc540tgatcaaaatgggaggtccagcaggaaaaggaaagaactacacggcgaggacgacgatga600aggcgatgataatgattatcaagaaaatgatgagccctcagctgcaaagaagcccagagt660tgtatggtcagttgagctgcaccgaaaatttgttgccgctgtcaaccagcttggaattga720caaagctgtaccaaaaagaattcttgagcttatgaatgtggagaaactcaccagggaaaa780tgttgcaagtcatctacagaagtacaggctttacctcaagagactaggtgctgtagcatc840acaacaagccagcattgttgctgcctttggaggcagagatccctccttcttgcatattgg900agcatttgaaggactccagagctatcaaccttttgcaccttctgctgctcttccatcttt960caatccacatggcctgctaacccgaactagcgccgccgcggctttcggacttcaggagct1020tgctgccccctccagcacaattcagacttctacaggaaatgtcacagttggccattgctt1080ggaagaaaaccagcaggcaaatctagcacaaggcttgaccgcggcgatcgggcaacctca1140gcttcaacagaactggattcatcaagaaggtaatggtctgtctgatgttttttctgggag1200ttctctgaccaacactttgtccagcacactccaaagagttccaagcagttcattgccacc1260acaagaactcttggagtgcaaacaagccaaagttagcatgccgccatcgatacggatacc1320gccttctagttcagcacttcttgagaggactcttggggtttccaccaatttgggagattc1380tagtatatcccagcagggtgctcttccaatagatggtggattttctgctgacaggttacc1440attgcacagttcatttgatggcgctgttgcaacaaagctagatactagtttggcagcttc1500acagagagagattggccagcaggggaaattttcagttagcatgcttgtctccccttctga1560caatcttgcattagccaaaaatgccaaaactggagctagttcttctggcagtactataat1620tctccctcttgatactgcaagacattcagactacttgcagttcggaggtgcaagcaattc1680tttgcagaaaatggatggacagaaacaagatcatatacagagctcaaacattatatggag1740ttcaatgccaagcactcaactgccaagtgatacccaaattcataatactcaaaaccaaag1800attggacagcggaagttttaaccataatattggtgcccatttggctgaccaaacaaatgc1860aagtgcgtcaatacttccgcaaatgaagtttgacacaagaatatcagaagagaaaatgaa1920gcagaagaatacatatgacttgggtagttcaaagctgcagggtggatttaattctagtgg1980ctgcaattttgatggccttctcaattccataatcaaagtggagaaggatgatctcccatt2040catggacaatgaattgggctgtgacctttttccacttggtgcctgcatatga2092<210>2<211>654<212>dna<213>cas-osrr22-1<400>2cttgggattgctctgtttcttgctgagaattggctcgatttgggaggcctcatcttgtgt60tagctttcaggttttcttgcctgaaattgaaccgattgggtaggtttttaggtgcttcag120tttcagttgctagctcgtcaggcttgttcttgggctcctgccttgaattggggtcaaatt180gggatgcttctgggtgctttgaggatggaggagaggaagggattgatggggagggagagg240gatcaattccccgtcggcatgcgggtcctcgccgtcgacgatgacccggtgtgcctcaag300gttcttgagaccctcctccggcgctgccaataccatggtcagtatttacagtaaccgcag360ctaattgtacttccattatcagctatccatgatgctcaacttgctggtttttttgttcga420ttctgcatgttaatgacagtgttgttcttttgcttctgcttgcattgttcattgttgtat480tggagtactgtagttttcttagaaatctgaaatgtcactgatactagcatacttggcaca540ttttagaacttctgtatatcttataaatgcaatgcaatatgcctactatggtgcactgat600aagagctctcttatggtgatttttaacagtaacatcaaccaaccaggctattac654<210>3<211>655<212>dna<213>cas-osrr22-2<400>3cttgggat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