一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用与流程

(一)
技术领域：
本发明涉及一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用。(二)
背景技术：
：多粘类芽孢杆菌(paenibacilluspolymyxa)是杆状、产芽孢的革兰氏阳性细菌，多分离自植物根际土壤。近年来，由于其显著的植物促生功效和抑菌效果，被普遍认为是一种植物根际促生菌。多粘类芽孢杆菌能产生多种抑制细菌和真菌生长的拮抗物质，如多粘菌素、环杆菌素、乔利肽菌素、多肽菌素、谷缬菌素和杀镰孢菌素等多种抗生素，而且由于某些抗生素的合成方式属于非核糖体肽合成酶合成，这更加吸引了越来越多研究者的关注。质粒pwb980是wu等于1999年基于pub110改造构建而得的枯草芽孢杆菌表达载体，该质粒具有p43强组成型启动子和改造了的果聚糖蔗糖酶信号肽，在枯草芽孢杆菌中复制且赋予宿主卡那霉素抗性，该载体自构建后被成功应用于多种功能基因的分泌表达。多粘类芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌亲缘关系较近，质粒pwb980可在多粘类芽孢杆菌中复制表达。目前，多粘类芽孢杆菌存在转化效率低和遗传操作体系稳定性差等问题，尚难通过遗传学和分子生物学技术手段提高多粘类芽孢杆菌中有用物质的产量。pwb980是枯草芽孢杆菌基因表达载体，也可在多粘类芽孢杆菌中复制，但多粘类芽孢杆菌的转化步骤较繁琐，且其转化效率相对较低。大肠杆菌中基因克隆操作十分便利。构建一种能够在大肠杆菌和多粘类芽孢杆菌之间进行稳定遗传的穿梭载体，可首先在大肠杆菌中完成外源基因克隆工作，从而极大提高了外源基因导入多粘类芽孢杆菌的效率，便于多粘类芽孢杆菌中开展相关遗传操作工作。(三)技术实现要素：本发明目的是提供一种穿梭质粒载体，以解决上述多粘类芽孢杆菌中外源基因导入困难的技术问题。本发明的另一个目的在于提供上述穿梭质粒载体的构建方法。本发明采用的技术方案是：本发明提供一种穿梭质粒载体，所述穿梭质粒载体是将枯草芽孢杆菌(b.subtilis)质粒pwb980线性化后插入到载体pmd19-tsimplevector(核苷酸序列为seqidno.5所示)中构建而成。进一步，所述质粒pwb980包括位于3254～3460的p43启动子位点、位于3616～3702的信号肽编码基因sacb及位于308～1313的rep、位于1472～2243的卡那霉素抗性基因kmr、位于2461～2865的筛选标记博来霉素抗性基因bler。进一步，所述载体pmd19-tsimplevector包括位于873～1461的复制起始ori、位于146～475的lacz基因以及位于1632～2492的筛选标记氨苄青霉素抗性基因ampr。进一步，所述穿梭质粒载体核苷酸序列为seqidno.1所示。本发明所述穿梭质粒载体的构建方法，包括以下步骤：1)以枯草芽孢杆菌中高拷贝质粒pwb980为模板，通过引物p1(核苷酸序列如seqidno.3所示)和p2(核苷酸序列如seqidno.4所示)进行pcr，得到线性化的pwb980质粒(核苷酸序列如seqidno.2所示)，纯化后回收；2)用t4连接酶将纯化回收后的线性化pwb980质粒和载体pmd19-tsimplevector进行连接；3)将连接产物转化至e.colidh5α感受态细胞，挑取转化子，提取质粒，对其进行单、双酶切验证，得到所述的穿梭质粒载体pwbuc01。本发明还提供一种所述穿梭质粒载体在筛选多粘类芽孢杆菌标记抗性基因构中的应用。本发明所述标记抗性基因筛选是将标记抗性基因连入穿梭质粒载体，然后再将载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，最后将阳性转化子转入多粘类芽孢杆菌，获得具有标记抗性基因的多粘类芽孢杆菌。本发明还提供一种所述穿梭质粒载体在多粘类芽孢杆菌基因敲除中的应用。本发明所述基因敲除是将标记抗性基因、待敲除基因的同源序列连入穿梭质粒载体，然后再将载体转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子，最后将阳性转化子转入多粘类芽孢杆菌，获得敲除目标基因的多粘类芽孢杆菌。与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供的穿梭载体质粒可在大肠杆菌和多粘类芽孢杆菌中复制。多粘类芽孢杆菌中遗传操作体系尚不成熟、转化步骤较繁琐，且其转化效率相对较低，而大肠杆菌中基因克隆操作十分便利。利用该质粒载体在大肠杆菌中完成外源基因克隆和重组质粒构建工作，便于多粘类芽胞杆菌中开展相关基因功能研究和遗传育种工作，转化率可达7.83±1.54×105cfu/ugdna。(四)附图说明图1为穿梭质粒载体pwbuc01图谱。图2为穿梭载体pwbuc01构建示意图。图3为质粒pwb980经pcr线性化后的凝胶电泳图。图4为实施例1转化e.colidh5α后提取的穿梭质粒pwbuc01单、双酶切鉴定电泳图。图5为实施例2转化枯草芽孢杆菌wb8000后提取的穿梭质粒pwbuc01的双酶切鉴定电泳图。图6为实施例2转化多粘类芽孢杆菌atcc842后提取的穿梭质粒pwbuc01的双酶切鉴定电泳图。图7为cat基因pcr电泳图。图8为cat基因、质粒pwbuc01双酶切电泳图。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pwbuc01的构建张文娣等(张文娣，丁延芹，姚良同等,多粘类芽孢杆菌sc2基因敲除体系的建立[j].微生物学报.2013,53(12):1258-1266.)报道b.subtilis的质粒可在p.polymyxa中复制表达，因此取b.subtilis质粒pht43、pwb980、pnnb194对p.polymyxaatcc842的适用性进行了尝试(表1)，结果发现只有质粒pwb980可在p.polymyxaatcc842中复制表达，转化效率为8.58±1.43×106(cfu/μgdna)，因此选择pwb980作为插入片段。表1b.subtilis质粒在p.polymyxa中复制表达情况pmd19-tsimplevector是一种高效克隆pcr(tacloning)的专用载体，它消除了puc19载体上的多克隆酶切位点，因此，构建好的穿梭质粒载体将不会受到t载体上其它多克隆酶切位点上的限制酶影响，可以大大提高酶切效率。穿梭载体pwbuc01构建过程如图2所示，包括以下步骤：1、质粒pwb980的提取挑取枯草芽孢杆菌(bacillussubtiliswb800，参见functionalproductionandcharacterizationofafibrin-specificsingle-chainantibodyfragmentfrombacillussubtilis:effectsofmolecularchaperonesandawall-boundproteaseonantibodyfragmentproduction)wb800单菌落，接种于5ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃培养12h。菌液用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒(上海生工)提质粒pwb980，-20℃储存待用。2、质粒pwb980线性化以质粒pwb980为模板，通过设定引物(p1和p2)进行pcr，使环状质粒pwb980线性化。p1:atcctctagagtcgacctgcag(seqidno.3)p2:ctgcaggtcgactctagaggat(seqidno.4)表2pcr的具体条件easytaqdnapolymerasebuffer5μldntps5μl引物p12.5μl引物p22.5μl模板(质粒pwb980)2μleasytaqdnapolymerase0.5μlddh2o32.5μltotal50μl反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃4.5min，30循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr扩增后的产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图3所示。电泳结果在理论值大小位置出现了单一的特异性条带，用dnafragmentpurificationkit(sangonbiotechco.,ltd)对其进行纯化回收。3、大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pwbuc01的构建将步骤2中线性化质粒pwb980和载体pmd19-tsimplevector(购自takara公司)进行连接，反应体系为：表316℃过夜连接，取2.5μl连接产物转化50μle.colidh5α感受态细胞，取100μl菌液涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板进行蓝白斑筛选。挑取阳性转化子，转入5ml含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基，37℃培养12h-18h，用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒(sangonbiotechco.,ltd)提取质粒，获得大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pwbuc01，即穿梭质粒载体pwbuc01。通过hindiii和ecori(neb)进行单、双酶切验证(如图4)，确定重组质粒后进行测序分析(华大基因)。序列分析结果如seqidno.1，绘制载体图谱如图1所示。其中，线性化质粒pwb980及pmd19-tsimplevector的摩尔浓度比控制在1:3到1:10。实施例2大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭质粒载体pwbuc01的应用1、大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pwbuc01转化枯草芽孢杆菌wb800将实施例1构建得到的穿梭载体pwbuc01转化枯草芽孢杆菌wb800，具体的，包括以下步骤：a、枯草芽孢杆菌wb800感受态的制备1)、挑取新鲜的枯草芽胞杆菌wb800单菌落接种于5mllb液体试管中，37℃，200r/min培养过夜。2)、菌液按5％(v/v)接种量接入50ml含0.5mol/l山梨醇的lb液体培养基中，37℃，200r/min培养至od600为2左右，取全部菌液冰浴30min，5000r/min，4℃离心6min，收集菌体。3)、用10ml预冷的solutiona(0.5mol/l山梨醇，0.5mol/l的甘露醇，10％甘油，溶于去离子水中)重悬菌体，5000r/min，4℃离心8min，去上清(尽量除尽上清)，如此漂洗3次。4)、30ml预冷的solutionb(0.5mol/l海藻糖，0.5mol/l山梨醇，0.5mol/l甘露醇，10％甘油，溶于去离子水中)洗涤菌体一次，8000r/min，4℃离心5min，去上清(尽量除尽上清)。5)、500μlsolutionb悬浮菌体，即为枯草芽孢杆菌wb800电转感受态细胞，分装成50μl每管，-80℃保存，待用。b、穿梭质粒载体pwbuc01转化枯草芽胞杆菌wb800感受态细胞1)、电转化：将2μl实施例1制备的穿梭质粒载体pwbuc01与步骤a制备的50μl枯草芽孢杆菌wb800电转感受态细胞轻柔混合，冰浴30min，将混合物转入预冷的1mm电击杯中，2000v电击一次，之后迅速加入1ml预冷的复苏液(含0.5mol/l山梨醇和0.38mol/l甘露醇的lb液体培养基)，37℃，200r/min培养3h。2)、取100μl菌液涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基上，37℃培养12h。3)、挑取阳性转化子，转入5ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，37℃培养12h，用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取质粒，通过hindiii和ecori进行双酶切验证(如图5)，结果证明的确是质粒pwbuc01。说明构建的大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pwbuc01能够在枯草芽孢杆菌wb800中复制表达。2、大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pwbuc01转化多粘类芽孢杆菌atcc842将实施例1构建得到的穿梭质粒载体pwbuc01转化多粘类芽孢杆菌atcc842，具体的，包括以下步骤：a、多粘类芽孢杆菌atcc842感受态的制备1)、挑取新鲜的多粘类芽孢杆菌atcc842(p.polymyxaatcc842菌种保藏号：bucsav162,ccm1459,ncib8158,nctc10343,nrs1105，reclassificationofpaenibacillusdurum(formerlyclostridiumdurumsmithandcat01974)collinsetal.1994asamemberofthespeciesp.azotojixans(formerlybacillusazotojixaseldinetal.1984)ashetal.1994)单菌落接种于5mllb液体试管中，37℃，200r/min培养过夜。2)、菌液按4％(v/v)接种量接入50ml含0.5mol/l山梨醇的lb液体培养基中，37℃，200r/min培养至od600为0.5左右，取全部菌液冰浴10min，5000r/min，4℃离心5min，收集菌体。3)、100ml预冷的solutiona(0.5mol/l山梨醇，0.5mol/l的甘露醇，10％甘油，溶于去离子水中)重悬菌体3次，5000r/min，4℃离心8min，去上清(尽量除尽上清)。4)、30ml预冷的solutionb(0.5mol/l海藻糖，0.5mol/l山梨醇，0.5mol/l甘露醇，10％甘油，溶于去离子水中)洗涤菌体一次，8000r/min，4℃离心5min，去上清(尽量除尽上清)。5)、1mlsolutionb悬浮菌体，获得多粘类芽孢杆菌atcc842感受态细胞，分装成50μl每管，-80℃保存，待用。b、穿梭质粒载体pwbuc01转化多粘类芽孢杆菌atcc842感受态细胞1)、电转化：将2μl实施例1制备的穿梭质粒载体pwbuc01与50μl多粘类芽孢杆菌atcc842感受态细胞轻柔混合，冰浴30min，将混合物转入预冷的1mm电击杯中，2000v电击一次，之后迅速加入1ml预冷的复苏液(含0.5mol/l山梨醇和0.38mol/l甘露醇的lb液体培养基)中，37℃，200r/min培养4h。2)、取100μl菌液涂布于含有50μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基上，37℃培养24h。3)、挑取阳性转化子，转入5ml含50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基，37℃培养24h，用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取质粒，通过hindiii和ecori进行双酶切验证(如图6)，结果证明的确是质粒pwbuc01。说明构建的大肠杆菌－多粘类芽孢杆菌穿梭载体pwbuc01能够在多粘类芽孢杆菌atcc842中复制表达。3.利用上述实施例1制备的穿梭质粒载体pwbuc01进行外源基因在多粘类芽孢杆菌中的表达将实施例1构建得到的穿梭质粒载体pwbuc01连接外源基因，并在多粘类芽孢杆菌atcc842中表达，具体的，包括以下步骤：1)、以cat-f和cat-r为引物，其核苷酸序列依次如seqidno.6和seqidno.7，以枯草芽孢杆菌wb800基因组dna为模板，pcr扩增枯草芽孢杆菌wb800中氯霉素抗性基因cat，其核苷酸序列如seqidno.8所示。表4pcr的具体条件为：easytaqdnapolymerasebuffer5μldntps5μl引物cat-f2.5μl引物cat-r2.5μl模板(枯草芽孢杆菌wb800基因组dna)2μleasytaqdnapolymerase0.5μlddh2o32.5μltotal50μl反应程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃4.5min，30循环；72℃延伸10min；4℃保存。pcr扩增后的产物通过琼脂糖凝胶电泳鉴定，如附图7所示。2)、用dnafragmentpurificationkit(takara)对cat基因pcr产物进行纯化回收。3)、用bamhi和xbai对cat基因纯化产物和实施例1制备的穿梭质粒载体pwbuc01进行双酶切，酶切体系为：表5bamhi1μlxbai1μlbuffer5μldna1μlddh2o42μltotal50μl4)、酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如图8所示，用easypurequickgelextractionkit(tran)对其进行切胶回收。5)、将回收后的cat基因和质粒pwbuc01进行连接，16℃过夜，反应体系为:表6t4dna连接酶buffer1μl片段：cat2μl载体：pwbuc016μlt4dna连接酶(neb)1μltotal10μl6)、取10μl连接液，加入到100μl感受态细胞trans110(transgenbiotech)中，轻弹管壁数下混匀，冰上放置30min；42℃热激90s，冰浴2min；加900μllb，37℃，200rpm，摇菌1h；取100μl菌液涂布含有100μg/ml氨苄青霉素的lb平板，37℃过夜培养。7)、随机挑取转化子进行菌落pcr后验证为阳性转化子，进行测序分析(华大基因)。序列分析结果如seqidno.9所示，质粒命名为pwbuc01-cat。8)、用sanprep柱式质粒dna小量抽提试剂盒提取质粒pwbuc01-cat，用实施例2步骤1中方法转化多粘类芽孢杆菌p.polymyxaatcc842，取100μl菌液涂布含有5μg/ml氯霉素的lb平板，37℃过夜培养。9)、挑取转化子菌落pcr后验证其为阳性转化子。以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>浙江工业大学<120>一种穿梭质粒载体及其构建方法和应用<160>9<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>6525<212>dna<213>未知(unknown)<400>1tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtca60cagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtg120ttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgc180accatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgcc240attcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctat300tacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggt360tttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattagaactcggtacgcgcggat420cttccagagattatcctctagagtcgacctgcagatcctctagagtcgacctgcaggcat480gcaagctagcttcagcacaattccaagaaaaacacgatttagaacctaaaaagaacgaat540ttgaactaactcataaccgagaggtaaaaaaagaacgaagtcgagatcagggaatgagtt600tataaaataaaaaaagcacctgaaaaggtgtctttttttgatggttttgaacttgttctt660tcttatcttgatacatatagaaataacgtcatttttattttagttgctgaaaggtgcgtt720gaagtgttggtatgtatgtgttttaaagtattgaaaacccttaaaattggttgcacagaa780aaaccccatctgttaaagttataagtgactaaacaaataactaaatagatgggggtttct840tttaatattatgtgtcctaatagtagcatttattcagatgaaaaatcaagggttttagtg900gacaagacaaaaagtggaaaagtgagaccatggagagaaaagaaaatcgctaatgttgat960tactttgaacttctgcatattcttgaatttaaaaaggctgaaagagtaaaagattgtgct1020gaaatattagagtataaacaaaatcgtgaaacaggcgaaagaaagttgtatcgagtgtgg1080ttttgtaaatccaggctttgtccaatgtgcaactggaggagagcaatgaaacatggcatt1140cagtcacaaaaggttgttgctgaagttattaaacaaaagccaacagttcgttggttgttt1200ctcacattaacagttaaaaatgtttatgatggcgaagaattaaataagagtttgtcagat1260atggctcaaggatttcgccgaatgatgcaatataaaaaaattaataaaaatcttgttggt1320tttatgcgtgcaacggaagtgacaataaataataaagataattcttataatcagcacatg1380catgtattggtatgtgtggaaccaacttattttaagaatacagaaaactacgtgaatcaa1440aaacaatggattcaattttggaaaaaggcaatgaaattagactatgatccaaatgtaaaa1500gttcaaatgattcgaccgaaaaataaatataaatcggatatacaatcggcaattgacgaa1560actgcaaaatatcctgtaaaggatacggattttatgaccgatgatgaagaaaagaatttg1620aaacgtttgtctgatttggaggaaggtttacaccgtaaaaggttaatctcctatggtggt1680ttgttaaaagaaatacataaaaaattaaaccttgatgacacagaagaaggcgatttgatt1740catacagatgatgacgaaaaagccgatgaagatggattttctattattgcaatgtggaat1800tgggaacggaaaaattattttattaaagagtagttcaacaaacgggccagtttgttgaag1860attagatgctataattgttattaaaaggattgaaggatgcttaggaagacgagttattaa1920tagctgaataagaacggtgctctccaaatattcttatttagaaaagcaaatctaaaatta1980tctgaaaagggaatgagaatagtgaatggaccaataataatgactagagaagaaagaatg2040aagattgttcatgaaattaaggaacgaatattggataaatatggggatgatgttaaggct2100attggtgtttatggctctcttggtcgtcagactgatgggccctattcggatattgagatg2160atgtgtgtcatgtcaacagaggaagcagagttcagccatgaatggacaaccggtgagtgg2220aaggtggaagtgaattttgatagcgaagagattctactagattatgcatctcaggtggaa2280tcagattggccgcttacacatggtcaatttttctctattttgccgatttatgattcaggt2340ggatacttagagaaagtgtatcaaactgctaaatcggtagaagcccaaacgttccacgat2400gcgatttgtgcccttatcgtagaagagctgtttgaatatgcaggcaaatggcgtaatatt2460cgtgtgcaaggaccgacaacatttctaccatccttgactgtacaggtagcaatggcaggt2520gccatgttgattggtctgcatcat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