一种双荧光报告重组质粒载体及其构建方法和应用与流程

本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种双荧光报告重组质粒载体及其构建方法和用于验证mirna是否结合其特异靶基因的3’非翻译区的应用。
背景技术：
：microrna(mirna)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链rna分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。每个mirna可以有多个靶基因，而几个mirna也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个mirna来调控多个基因的表达，也可以通过几个mirna的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，mirna调节着人类三分之一的基因。从本世纪初，科学家开始认识到这些普遍存在的小分子在真核基因表达调控中有着广泛的作用。在线虫，果蝇，小鼠和人等物种中已经发现的数百个mirna中的多数具有和其他参与调控基因表达的分子一样的特征——在不同组织、不同发育阶段中mirna的水平有显著差异，这种mirna表达模式具有分化的位相性和时序性，由于mirna存在的广泛性和多样性，提示mirna可能有非常广泛多样的生物功能。尽管对mirna的研究还处于初级阶段，据推测mirna在高级真核生物体内对基因表达的调控作用可能和转录因子一样重要。有一种看法是：mirna可能代表在一个新发现的层次上的基因表达调控方式。然而，大多数mirna的靶基因及功能仍旧未知。因此，明确mirna的靶基因并验证其参与调控基因表达的分子基础具有重要意义。采用荧光表达系统定量基因表达时，通常使用第二个报告基因作为内参来减少实验的变化因素。但传统的共报告基因比如氯霉素乙酰转移酶(cat)，β-半乳糖苷酶(β-gal)或葡萄醛酸糖苷酶(gus)不够便利，因为各自的测试处理要求、检测特点存在差异。近年使用较多的萤火虫荧光素酶避免了上述缺点，但是由于荧光素酶底物价格昂贵，需使用特殊仪器检测荧光素酶表达等因素限制了其使用范围。技术实现要素：针对上述现有技术存在的缺陷或不足，本发明的一个目的在于，提供一种含有双报告基因的重组质粒载体及其构建方法，本发明的另一个目的在于，将构建的含有双报告基因的重组质粒载体用于验证mirna及其靶基因之间的关系，以便实现mirna与靶序列的快速检测。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：一种双荧光报告重组质粒载体，其特征在于，含有编码的绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白基因序列和mirna特异靶基因的3’非翻译区序列。根据本发明，所述编码的绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因在双向的转录响应原件启动子(transcriptionalresponseelement，tre)的控制下表达。所述编码的绿色荧光蛋白基因序列、红色荧光蛋白基因序列以及mirna特异靶基因的3’非翻译区序列被放置在两个表达读码框内，所述编码的绿色荧光蛋白基因的表达读码框包含双向转录响应原件启动子、绿色荧光蛋白、和mirna特异靶基因3’非翻译区序列下游的第一polya加尾信号；所述编码的红色荧光蛋白基因的表达读码框包含双向转录响应原件启动子、红色荧光蛋白、和mirna特异靶基因3’非翻译区序列下游的第二polya加尾信号。进一步地，所述的双向转录响应原件启动子的激活受强力霉素的调控。上述双荧光报告重组质粒载体的构建方法，其特征在于，依次按以下步骤进行：(1)用pcr方法扩增绿色荧光蛋白基因；(2)将步骤(1)扩增的绿色荧光蛋白基因片段插入到质粒载体ptre3g-bi启动子的3’方向上，获得重组质粒载体ptre3g-gfp，并进行测序分析，将验证正确后的重组质粒载体用于下一步的连接；(3)用pcr方法扩增红色荧光蛋白基因；(4)将步骤(3)扩增的红色荧光蛋白基因片段插入到质粒载体ptre3g-gfp启动子的5’方向上，获得重组质粒载体ptre3g-gfp-mcherry，并进行测序分析，将验证正确后的重组质粒载体用于下一步的连接；(5)用pcr方法扩增mirna特异靶基因的3’非翻译区序列插入到质粒载体ptre3g-gfp-mcherry的mcherry3’方向上，将验证正确后的重组质粒载体命名为ptre3g-gfp-mcherry-3utr。根据申请人的实验表明，上述双荧光报告重组质粒载体可以用于验证mirna是否结合其特异靶基因的3’非翻译区的应用。将重组质粒载体ptre3g-gfp-mcherry-3utr转染人胚肾细胞hek293，同时转染合成的mirna于hek293细胞中。将所述转染细胞在37℃培养24小时后于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下可清楚地显示出编码绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达水平。由于编码绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白均由同一个双向转录响应原件启动子(tre)所控制，因此在对照组中编码绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的表达水平是相同的。而在加入测试mirna的实验组，由于mirna会结合红色荧光蛋白3’非翻译区的靶序列，阻遏了红色荧光蛋白的翻译，因此在荧光显微镜下将观察到红色荧光蛋白的表达水平远低于绿色荧光蛋白，从而验证了mirna的靶序列的特异性。通过实验证实，本发明构建的双荧光报告重组质粒载体可以用于验证任意的mirna与其靶序列之间的关系。本发明构建的双荧光报告重组质粒载体，具有以下有益效果：1、由于双荧光报告重组质粒载体含有绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白，当用转染方法将重组质粒载体和任意mirna导入人胚肾细胞hek293后，如果mirna特异性的靶向3’非翻译区的序列，将会降低红色荧光蛋白的表达；如果转染的mirna不靶向所构建的3’非翻译区序列，红色荧光蛋白的表达水平将不会降低。同时编码绿色荧光蛋白作为内参，其表达水平与mirna是否靶向3’非翻译区序列无关。因此该重组质粒载体可以方便快捷的在荧光显微镜下检测mirna与其预测的靶序列之间的关系。2、由于双荧光报告重组质粒载体中，编码的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的基因均在双向转录响应原件启动子的控制下表达，且编码序列被放置在两个表达读码框内，因而能独立表达各自的蛋白产物，同时编码的红色荧光蛋白的表达框在不受mirna影响的情况下，其表达水平与编码的绿色荧光蛋白的表达水平是高度一致的。同时编码的红色荧光蛋白与绿色荧光蛋白的表达框构建在同一个重组质粒载体内，避免了由于转染效率不同而引起的误差。3、由于双荧光报告重组质粒载体使用了荧光蛋白作为报告基因，可以直接在荧光显微镜下进行观察。与荧光素酶报告系统相比，不需要加入底物参与反应，同时不需要其它定制的仪器来检测荧光素酶的表达，因而该重组质粒检测系统降低了对该类实验的仪器要求以及实验成本。4、由于双荧光报告重组质粒载体使用了双向转录响应原件启动子，该启动子的激活需要四环素诱导表达系统及强力霉素的参与，因此对mirna及其靶序列之间的互作关系的检测可以根据实验时间的需要而开展，增强了实验的可操控性。同时，强力霉素由于低廉的价格已被广泛的使用，而且强力霉素的安全性也已被大量的实验所验证，降低了对实验的影响。附图说明图1是本发明重组质粒载体ptre3g-gfp-mcherry-3utr的结构示意图；图2是原始质粒载体ptre3g-bi的结构示意图；图3是绿色荧光蛋白(gfp)的pcr产物的1％琼脂糖凝胶电泳图，图中的标记m为1kbplusdnaladder；标记1为绿色荧光蛋白基因(gfp)。图4是琼脂糖凝胶电泳sali和bglii酶切鉴定重组质粒载体ptre3g-gfp的结果图，图中的标记m为1kbplusdnaladder；标记1为含有绿色荧光蛋白基因(gfp)的阳性克隆。图5是红色荧光蛋白(mcherry)的pcr产物的1％琼脂糖凝胶电泳图，图中的标记m为1kbplusdnaladder；标记1为红色荧光蛋白基因(mcherry)。图6是琼脂糖凝胶电泳ecori和xbai酶切鉴定重组质粒载体ptre3g-gfp-mcherry的结果图，图中的标记m为1kbplusdnaladder；标记1为含有红色荧光蛋白基因(mcherry)的阳性克隆。图7是ccl73’utr序列的pcr产物的1％琼脂糖凝胶电泳图，图中的标记m为1kbplusdnaladder；标记1为ccl73’utr序列。图8是琼脂糖凝胶电泳bamhi和noti酶切鉴定重组质粒载体ptre3g-gfp-mcherry-3utr的结果图，图中的标记m为1kbplusdnaladder；标记1为含有ccl73’utr序列的阳性克隆。图9是用本发明的双荧光报告重组质粒载体ptre3g-gfp-mcherry-3utr转染人胚肾293细胞，同时加入pcmv-tet3g,强力霉素，mir-23bmimic或对照mirnamimic，观察转染18小时后荧光显微镜观测到的荧光表达情况图，标尺＝100μm。以下结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。具体实施方式在以下的实施例中，发明人给出一种双荧光报告重组质粒载体，含有编码的绿色荧光蛋白基因序列和红色荧光蛋白基因序列和mirna特异靶基因的3’非翻译区序列。其中，编码的绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因均是在双向转录响应原件启动子(transcriptionalresponseelement，tre)的控制下表达。上述编码的绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因序列以及靶基因3’非翻译区序列被放置在两个表达读码框内，所述编码的绿色荧光蛋白基因的表达读码框包含双向转录响应原件启动子、绿色荧光蛋白、和mirna特异靶基因3’非翻译区序列下游的第一polya加尾信号；所述编码的红色荧光蛋白基因的表达读码框包含双向转录响应原件启动子、红色荧光蛋白、和mirna特异靶基因3’非翻译区下游的第二polya加尾信号。上述双荧光报告重组质粒载体，其双向转录响应原件启动子的激活受四环素诱导表达系统及强力霉素的调控。上述双荧光报告重组质粒载体的构建方法，依次按为以下步骤进行：(1)用pcr方法扩增绿色荧光蛋白基因；(2)将步骤(1)扩增的绿色荧光蛋白基因片段插入到质粒载体ptre3g-bi启动子的3’方向上，获得重组质粒载体ptre3g-gfp，并进行测序分析，将验证正确后的重组质粒载体用于下一步的连接；(3)用pcr方法扩增红色荧光蛋白基因；(4)将步骤(3)扩增的红色荧光蛋白基因片段插入到质粒载体ptre3g-gfp启动子的5’方向上，获得重组质粒载体ptre3g-gfp-mcherry，并进行测序分析，将验证正确后的重组质粒载体用于下一步的连接；(5)用pcr方法扩增靶基因的3’非翻译区序列插入到质粒载体ptre3g-gfp-mcherry的mcherry3’方向上，将验证正确后的重组质粒载体命名为ptre3g-gfp-mcherry-3utr(图1)。所构建的双荧光报告重组质粒载体用于实验系统中的相关检测，红色荧光报告基因作为内参对照，使另一个报告基因的检测均一化。检测mirna结合靶序列活性时双报告基因系统通常用来瞬时转染培养细胞。红色荧光报告基因表达活力的相对改变与mirna及其靶基因3’非翻译区结合活力的改变正相关，插入到双向转录响应原件启动子的绿色荧光报告基因，提供转染效率及转录活力的内参对照，使测试不被外界实验条件变化所干扰。通过这种方法，可减少内在的变化因素所削弱的实验准确性，比如细胞转染的效率，培养细胞的活力和数目的差别等。以下是具体的操作实例。实施例1：重组质粒载体的构建1、材料和方法1.1目的基因、载体质粒、细胞绿色荧光蛋白(gfp)的原始质粒：购自addgene，usa；红色荧光蛋白(mcherry)的原始质粒：购自clontech，usa；穿梭质粒载体ptre3g-bi：购自clontech，usa(图2)；化学感受态细胞dh5α菌株：购自天根生化科技有限公司；人胚肾细胞系hek293细胞：购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心。1.2试剂所用限制性内切酶，t4dnaligase均购自thermofisherscientific，usa。primerstarpolymerase购自clontech，usa；质粒小/中量提取纯化试剂盒、dna纯化试剂盒、dna凝胶回收与纯化试剂盒均购自天根生化科技有限公司；1kbdnaladder购自鼎国生物公司；dmem、胎牛血清、胰酶购自thermofisherscientific，usa。1.3仪器pcr扩增仪：appliedbiosystems公司；电泳仪：bio-rad公司；台式多功能高速低温离心机和二氧化碳培养箱thermofisherscientific公司；倒置荧光显微镜：leica公司。1.4引物设计与引物合成以genbank中已发表的绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白的cdna序列为模板，各设计两条扩增引物，引物序列如下：gfpsalif:actgtcgacatggagagcgacgagagcgggfpbgliir:cttatagctttagcgagatccggtggagcmcherryecorif:actgaattcatggtgagcaagggcgaggamcherryxbair:ctttctagatggacgagctgtacaagtaamccl73'utrbamhif:actggatcctgcctgaacagaaaccaaccmccl73'utrnotir:cttgcggccgctgattcttgcaaagtcccttca1.5pcr扩增绿色荧光蛋白以绿色荧光蛋白的原始质粒为模板，用primerstar扩增绿色荧光蛋白基因片段。在ep管中依次加入以下反应物：0.5μl的绿色荧光蛋白原始质粒，10xbuffer，1μmgfpsalif引物，1μmgfpbgliir引物，0.5μlpolymerase，4μldntp，加ddh2o至50μl反应体系中进行反应。反应条件：95℃、5min；95℃、30s；55℃、30s；72℃、1min；29个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应。将pcr扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳进行结果检测，用dna胶回收纯化试剂盒回收gfp条带。获得759的片段，与预期大小一致，见图3。1.6连接上述pcr回收产物至质粒载体ptre3g-bi上将上述pcr回收片段和质粒载体ptre3g-bi用sali和bglii酶切处理，然后用t4dna连接酶进行连接，连接产物转化至化学感受态细胞dh10b菌株中，涂布到氨苄抗性固体培养基平皿，挑取若干单克隆菌落，接种到氨苄抗性液体培养基中，恒温摇床37℃、250rpm振荡培养过夜。小提质粒(天根质粒小量提取纯化试剂盒)，得到重组质粒载体ptre3g-bi-gfp。1.7重组质粒载体ptre3g-bi-gfp的鉴定用sali和bglii酶切进行鉴定，酶切鉴定体系及反应条件如下表：重组质粒dna5μl10×buffer2μlsali0.5μlbglii0.5μlddh2o11μl总体积20μl37℃15min经酶切鉴定，获得产物与预期分析大小一致，见图4。选取酶切验证正确的阳性克隆进行测序分析，结果经finchtv解析及blast软件比对，以验证重组质粒载体的正确性。分析结果表明，gfp核苷酸序列完全正确，成功获得了重组质粒载体ptre3g-bi-gfp。1.8pcr扩增红色荧光蛋白以红色荧光蛋白的原始质粒为模板，用primerstar扩增红色荧光蛋白基因片段。在ep管中依次加入以下反应物：0.5μl的红色荧光蛋白(mcherry)原始质粒质粒，10xbuffer，1μmmcherryecorif引物，1μmmcherryxbair引物，0.5μlpolymerase，4μldntp，加ddh2o至50μl反应体系中进行反应。反应条件：95℃、5min；95℃、30s；55℃、30s；72℃、1min；29个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应。将pcr扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳进行结果检测，用dna胶回收纯化试剂盒回收gfp条带。获得711bp的片段，与预期大小一致，见图5。1.9连接上述pcr回收产物至质粒载体ptre3g-bi-gfp上将上述pcr回收片段和质粒载体ptre3g-bi-gfp用ecori和xbai酶切处理，然后用t4dna连接酶进行连接，连接产物转化至化学感受态细胞dh10b菌株中，涂布到氨苄抗性固体培养基平皿，挑取若干单克隆菌落，接种到氨苄抗性液体培养基中，恒温摇床37℃、250rpm振荡培养过夜。小提质粒(天根质粒小量提取纯化试剂盒)，得到重组质粒载体ptre3g-bi-gfp-mcherry。1.10重组质粒载体ptre3g-bi-gfp-mcherry的鉴定用ecori和xbai酶切进行鉴定，酶切鉴定体系及反应条件如下表：重组质粒dna5μl10×buffer2μlecori0.5μlxbai0.5μlddh2o11μl总体积20μl37℃15min经酶切鉴定，获得产物与预期分析大小一致，见图6。选取酶切验证正确的阳性克隆进行测序分析，结果经finchtv解析及blast软件比对，以验证重组质粒载体的正确性。分析结果表明，mcherry核苷酸序列完全正确，成功获得了重组质粒载体ptre3g-bi-gfp-mcherry。1.11pcr扩增ccl73’utr以脾组织的cdna为模板，用primerstar扩增ccl7基因的3’utr片段。在ep管中依次加入以下反应物：0.5μl质粒，10xbuffer，1μmmccl73'utrbamhif引物，1μmmccl73'utrnotir1引物，0.5μlpolymerase，4μldntp，加ddh2o至50μl反应体系中进行反应；反应条件：95℃、5min；95℃、30s；55℃、30s；72℃、0.5min；29个循环；72℃延伸10min，4℃终止反应。将pcr扩增产物在1％琼脂糖凝胶中电泳进行结果检测，用dna胶回收纯化试剂盒回收ccl73'utr条带。获得315bp的片段，与预期大小一致，见图7。1.12连接上述pcr回收产物至质粒载体ptre3g-bi-gfp-mcherry上将上述pcr回收片段和质粒载体ptre3g-bi-gfp-mcherry用bamhi和noti酶切处理，然后用t4dna连接酶进行连接，连接产物转化至化学感受态细胞dh10b菌株中，涂布到氨苄抗性固体培养基平皿，挑取若干单克隆菌落，接种到氨苄抗性液体培养基中，恒温摇床37℃、250rpm振荡培养过夜。小提质粒(天根质粒小量提取纯化试剂盒)，得到重组质粒载体ptre3g-bi-gfp-mcherry-3utr。1.13重组质粒载体ptre3g-bi-gfp-mcherry-3utr的鉴定用bamhi和noti酶切进行鉴定，酶切鉴定体系及反应条件如下表：重组质粒dna5μl10×buffer2μlbamhi0.5μlnoti0.5μlddh2o11μl总体积20μl37℃15min经酶切鉴定，获得产物与预期分析大小一致，见图8。选取酶切验证正确的阳性克隆进行测序分析，结果经finchtv解析及blast软件比对，以验证重组质粒载体的正确性。分析结果表明，ccl73'utr核苷酸序列完全正确，成功获得了重组质粒载体ptre3g-bi-gfp-mcherry-3utr。实施例2：重组质粒载体ptre3g-bi-gfp-mcherry-3utr验证mir-23b与其靶基因关系的细胞水平实验2.1仪器倒置荧光显微镜：德国leica公司。2.2实验细胞人胚肾293细胞：美国atcc公司。2.3实验材料及试剂rpmi1640培养液，胎牛血清均购自美国gibco公司，lipofectamine2000购自美国lifetechnologies公司，细胞培养皿购自美国fisherscientific公司。2.4实验质粒ptre3g-bi-gfp-mcherry-3utr根据实施例1构建。pcmv-tet3g购自美国clontechlabratories公司。mir-23bmimic及对照mirnamimic购自锐博生物公司。2.5实验方法于实验前一天培养人胚肾细胞hek293于24孔板中，每孔种入1×104个细胞。培养24小时后，用实施例1构建成功的重组质粒载体ptre3g-bi-gfp-mcherry-3utr，以500ng的量感染hek293细胞，同时加入合成的mir-23bmimic(50nm)或对照mirnamimic以及强力霉素(1.5μg/ml)、lipofectamine2000试剂。细胞培养8小时后更换新鲜培养液，并于24小时～72小时后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白的表达水平，同时每个孔进行随机选取5个区域进行拍照以用于后续数据的分析比对。重组质粒载体ptre3g-bi-gfp-mcherry-3utr在转染hek293细胞12小时后，由于pcmv-tet3g表达的tet3g蛋白与强力霉素共同结合在启动子tre3g上，激活了启动子tre3g，同时启动绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白的表达。因此在对照组中，可通过荧光显微镜在一个细胞中同时观察到红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的表达；而在mir-23b实验组中，由于mir-23b会靶向结合到ccl73’utr序列从而抑制了红色荧光蛋白的翻译，因而通过荧光显微镜在一个细胞中将会观察到绿色荧光蛋白正常表达而红色荧光蛋白的表达强度与对照组相比将明显减弱(图9)。结果表明，在本实验中，绿色荧光作为质粒转染效率的内参可以对红色荧光蛋白的表达强度进行评估；针对不同的mirna设计其靶基因3’utr序列均可快捷的一步将靶序列连入载体进行mirna与靶基因关系的验证；另外该载体的设计可以直接在荧光显微镜下进行观察。与荧光素酶报告系统相比，不需要加入底物参与反应，同时不需要其它定制的仪器来检测荧光素酶的表达，因而该重组质粒检测系统降低了对该类实验的仪器要求以及实验成本。核苷酸或氨基酸序列表<110>陕西师范大学<120>一种双荧光报告重组质粒载体及其构建方法和应用<160><210>1<211>29<212>dna<213>扩增引物gfpsalif<220><400>1actgtcgacatggagagcgacgagagcgg<210>2<211>29<212>dna<213>扩增引物gfpbgliir<220><400>2cttatagctttagcgagatccggtggagc<210>3<211>29<212>dna<213>扩增引物mcherryecorif<220><400>3actgaattcatggtgagcaagggcgagga<210>4<211>29<212>dna<213>扩增引物mcherryxbair<220><400>4ctttctagatggacgagctgtacaagtaa<210>5<211>29<212>dna<213>扩增引物mccl73'utrbamhif<220><400>5actggatcctgcctgaacagaaaccaacc<210>6<211>33<212>dna<213>扩增引物mccl73'utrnotir<220><400>6cttgcggccgctgattcttgcaaagtcccttca当前第1页12