一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法与流程

本发明属于生物技术领域，涉及一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法。

背景技术：

随着世界各国经济水平的发展，脊髓损伤发生率呈现逐年增高的趋势。脊髓损伤是脊柱损伤最严重的并发症，往往会导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍。神经细胞属于终末分化细胞，增殖能力较弱，一旦受到损伤，很难再生。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重创伤，还会对整个社会造成巨大的经济负担，因此，针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大难题。

在哺乳动物中枢神经系统中，存在一种胶质前体细胞，也因其表面表达硫酸软骨素蛋白多糖的特性，故称为NG2细胞。NG2细胞在发育以及成熟的中枢神经系统分布广泛，在特定的生理和病理条件下，可表现出形态的多样性、分化的可塑性以及功能的多样性等特点。我们前期的工作已证实，NG2细胞在一定的诱导条件下可转分化为神经元细胞，同时将诱导的NG2细胞移植到脊髓损伤小鼠体内后，发现病情有明显好转，这为脊髓损伤等神经损伤疾病的临床治疗带来了曙光。

凝血栓蛋白4(thrombospondin 4，TSP4)属于凝血栓蛋白家族，具有多种生物学功能，凝血栓蛋白家族成员是一类介导细胞-细胞、细胞-基质粘着的糖蛋白。Girard等证实TSP4缺陷的胎鼠以及成鼠大脑模型中，其神经元细胞的迁移能力显著削弱。它们与细胞的增殖、迁移、粘着以及连接有着密切的关系，对中枢神经系统损伤也会产生炎症反应。Kim等证明外周神经损伤后，TSP4可导致脊髓突触前过敏和神经病理性疼痛。这些结果提示，TSP4与神经细胞的发生和发展有着密切的关系。目前，TSP4如何调控少突胶质前体细胞(NG2细胞)向神经元细胞分化，促使神经元的再生，尚不清楚。已有研究报道，TSP4在脊髓敏感化、肌腱的形成以及神经病理性疼痛等疾病中扮演着重要的角色，但其在神经分化中的作用目前却鲜有报道。

除我们2012年发现的另一基因NMEI外，目前尚无其它基因用于诱导NG2细胞分化为神经细胞的方法。本发明利用旨在建立一种方法，诱导少突胶质前体细胞-NG2细胞分化为神经细胞，为TSP4蛋白用于脊髓损伤的治疗提供帮助。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的缺陷，即难以在体外让NG2细胞分化为神经细胞，进而将其应用于脊髓损伤的治疗。本发明提供一种实验方法，将TSP4在NG2细胞中过表达后，可有效诱发NG2细胞分化为神经细胞。

其技术方案如下：

一种TSP4促进NG2细胞分化为神经细胞的实验方法，包括以下步骤：

步骤1、细胞培养

NG2细胞培养于含2％胎牛血清DMEM/F12培养基，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，B27 supplement，N2 supplement置于5％CO₂的37℃恒温培养箱；

步骤2、表达质粒pXJ40-myc-TSP4的构建

根据GenBank中TSP4基因的mRNA序列NM_017133.1，并利用DNAMAN 8.0软件设计引物，从大鼠cDNA文库中扩增TSP4基因，将扩增出来的片段连接到pXJ40-myc真核表达载体上，转化TOP10感受态细胞，氨苄霉素抗性LB琼脂板筛选单克隆菌落，摇菌并提取质粒，进行质粒酶切验证及电泳分析，将阳性质粒送苏州金唯智生物科技公司测序；

步骤3、Western印迹检测

加入细胞裂解液将细胞裂解，提取蛋白，采用Bradford方法进行蛋白质定量，加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮5分钟后上样，80V电泳30分钟，再120V电泳50分钟，390mA转膜70分钟，5％脱脂牛奶封闭1小时，一抗4℃过夜，用TBST漂洗3次，每次5分钟，加入相应的二抗孵育1小时，TBST漂洗3次，每次5分钟，Amersham Imager 600仪器进行化学发光，并用ImageJ1.48软件进行灰度分析；

步骤4、免疫荧光

将转染好的NG2细胞加入到铺有细胞玻片的12孔板中，待细胞爬片后进行相应处理：4％多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟。0.1％Triton X-100室温透化10分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟。用3％BSA室温封闭1小时，PBS漂洗3次，每次5分钟。加入一抗MAP2、NF200 4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5分钟，然后加入FITC标记的二抗，孵育2小时，DAPI复染5分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟，90％甘油封片，激光共聚焦显微镜观察拍照；

步骤5、总RNA提取及实时荧光定量PCR

Trizol试剂抽提细胞总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，操作依照说明书进行，以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，检测目的基因的表达，引物序列如下：GAPDH：5’-GGT CGG TGT GAA CGG ATT TG-3’；5’-GCT TCC CAT TCT CAG CCT TGA-3’；NF200：5’-ACC TATACC CGA ATG CCT TCT-3’；5’-AGA AGC ACT TGG TTT TAT TGC AC-3’；NeuN：5’-CAG GCC TCA GAA ACA CAC AA-3’；5’-AGC ACC AGTAGAAAT GGA TGA-3’；Tuj1：5’-TGA CGA GCA TGG CAT AGA CC-3’；5’-TGT TGC CAG CAC CAC TCT GA-3’；NeuroD1：5’-CTT GGC CAA GAA CTA TAT CTG G-3’；5’-GGA GTA GGG ATG CAC CGG GAA-3’。反应体系为：EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，模板cDNA 2μL，双蒸水6.8μL，反应程序：95℃10分钟，95℃15秒，60℃1分钟，共40个循环。基因的相对表达量用2^-ΔΔCt法计算，大鼠GAPDH作为内参基因；

步骤6、统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件进行统计学处理。以均数±标准差表示，各组间观察指标的比较采用单因素方差分析和最小显著差法，检验水准α值取双侧P＜0.05。

进一步，步骤3免疫印迹结果显示，过表达TSP4基因的实验组与对照组相比，TSP4能够促进NG2细胞神经元分化标志蛋白NF200、Tuj1和MAP2的表达；过表达TSP4基因的实验组与对照组相比，TSP4能够促进NG2细胞ERK信号通路的活化，而对p38和AKT信号通路无显著影响；当用U0126阻断ERK信号通路后，NG2细胞的神经元标志蛋白NeuN的表达增加。

进一步，步骤4免疫荧光染色结果显示，过表达TSP4基因的实验组与对照组相比，TSP4能够促进NG2细胞神经元分化标志蛋白NF200和MAP2的表达。

进一步，步骤5荧光定量PCR结果显示，过表达TSP4基因的实验组与对照组相比，TSP4能够促进NG2细胞神经元分化标志基因NeuN、NF200、Tuj1和NeuroD1的表达；当用U0126阻断ERK信号通路后，NG2细胞的神经元标志基因NeuN、NF200、Tuj1和NeuroD1的表达显著增加。

本发明中的实验结果显示，TSP4可通过抑制MAPK/ERK信号通路的活性，进而促进NG2细胞向神经细胞转分化。Western印迹和real-time PCR结果显示，过表达TSP4实验组中，神经元分化标志蛋白NeuN、NF200及Tuj-1表达均上调，同时伴随ERK的磷酸化水平降低。加入ERK信号通路特异性阻断剂后，Western印迹显示神经分化标志蛋白NeuN的表达水平出现上调，real-time PCR结果同时证明加入ERK阻断剂后多个神经分化标志基因的表达水平升高。上述结果提示，TSP4可通过抑制MAPK/ERK信号通路的活性，来促进NG2细胞向神经细胞的分化。本发明为脊髓损伤的临床治疗提供了理论参考。凡利用TSP4的病毒表达载体，TSP4真核细胞表达质粒或直接用TSP4蛋白诱导NG2细胞分化为神经细胞，并用于入神经退化性疾病或脊髓损伤的治疗均受本专利保护。

附图说明

图1为TSP4具有促NG2细胞神经分化的新功能；其中，图1A为转染TSP4(pXJ40-myc/TSP4)2天后Western印迹检测内源性以及myc标签融合的TSP4表达情况，图1B为TSP4过表达后，免疫荧光检测NG2细胞神经标志物NF200及MAP2的表达情况(比例尺：100μm)。

图2为TSP4能够提高神经分化标志物的表达；其中，图2A为Western印迹检测神经元分化标志物NF200、Tuj1和NeuN的表达，以β-actin作为内参，图2B-图2D分别为NeuN、NF200、Tuj1和NeuroD1蛋白质定量分析结果，图2E为实时荧光定量PCR检测神经标志物基因水平的表达，以GAPDH作为内参基因。值取三次重复试验的均数±标准差。*P＜0.05，**P＜0.01和***P＜0.001，与对照相比；

图3为TSP4通过抑制MAPK/ERK的信号通路，而非MAPK/p38和PI3K/AKT信号通路，介导NG2细胞的神经分化；其中，图3A为TSP4能够抑制ERK信号通路的活化，而对PI3K/AKT和MAPK/p38信号通路不产生影响，图3B-图3D分别为定量分析p-ERK、p-AKT和p-p38表达水平的变化。值取三次重复试验的均数±标准差。***P＜0.001，与对照相比。

图4为抑制MAPK/ERK信号通路促进NG2细胞的神经分化，其中，图4A为用不同浓度的ERK信号通路阻断剂U0126处理1天，检测发现20和30μM的U0126处理后，p-ERK的水平显著降低，图4B为ERK信号通路被阻断后，神经标志物NeuN的表达与对照相比显著上调，图4C为定量分析结果U0126处理组较对照组NeuN上调2.5倍，图4D为实时荧光定量PCR检测不同的神经标志物的表达。值取三次重复试验的均数±标准差。*P＜0.05，**P＜0.01，与对照相比。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料和方法

1.1材料

大鼠NG2细胞由本实验室分离培养；DMEM/F12培养基购自HyClone，胎牛血清(FBS)购自Gibco，RIPA细胞裂解、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、青霉素、链霉素、胰蛋白酶均购自上海碧云天生物技术有限公司；TSP4抗体购自R&D system；NeuN、NF200抗体购自EMD Millipore。MAP2、AKT、p-AKT、ERK2、p-ERK1/2、p-38及β-actin抗体均购自CST公司。特异性抑制剂U0126购自Sigma公司。Trizol试剂为TaKaRa产品。逆转录试剂盒以及实时荧光定量PCR试剂盒购自ABM公司。Lipofectamine 2000购自Invitrogen。

1.2细胞培养

NG2细胞培养于含2％胎牛血清DMEM/F12(Dulbecco Modified Eagle Medium，HyClone)培养基，100U/mL青霉素，100ug/mL链霉素，B27supplement(50×，Gibco)，N2 supplement(100×，Gibco)置于5％CO₂的37℃恒温培养箱。

1.3表达质粒pXJ40-myc-TSP4的构建

根据GenBank中TSP4基因的mRNA序列(NM_017133.1)，并利用DNAMAN 8.0软件设计引物，从大鼠cDNA文库中扩增TSP4基因，将扩增出来的片段连接到pXJ40-myc真核表达载体上，转化感受态TOP10，氨苄霉素抗性LB琼脂板筛选单克隆菌落，摇菌并提取质粒，进行质粒酶切验证及电泳分析。将阳性质粒送苏州金唯智生物科技公司测序。

1.4 Western印迹检测

加入RIPA裂解液将细胞裂解，提取蛋白，采用Bradford方法进行蛋白质定量。加入5×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮5分钟后上样，80V电泳30分钟，再120V电泳50分钟，390mA转膜70分钟，5％脱脂牛奶封闭1小时，一抗4℃过夜。用TBST漂洗3次，每次5分钟，加入相应的二抗孵育1小时，TBST漂洗3次，每次5分钟。Amersham Imager 600仪器进行化学发光，并用ImageJ1.48软件(National Institutes of Health，美国)进行灰度分析。

1.5免疫荧光

将转染好的NG2+细胞加入到铺有细胞玻片的12孔板中，待细胞爬片后进行相应处理：4％多聚甲醛固定细胞30分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟。0.1％Triton X-100室温透化10分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟。用3％BSA室温封闭1h，PBS漂洗3次，每次5分钟。加入一抗MAP2(1∶100)、NF200(1∶100)4℃孵育过夜，PBS漂洗3次，每次5分钟。然后加入FITC标记的二抗，孵育2h，DAPI复染5分钟，PBS漂洗3次，每次5分钟，90％甘油封片，激光共聚焦观察拍照。

1.6总RNA提取及实时荧光定量PCR

Trizol试剂抽提细胞总RNA，逆转录试剂盒合成cDNA，操作参照说明书进行。以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR，检测目的基因的表达，引物序列如下：GAPDH：5’-GGT CGG TGT GAA CGG ATT TG-3’；5’-GCT TCC CAT TCT CAG CCT TGA-3’；NF200：5’-ACC TAT ACC CGA ATG CCT TCT-3’；5’-AGA AGC ACT TGG TTT TAT TGC AC-3’；NeuN：5’-CAG GCC TCA GAA ACA CAC AA-3’；5’-AGC ACC AGTAGA AAT GGA TGA-3’；Tuj1：5’-TGA CGA GCA TGG CAT AGA CC-3’；5’-TGT TGC CAG CAC CAC TCT GA-3’；NeuroD1：5’-CTT GGC CAA GAA CTA TAT CTG G-3’；5’-GGA GTA GGG ATG CAC CGG GAA-3’。反应体系为：EvaGreen 2×qPCR MasterMix 10μL，上游引物0.6μL，下游引物0.6μL，模板cDNA2μL，双蒸水6.8μL。反应程序：95℃10分钟，95℃15秒，60℃1分钟，共40个循环。基因的相对表达量用2^-ΔΔCt法计算，大鼠GAPDH作为内参基因。

1.7统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件进行统计学处理。以均数±标准差表示，各组见观察指标的比较采用单因素方差分析和最小显著差法，检验水准α值取双侧P＜0.05。

2结果

2.1 TSP4具有促NG2细胞神经分化的功能

为了解TSP4对NG2细胞神经分化的影响，将携带有myc标签的TSP4表达质粒转染至NG2细胞，用TSP4和myc-标签抗体检测其表达情况，Western印迹证明TSP4在NG2细胞中实现了过表达(图1A)。接着我们发现TSP4过表达的细胞表现出神经细胞样的形态(图1B)。该结果提示TSP4可能在NG2细胞的神经分化起着一定的促进作用。

2.2 TSP4诱导NG2细胞神经标志蛋白的表达

为了探究TSP4对NG2细胞向神经元分化的影响，我们将NG2细胞接种于6孔板中，待细胞融合至90％-95％，Lipofectamine 2000转染细胞，2天后提取总蛋白。Western印迹检测神经元标志蛋白NeuN、NF200和Tuj-1的表达情况。结果显示，与对照组相比，表达TSP4的实验组Tuj-1、NF200和NeuN的蛋白质表达水平显著上调(图2A)。过表达TSP4实验组NeuN的表达水平上调79％(P＜0.01)(图2B)，NF200的表达水平上调261％(P＜0.01)(图2C)，Tuj-1的表达水平上调165％(P＜0.001)(图2D)。

进一步地，我们采用实时荧光定量PCR技术从mRNA水平来验证了TSP4对神经分化标志物的影响。与Western印迹结果一致，NF200、NeuN、Tuj1以及神经分化转录因子NeuroD1的mRNA表达均显著上调(图2E)。上述结果证实，TSP4对NG2细胞的神经分化存在一定的促进作用。

2.3 TSP4通过抑制MAPK/ERK信号通路，而非MAPK/p38和PI3K/AKT信号通路介导NG2细胞的神经分化

已知MAPK/ERK、PI3K/AKT和MAPK/p38信号通路在神经分化和轴突生长中发挥十分重要的作用。为了探究TSP4诱导神经分化表型的潜在机制，我们检测这些信号通路是否受TSP4影响(图3)。免疫印迹结果揭示MAPK/p38和PI3K/AKT信号同路的活性在TSP4过表达时没有受到明显的影响(图3C和D)。与对照组相比，过表达TSP4组MAPK/ERK信号通路的活性则受到明显抑制(图3A和B)。该结果提示，TSP4可能通过抑制MAPK/ERK信号通路的活性来介导NG2的神经分化。

2.4抑制MAPK/ERK信号通路促进NG2细胞的神经分化

通过以上结果我们发现，TSP4可抑制MAPK/ERK信号通路的活性，表明MAPK/ERK信号通路对NG2细胞的神经分化可能起负调控作用。因此我们加入MAPK/ERK信号通路的特异性阻断剂U0126，观察U0126对NG2细胞的神经分化是否产生影响。我们先用不同浓度U0126(0，10，20，30μM)处理细胞24小时，提取总蛋白，结果显示20，30μM的U0126处理后，ERK的活化水平显著降低(图4A)。当用20μM U0126阻断MAPK/ERK信号通路后，神经元标志蛋白NeuN的表达水平上调257％(P＜0.01)(图4B和C)，具有统计学意义。同时实时荧光定量PCR结果也显示，与对照组相比，U0126处理组神经分化基因NF200、NeuN、Tuj1和NeuroD1的mRNA表达水平均显著上调(图4D)。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，凡利用TSP4的病毒表达载体，TSP4真核细胞表达质粒或直接用TSP4蛋白诱导NG2细胞分化为神经细胞，并用于人神经退化性疾病或脊髓损伤的治疗均属本专利的保护范围。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。