一种利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法与流程

本发明涉及基因分型技术领域，具体是一种利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法。

背景技术：

分子标记是指生物个体或则群体在基因组序列上表现的特征性差异。单核苷酸多态性（SNP）和短片段插入和缺失(InDel)是生物基因组上一个或几个碱基差异导致的个体间的多态性的位点，是一类重要的分子标记。SNP被许多人认为是未来最佳的标记选择，具有稳定遗传, 分布广泛，等位基因频率容易估计，具有重要的生物学意义，且适合大规模检测等特点。目前，SNP/InDel标记已经是生物种群鉴定，遗传结构分析，连锁图谱构建，重要性状连锁分析和功能性基因定位的重要工具。随着高通量SNP/InDel基因分型技术的发展，目前无参考基因序列的非模式生物体全基因组SNP标记的开发一般有转录组，全基因组或者简化基因组测序的方法。但是由于基因编码区域只占全基因组的2%左右，上述方法都无法预知或者指定开发的SNP标记的位置，导致全基因组开发的SNP标记大多来自于非基因编码区域。所以，对于有参考基因组序列的物种，科研人员一般利用已知的序列设计SNP芯片。利用随机打断的基因组DNA片段与芯片上的寡聚核苷酸探针杂交，就可以获知对应位点的SNP/InDel基因分型。SNP芯片虽然可以预先设定分子标记的位置，但是由于芯片设计程序复杂，成本过高，难以在实际应用上对不同物种大面积推广。

大黄鱼属石首鱼科，黄鱼属，为暖温性近海中下层集群性洄游鱼类，主要分布于中国和东亚。在中国主要分布于南海、东海和黄海南部，为福建和浙江等沿海地区的重要经济鱼类之一。2014年大黄鱼的国内产量约为12吨，为我国最大的海水养殖鱼类，具有巨大的经济价值。但是国内超高密度养殖，以及多代未加选育的人工繁殖，导致大黄鱼生长速度变慢，口感变差，脂肪含量过高，严重影响了大黄鱼养殖产业的健康发展。为了对大黄鱼的重要经济性状进行人工选育，我们首先必须获得大量的大黄鱼全基因组的SNP分子标记。随着近些年大黄鱼基因组序列的破译和相关重要经济性状显著相关的分子标记的研究，需要在全基因特定位置的SNP/InDel位点进行大规模的基因分型。但是基因芯片的设计复杂且成本昂贵，难以应用到大黄鱼特定位点SNP/InDel高通量分型领域，急需一种可以低成本的获得大黄鱼特定基因组片段进行可靠基因分型的技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用液相捕获进行大黄鱼基因组基因分型的方法，包括以下步骤：

1）对大黄鱼进行全基因组重测序，并进行大黄鱼全基因组SNP/InDel挖掘，提供高质量的SNP标记位点；

2）筛选利用大黄鱼的全基因组重测序挖掘到的SNP标记，用于设计探针；

3）利用大黄鱼的全基因组构建大黄鱼基因组文库；

4）利用液相捕获大黄鱼基因组片段；

5）对捕获大黄鱼基因组片段进行高通量测序与SNP/InDel基因分型。

作为本发明进一步的方案：所述步骤1）中，充分利用大黄鱼多个个体混合基因组重测序数据，使用SOAPaligner将测序读段比对到大黄鱼参考基因组序列上。使用SOAPsnp软件进行全基因组的SNP挖掘，只保留高质量的SNP位点用于后续分析（质量值≥20和深度≥10）；

作为本发明进一步的方案：所述步骤2）中SNP标记位点进行筛选大黄鱼的SNP捕获位点，筛选的原则是：（1）尽量保证标记在全基因组均匀分布；（2）筛选SNP标记前后100bp没有其他的SNP标记干扰；（3）筛选的SNP有一半来自于蛋白编码基因和miRNA，另一半来自于全基因组非编码区；（4）保证每个基因都能捕获其中的一个外显子。以每个SNP位点为中心，在其四周设计4条相互重叠的探针，最大限度地保证捕获到的序列能够覆盖SNP位点。探针设计示意图见图1。合成SNP单链捕获探针，并在探针上结合生物素标记，构建大黄鱼基因组SNP液相捕获系统。

作为本发明进一步的方案：步骤3）中，大黄鱼基因组文库构建：采用超声波打断的方法，对大黄鱼的全基因组进行片段化，并通过末端补平，加adaptor等步骤，获得大黄鱼基因组文库。利用Nanodrop 2000或Qubit对大黄鱼基因组文库的质量进行检测。

作为本发明进一步的方案：所述步骤4）中将含有生物素的探针和链霉亲和素覆盖的磁珠混合，通过探针上的生物素和streptavidin（链霉亲和素）的结合被吸附到磁珠上；通过洗脱处理就能将非目标区域的DNA片段洗掉，从而富集要求的大黄鱼基因组片段。

作为本发明进一步的方案：所述步骤5）中捕获的大黄鱼基因组片段加上测序接头和样本特异标签后，利用PCR进行片段扩增；扩增产物利用高通量测序平台进行测序；测序数据通过SOAPaligner和SOAPsnp软件处理后得到个体特定位点的SNP/InDel基因分型。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明的提供了一种利用全基因组SNP捕获系统对大黄鱼全基因组SNP标记进行捕获分型的技术。探针设计的时候考虑到了捕获的SNP标记在全基因组的分布情况，而且捕获探针各设计了2.5万个标记来自于基因或者miRNA转录区域和非编码区，有效地避免了全基因简化基因组分型技术可能导致的标记密度不均匀和大部分来自非编码区标记的问题。同时，本发明对每个SNP标记取前后各100bp，设计4条探针，有效的提高了每个SNP所在序列的杂交的特异性，提高了片段捕获的效率。本发明理论上可以对任何特定的SNP标记设计捕获探针，因而本发明在大黄鱼特定标记的SNP大规模分型上具有重要的应用，为大黄鱼的遗传多样性分析、品系鉴定、标记辅助选育研究和应用提供了高效的基因组分型技术。

附图说明

图1是本发明基因组片段SNP位点捕获探针设计示意图。

图2是本发明中SNP捕获与测序流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本发明实施例中，一种用于大黄鱼全基因组基因分型的液相捕获方法：

1.利用大黄鱼重测序数据

鉴于上述用于基因组测序的个体是高度纯合的个体，杂合位点/SNP位点很少，因此，于2012年9月从不同养殖群体中挑选了100尾大黄鱼（雌雄各50尾），通过构建300bp的小片段文库进行了基因组重测序。该2组重测序共获得raw data 20Gb，平均测序深度达到了26.8。

2.确定捕获位点，探针设计

将测序结果比对到上述基因组草图上进行SNP标记挖掘。共获得测序深度大于5X的SNP位点12161573个，外显子上505286个，内含子上4949058个，基因间5135488个。根据外显子上的捕获位点2.5万个、非基因区捕获位点2.5万个，以及所有捕获位点尽可能在基因组中均匀分布（覆盖尽可能多的Scaffold）的设计原则，挑选5万个目标位点设计了捕获探针。

3.大黄鱼样本获得与基因组DNA提取

选取以上大黄鱼家系中个体存活数最多的LG家系，选取其中52个样本及其亲本的鳍条进行基因组DNA的提取。提取方法为上海捷瑞生物工程有限公司的（GK0122型）细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）。具体方法如下：

1）切取5~20mg的鳍条组织至1.5ml离心管中，利用小手术剪刀尽量剪碎。

2）然后加入400μl ACL Solution和10μl的Proteinase K。

3）震荡混均1分钟，然后置于55℃放置20分钟~3小时，在此期间间或取出混匀，有助于充分裂解。裂解完全的样品应澄清透明。取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀。

4）样品管中加入300μl Ext solution和300μl AB solution,用力摇匀，然后12000rpm离心15分钟。溶解将分层，上层为蓝色的抽提层，下层为透明水层，两层溶液中间可能会有部分沉淀层，DNA在下层水相中。

5）将枪头穿过上层溶液，深入到下层溶液，将下层溶液仔细吸收到GenClean Column中，尽量避免吸收到上层溶液及中间层的沉淀。

6）8000离心1分钟，取下GenClean Column，倒掉收集管中废液。

7）将GenClean Column放回收集管中，加入500μl Wash Solution，8000rpm，室温离心1分钟。

8）重复步骤7）一次。

9）取下GenClean 柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，12000rpm，室温离心1分钟，以除去残留Wash Solution。

10）将柱放入新的洁净1.5ml离心管中，在柱中央加入50~100μl Elution Buffer，室温或55℃放置2分钟。然后12000rpm，室温离心1分钟。离心管中的液体即为基因组DNA。样品于4℃或-20℃保存。

11）利用NanoDrop-1000浓度测试仪准确测定每一份需要标化的样本DNA浓度和OD 比值（A260/A280、A260/A230）。要求样本DNA浓度在100ng/μl以上，样本DNA体积至少60μl，A260/A280值在1.8~2.0，A260/A230值在2.0~2.4。

12）使用超声波破碎仪对10）中提取的样本DNA进行片段化，经过末端补平、酶切、连接及PCR纯化完成样本DNA文库制备。利用Nanodrop2000对文库进行定量；琼脂糖凝胶电泳检测目的片段长度。

4.大黄鱼基因组文库构建

具体步骤如下：

1）超声片段化：起始量为3μg，用1×low TE Buffer稀释到30 ng/μL。采用Covaris S2超声仪进行超声片段化，按标准设定Covaris系统的值，3次循环×60s，水浴温度: 4℃，占空比: 20%，强度: 5，模式:Frequency sweeping，此程序打断样本片段为约150bp。

2）末端补平：分别取75μL片段化的DNA、End Repair Reaction Buffer 14μl、End Repair Enzyme Mix 11μl（mygenostics.Inc），总体积100μl。20℃孵育30min。用Beckman Ampure beads按1:1体积比例（beads：反应体积）对产物进行纯化。

3）片段两端加A(A-Tailing)：末端补平纯化洗脱32μl DNA、A-Tailing Reaction Buffer 15μl、A-Tailing Enzyme Mix 3μl（mygenostics.Inc），总体积50μl反应体系，37℃孵育30min。产物采用Beckman Ampure beads 按1:1体积比例（beads：反应体积）进行纯化。

4）连接adaptor：A-Tailing产物纯化洗脱27μl DNA、Ligation Reaction Buffer 40μl 、Ligation Enzyme Mix 30μl（mygenostics.Inc），总体积70μl反应体系，25℃孵育十分钟。产物采用Beckman Ampure beads 按1:1体积比例（beads：反应体积）进行纯化。PCR的反应体系如下：H₂O 40μl，5xPhusion HF buffer 20μl，10mM dNTP 2μl，DMSO 5μl，*Illumina PE primer #1 1μl(100μM)，*Illumina PE #2 1μl(100μM)，Hotstart Phusion 1μl，Template DNA 30μl。若后续测序需要多个样本混合到一条道里进行测序，那么PE#2应分别采用illumina index序列标记样本，以区别样本测序数据。PCR程序设置如下，Stage1：98℃ 1 min，Stage2：9x (98℃，20sec；65℃，30 sec；72℃，30 sec)，Stage3：72℃ 5min，4℃ 10s。PCR产物采用Beckman Ampure beads 按1:1体积比例（beads：反应体积）进行纯化。

5）文库的质量检测：取1μl制备好的文库样本，用Nanodrop 2000或Qubit对文库样本进行定量，取3μl制备好的文库样本，做1%的琼脂糖凝胶电泳实验，电泳结果片段大小在400bp到600bp之间。为保证文库样本有足够的量，一般总量在3μg以上，其片段应该是一个区域条带，而不是一个单一条带，以保证后续捕获实验。制备好的文库样本短时间可以存放在4℃，长时间保存则保存在-20℃。

5.大黄鱼基因组片段液相捕获富集，清洗及洗脱（如图2所示）

1）配制富集体系：DNA Library 1μg（30μl），Buffer BL 13μl，Probe 5μl。若文库样本浓度较高，体积不足30μl时，用无酶水不足至30μl，当文库样本浓度较低，体积大于30μl时，用真空浓缩仪将文库浓缩至30μl。

2）PCR仪设定以下程序：95℃7分钟，65℃2分钟，65℃22小时以上。当温度降至65℃2分钟后加入26.7μl的Buffer HY，用枪头抽吸混匀。

3）加入50μl MyOne beads(来自Invitrogen) 到1.5ml的离心管中，漩涡震荡至少5s，使磁珠充分悬浮，短暂离心后放入磁力架上一分钟。

4）离心管在磁力架上保持静止（不要旋转离心管），小心吸弃上清。

5）取下离心管，加入50μl的1XBinding Buffer ，旋窝震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟，小心吸弃上清。

6）重复步骤3两次（一共三次）。

7）取下离心管，加入50μl 1XBinding Buffer，旋窝震荡至少5s，短暂离心后完全转入一个新的离心管中。

8）终止富集程序，向富集产物中加入75μl的2XBingding buffer，均匀混合后完全转入beads的离心管中（总体积约200μl），旋窝震荡至少5s（不用离心），置于Rotator上室温旋转1小时。

9）此时将加热混合仪（eppendorf）设置到65℃，摇晃速度850 rpm。

10）一小时以后，漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟后小心吸弃上清液。

11）加入500μl WB1，旋窝震荡至少5s（不用离心），置于已经设定好的加热混合仪上，65℃，摇晃速度850 rpm 10分钟。

12）漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟后小心吸弃上清液。

13）加入500μl WB3，旋窝震荡至少5s（不用离心），置于已经设定好的加热混合仪上，65℃，摇晃速度850 rpm 10分钟。

14）漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟后小心吸弃上清液。

15）重复步骤11。

16）漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟后完全吸弃上清液。（先用1ml大枪头吸弃后，再采用200μl的枪头完全吸弃）。

17）加入50μl的Buffer Elute 重新悬浮磁珠，旋窝震荡至少5s，置于Rotator上室温旋转10分钟。

18）漩涡震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟后将上清液转移到一个含有70μl Buffer NE 的干净离心管中。

19）采用Qiagen MinElute Column对洗脱样本进行纯化，其纯化步骤参照Qiagen MinElute Kit的实验操作手册。15μl 洗脱两次，一共30μl。

6.大黄鱼基因组片段液相捕获富集样品PCR与纯化：

1）配制以下PCR反应体系：Capture DNA 30μl，H₂O 40μl，PCR Mix 30μl。

2）PCR仪设定以下程序：98℃ 1分钟，10X（98℃ 30s ，58℃ 30s ，72℃ 30s），72℃ 5min。

3）利用Anpure beads 对PCR产物进行纯化。将Ampure beads从冰箱里取出，上下颠倒使beads充分悬浮。

4）向产物中按1：1比例加入已充分悬浮的Ampure beads（如产物体积100μl，则加入100μl的Ampure beads），用枪头抽吸混匀至少十次。

5）将混合液放在室温下5分钟，使DNA充分被吸附在beads上。

6）在磁铁上室温放置2分钟（不要旋转tube）。

7）2分钟或是溶液变得清澈以后，用移液器将澄清的液体移弃（注意：枪头不要碰到磁珠）。

8）不要将tube从磁铁上，加入750μl（200μl PCR管中加入200μl）80%的酒精（酒精配置时间在两周以内，并确保封闭好），关上管盖，室温放置30秒。

9）移弃澄清液。

10）重复步骤6）、7）一次。

11）用200μl的枪头将管底的残留液体彻底吸干。

12）将tube从磁铁上移开，打开管盖，室温放置2分钟，此步骤是为了挥发掉残留的酒精，以免影响后续反应。

13）加入42μl的EB buffer（来自QIAgen 纯化试剂盒），充分混匀，置于室温2分钟。

14）将tube放到磁铁上2分钟，转移40μl的澄清液（DNA在澄清液中）于一个包含10μl 5XHF Reaction Buffer的离心管或PCR管中。

15）向产物中按1：1比例加入已充分悬浮的Ampure beads（如产物体积100μl，则加入100μl的Ampure beads），用枪头抽吸混匀至少十次。

16）将混合液放在室温下5分钟，使DNA充分被吸附在beads上。

17）在磁铁上室温放置2分钟（不要旋转tube）。

18）2分钟或是溶液变得清澈以后，用移液器将澄清的液体移弃（注意：枪头不要碰到磁珠）。

19）不要将tube从磁铁上，加入750μl（200μl PCR管中加入200μl）80% 的酒精（酒精配置时间在两周以内，并确保封闭好），关上管盖，室温放置30秒。

20）移弃澄清液。

21）重复步骤6）、7）一次。

22）用200μl的枪头将管底的残留液体彻底吸干。

23）将tube从磁铁上移开，打开管盖，室温放置2分钟，此步骤是为了挥发掉残留的酒精，以免影响后续反应。

24）加入35μl的EB buffer（来自QIAgen 纯化试剂盒），充分混匀，置于室温2分钟。

25）转移出35μl上清液于一个已经标记好的离心管中（此时已是最终富集样本）。

26）取1μl富集样本用Nanodrop进行定量。

27）取3μl富集样本跑1%的凝胶电泳，电泳参数为：电压150V，电泳时间5分钟。

28）QC合格后将样本储存在-20℃以下。

29）样品利用Illumina HiSeq2000进行高通量测序。

7.捕获测序分析与SNP检测。通过以下流程，对捕获片段中的SNP位点进行检测：

1）获取原始短序列，去除测序数据中的接头和低质量数据等。

2）把短序列用SOAPaligner软件定位到大黄鱼基因组数据相应的位置上；所用到参数：soap2.20-a-b-t -v 3 -l 42 -s 63 -m 100 -x 400，其中序列错配数为3，具体参数含义请参考：http://soap.genomics.org.cn/soapaligner.html。

3）统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等。

4）用SOAPsnp软件在目标区域找出位点的基因型，共获得约10万个SNP位点信息。

5）过滤低质量值（质量值≥20）和低覆盖度（深度≥10）的SNP，成功获得高质量SNP位点53235个。

6）对SNP位点进行注释，发现其中29903（56.17%）个来自于蛋白编码区域，剩余的SNP（43.83%）来自于非编码区，基本符合实验SNP设计范围。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。