本发明涉及医学免疫技术领域,尤其涉及一种高效获取DC细胞的方法。
背景技术:
DC-CIK生物免疫疗法(或DC+CIK)是指与DC细胞共培养的CIK细胞。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killers,CIK)是一类抗肿瘤抗病毒效应细胞,能在体外被诱导并大量增殖。树突状细胞(dendritic cell,DC)是有效的专职抗原提呈细胞,成熟的DC可以通过Ⅱ型组织相容性抗原(MHC-Ⅱ)等途径提呈肿瘤抗原,有效抵制肿瘤细胞的免疫逃逸机制。CIK细胞和DC细胞是细胞免疫治疗的2个重要组成部分,两者联合可确保高效的免疫反应。而在此技术中,需要分别培养DC细胞与CIK细胞,这两种细胞都是从PBMC中分离得到的,当前从PBMC中分离DC与CIK细胞的方法是通过半个小时的孵育,导致DC细胞获取数目不够多,从而影响后续的对CIK细胞的激活。
技术实现要素:
基于背景技术存在的技术问题,本发明提出了一种高效获取DC细胞的方法,相对于现有技术中孵育0.5h,本发明采用孵育2h,使得DC细胞充分沉降,伸出伪足,贴壁到培养瓶的底部,实现与T淋巴细胞的完全分离。
本发明提出的一种高效获取DC细胞的方法,包括如下步骤:
A、将人外周血单个核细胞重悬于GT-T551培养基中进行孵育1.5~2.5h;
B、去除未贴壁细胞后加入DC培养基进行培养DC细胞。
其中采用的DC培养基型号为DC grow。
优选地,步骤A中,孵育的温度为37℃,孵育的环境为5%CO2。
优选地,步骤A中,人外周血单个核细胞的制备方法如下:
S1、将人外周血注入离心管中进行一次离心得到物料a;
S2、去除上层血浆,然后取出中间的灰黄层,再加入生理盐水稀释进行稀释得到物料b;
S3、将物料b加入到淋巴细胞分离液上层,接着进行二次离心,然后吸取白膜层得到物料c;
S4、向物料c中加入生理盐水进行稀释,接着进行三次离心得到单个核细胞。
优选地,步骤A的人外周血单个核细胞制备方法S1中,一次离心的离心速度为1450~1550rpm,一次离心的离心时间为14~16min。
优选地,步骤A的人外周血单个核细胞制备方法S2中,灰黄层与物料b的体积比为2.5~5:35~40。
优选地,步骤A的人外周血单个核细胞制备方法S3中,二次离心的离心速度为1550~1650rpm,二次离心的离心时间为18~22min。
优选地,步骤A的人外周血单个核细胞制备方法S4中,三次离心的离心速度为1650~1750rpm,三次离心的离心时间为4~6min。
现有技术中往往采用将人外周血单个核细胞培育0.5h后,离心得到DC细胞,但本发明人发现人外周血单个核细胞培育0.5h的时候,DC细胞虽然大部分都沉降到培养瓶底部,但在将上清转移的时候,容易将DC细胞带走。
但是本发明人惊奇的发现,当培育0.5h后DC细胞会沉降到底部,并慢慢伸出伪足,而培育1.5h时,90%的DC细胞都紧紧贴在培养瓶底部,当培育2h时,DC细胞与培养瓶底部贴合力稳定,从而在转移上清和冲洗培养瓶底部的时候,DC细胞由于结合力比较大,不会脱落下来。从而提高DC细胞的获取数目,得到高纯度、高活性的DC细胞。
附图说明
图1为人外周血单个核细胞经本发明实施例5和现有技术孵育后DC细胞状态对比图;其中A为人外周血单个核细胞经现有技术孵育0.5h后DC细胞状态,B为人外周血单个核细胞本发明实施例5孵育2h后DC细胞状态。
图2为人外周血单个核细胞经孵育后收集到的DC细胞数目与孵育时间关系图。
具体实施方式
下面,通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本发明提出的一种高效获取DC细胞的方法,包括如下步骤:
A、将人外周血单个核细胞重悬于GT-T551培养基中进行孵育1.5h;
B、去除未贴壁细胞后加入DC培养基(DC grow)进行培养DC细胞。
实施例2
本发明提出的一种高效获取DC细胞的方法,包括如下步骤:
A、将人外周血单个核细胞重悬于GT-T551培养基中进行孵育2h,孵育的温度为37℃,孵育的环境为5%CO2;
B、去除未贴壁细胞后加入DC培养基(DC grow)进行培养DC细胞。
实施例3
本发明提出的一种高效获取DC细胞的方法,包括如下步骤:
A、将人外周血单个核细胞重悬于GT-T551培养基中进行孵育2.5h,孵育的温度为37℃,孵育的环境为5%CO2;
其中,人外周血单个核细胞的制备方法如下:
S1、将人外周血注入离心管中进行一次离心得到物料a;
S2、去除上层血浆,然后取出中间的灰黄层,再加入生理盐水稀释进行稀释得到物料b;
S3、将物料b加入到淋巴细胞分离液上层,接着进行二次离心,然后吸取白膜层得到物料c;
S4、向物料c中加入生理盐水进行稀释,接着进行三次离心得到单个核细胞。
B、去除未贴壁细胞后加入DC培养基(DC grow)进行培养DC细胞。
实施例4
本发明提出的一种高效获取DC细胞的方法,包括如下步骤:
A、将人外周血单个核细胞重悬于GT-T551培养基中进行孵育2.5h,孵育的温度为37℃,孵育的环境为5%CO2;
其中,人外周血单个核细胞的制备方法如下:
S1、将人外周血注入离心管中进行一次离心得到物料a,一次离心的离心速度为1500rpm,一次离心的离心时间为15min;
S2、去除上层血浆,然后取出中间的灰黄层,再加入生理盐水稀释进行稀释得到物料b,灰黄层与物料b的体积比为2.5:40;
S3、将物料b加入到淋巴细胞分离液上层,接着进行二次离心,然后吸取白膜层得到物料c,二次离心的离心速度为1600rpm,二次离心的离心时间为20min;
S4、向物料c中加入生理盐水进行稀释,接着进行三次离心得到单个核细胞,三次离心的离心速度为1700rpm,三次离心的离心时间为5min;
B、去除未贴壁细胞后加入DC培养基(DC grow)进行培养DC细胞。
实施例5
本发明提出的一种高效获取DC细胞的方法,包括如下步骤:
A、将人外周血单个核细胞重悬于GT-T551培养基中,转移至T175培养瓶,孵育2.5h,孵育的温度为37℃,孵育的环境为5%CO2;
其中,人外周血单个核细胞的制备方法如下:
S1、将人外周血注入50mL离心管中进行一次离心得到物料a,一次离心的离心速度为1500rpm,一次离心的离心时间为15min;
S2、吸取上层血浆,分装3管5mL血浆,-20℃保存,剩余血浆56℃灭活30min,3000rpm/10min,去沉淀4℃保存;
然后取出中间的灰黄层,再加入生理盐水稀释进行稀释得到物料b,灰黄层与物料b的体积比为5:35;
S3、将物料b加入到淋巴细胞分离液上层,接着进行二次离心,然后吸取白膜层得到物料c,二次离心的离心速度为1600rpm,二次离心的离心时间为20min;
S4、向物料c中加入生理盐水进行稀释,接着进行三次离心得到单个核细胞,三次离心的离心速度为1700rpm,三次离心的离心时间为5min;
B、吸取不贴壁细胞加入已使用CD3/CD28抗体包被的T-175培养瓶中,加入1000U/ml IFNγ得到CIK细胞;然后加入DC培养基(DC grow)进行培养DC细胞。
将实施例5和现有技术进行对比,如图1和图2所示。由图1和图2可知:孵育时间为2h,使得DC细胞充分沉降并贴壁到培养瓶的底部,实现与T淋巴细胞的完全分离,而孵育时间小于2h时DC细胞数量过少,孵育时间大于2h时的DC细胞数量相对于孵育时间为2h的DC细胞数量增长较少。
以上所述,仅为本发明较佳的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变,都应涵盖在本发明的保护范围之内。
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