调节钙离子通道活性的方法及其用途与流程

本发明涉及分子生物学和疾病治疗及药物领域。具体的，本发明涉及钙离子通道调节方法和调节剂，和其用于治疗钙离子通道相关疾病的方法和药物组合物。

背景技术：

l型钙离子通道是一类电压门控的钙离子通道，主要分布在心肌细胞及心血管平滑肌细胞上，是心肌细胞兴奋时钙离子内流的主要途径。心脏的收缩由心肌细胞称为兴奋-收缩耦联的过程介导。具体过程为，心脏窦房结产生电兴奋-动作电位，经细胞膜传递，心室肌细胞膜上的l型钙离子通道感受动作电位开放，胞外钙离子经由通道进入细胞内，激活肌细胞肌质网上的钙离子通道，导致钙离子从肌质网这个钙离子储存库中大量释放，引起胞浆中钙离子浓度升高。释放到胞浆中的钙离子，使肌细胞肌丝滑动产生细胞收缩，从而引起心脏的收缩。

l型钙离子通道存在多种调控模式，其中通道的羧基末端是对该通道开放活性以及电流大小调控的重要部分。已有研究证明，l型钙通道在生理条件下，通过调节翻译后修饰的水平，如磷酸化水平，来完成通道活性的调控。在氧化应激等条件下，受g蛋白耦联受体(gpcr)调控，l型钙离子通道磷酸化修饰水平提高，增大细胞的钙离子内流。因此，在氧化应激条件下，如心肌缺血、梗塞或高血压引发的负荷型心脏肥厚、心衰等病理条件，l型钙离子通道的活性增大，往往造成钙离子内流增大，引发心肌细胞中钙离子超载。钙离子超载引发一系列严重的心肌细胞损伤。

由于上述重要作用，l型钙离子通道成为目前最具药理意义的通道。已经发现不同的l型钙离子通道调节方式，临床用于治疗高血压、冠心病、心绞痛等心血管疾病。然而，现有的治疗方法和药物存在可能引发细胞内钙离子浓度骤然变化，从而引发血压急剧变化而带来的心肌梗塞或中风等重症的问题。

l型钙离子通道的调节机制还未得到完全认识，其活性中心和涉及的机制还有待深入研究。本领域还需要新的有效调节l型钙离子通道的方法和药物。

技术实现要素：

本申请的发明人经过深入研究，首次发现l型钙通道蛋白羧基端第2061-2064位负电荷氨基酸簇(2061esse2064)核心区对l型钙通道蛋白的活性具有重要意义，这一保守序列的存在对l型钙通道蛋白活性调控存在重要的作用。发明人进而通过对该序列中针对大鼠源2009位丝氨酸(对应人第2063位丝氨酸)的性质进行调整，证明对其进行影响磷酸化的修饰，改变负电荷氨基酸簇的带电性质，可大大影响l型钙通道蛋白控制的钙离子内流。本发明人由此提供了通过改变l型钙通道蛋白羧基端第2061到2064位负电荷氨基酸簇本身带电荷性质，及改变其中丝氨酸的磷酸化水平来调节l型钙通道蛋白，影响钙离子通道的活性，进而治疗心血管疾病的方法和药物。

具体的，本发明提供了调节哺乳动物心肌细胞钙离子内流的方法，其包括对l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列的第2061-2064位的esse中一个氨基酸残基或任意多个氨基酸残基的组合进行修饰。在本发明的其中一个方面，所述修饰是对l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列中第2062位和/或第2063位的丝氨酸(s)进行修饰。

l型钙通道蛋白(voltage-dependentl-typecalciumchannel)，广泛分布于平滑肌细胞、心肌细胞、神经元等不同细胞，是调控钙离子内流的主要通道蛋白。在心肌细胞中，负责钙质钙释放，调节心肌细胞收缩及心率。在哺乳动物中，l型钙通道蛋白的蛋白序列和编码核酸序列都很保守。人类的l型钙通道蛋白(uniprotid:q13936)的编码基因是(ensembl:enst00000344100)。大鼠l型钙通道蛋白(uniprotid:p22002)的编码基因是(ensembl:ensrnog00000007090)。小鼠l型钙通道蛋白(uniprotid:q01815)的编码基因是(ensembl:ensmust00000075591)。l型钙通道蛋白中，对应人的seqidno.1的氨基酸序列中第2061-2064位的esse氨基酸簇在物种间保守性很高。所述esse氨基酸簇在对应大鼠的seqidno.2的氨基酸序列中为第2007-2010位。

在本发明的其中一个方面，上述方法中的所述修饰是改变所述2061-2064位的esse的氨基酸残基带电性质。可以采用本领域已知的对蛋白上某个或多个氨基酸残基的带电性质进行改变的方法，例如对氨基酸残基进行包括酸基化等化学修饰，或是做氨基酸残基替换等。

在本发明的其中一个方面，上述方法中的所述修饰是指磷酸化修饰，特别是指对所述第2062位和/或第2063位的丝氨酸进行磷酸化修饰。可以采用本领域已知的对蛋白上某个氨基酸进行磷酸化的方法对其进行修饰。磷酸化修饰包括用蛋白激酶(kinase)进行磷酸化或用磷酸酶(phosphatase)进行去磷酸化。用蛋白激酶进行磷酸化是通过蛋白激酶催化将atp的磷酸基团转移到底物蛋白丝氨酸残基上。用磷酸酶去磷酸化是指磷酸化的丝氨酸在磷酸酶的水解作用下去除磷酸基团的过程。

在本发明的其中一个方面，对所述2061-2064位的esse进行磷酸化修饰，特别是对所述第2062位和/或第2063位的丝氨酸的磷酸化的激酶是oxikinase(氧化应激蛋白激酶)。

在本发明的其中一个方面，对所述2061-2064位的esse进行去磷酸化修饰，特别是对所述第2062位和/或第2063位的丝氨酸的去磷酸化的磷酸酶是oxiphatase(氧化应激磷酸酶)。

在本专利中，oxikinase是指在氧化应激条件下，调控l型钙通道蛋白羧基端第2061-2064位负电荷氨基酸簇(2061esse2064)核心区的氨基酸残基的磷酸化的激酶。

在本专利中，oxiphatase是指在氧化应激条件下，调控l型钙通道蛋白羧基端第2061-2064位负电荷氨基酸簇(2061esse2064)核心区的氨基酸残基的去磷酸化的磷酸酶。

在本发明的其中一个方面，所述方法中还包括通过以下方式对所述激酶或磷酸酶进行调节：

a.激酶或磷酸酶抑制剂，例如为干扰所述激酶或磷酸酶表达的干扰rna或其前体，或是所述激酶或磷酸酶的特异性抗体，或是导致活性下降的突变型激酶或磷酸酶蛋白或其编码序列；

b.所述激酶或磷酸酶激动剂；或

c.过表达所述激酶或磷酸酶。

所述激酶或磷酸酶抑制剂是指能够影响激酶或磷酸酶的活性进而影响l型钙通道的活性的试剂。所述试剂包括小分子化合物或复合物，或是蛋白、核酸等大分子活性成分。

在本发明的其中又一个方面，所述激酶或磷酸酶抑制剂为干扰表达的干扰rna或其前体。干扰rna是通过双链rna(double-strandedrna，dsrna)来诱发同源mrna高效特异性降解，从而使得目标基因的表达降低甚至消除。在体内给予干扰rna的一种方式是通过其前体实现，例如包括两个短反向重复序列的短发夹rna(shorthairpinrna，shrna)。

在本发明的其中又一个方面，所述激酶或磷酸酶抑制剂为导致活性下降或丧失的突变型激酶或磷酸酶蛋白或其编码序列。突变型蛋白可与正常蛋白发生竞争性作用，从而降低正常蛋白发挥的活性。突变型蛋白可通过给予在目标组织或细胞可表达的载体(载体上携带可表达的突变型蛋白基因和/或其表达因子)等方式在目标组织或细胞表达。

在本发明的其中一个方面，所述对l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列中2061-2064位的esse中任意一个或多个氨基酸残基的组合进行修饰是指对氨基酸残基的点突变。可以采用本领域已知的对蛋白上某个氨基酸进行点突变的方法。例如，通过利用pcr等方法在编码目的氨基酸残基的dna片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化，包括增加/改变碱基，使其编码突变后需要的氨基酸残基等，然后将修饰后的dna片段导入目的细胞或组织中，增加新的蛋白或取代野生型蛋白。

在本发明的其中又一个方面，所述修饰是对l型钙通道蛋白的所述第2062位和/或第2063位的丝氨酸进行点突变。所述点突变为将所述丝氨酸突变为非负电性质的氨基酸，例如改变为电中性或电正性的氨基酸(即非极性氨基酸或碱性氨基酸)，包括甘氨酸(gly)、丙氨酸(ala)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)、酪氨酸(tyr)和甲硫氨酸(met)等。优选的，是将所述丝氨酸突变为丙氨酸或异亮氨酸。例如，可以通过克隆获得含有编码l型钙通道蛋白第2062位和/或第2063位的丝氨酸的核酸片段的质粒，将其中编码丝氨酸的碱基tct用att取代，然后将质粒转染目标细胞，由此在目标细胞中导入l型钙通道蛋白第2062位和/或第2063位为异亮氨酸的突变l型钙通道蛋白。

在本发明中，所述哺乳动物可以为任何哺乳动物，包括和不限于啮齿目(如黄鼠、小鼠和大鼠)，兔形目(兔子)、食肉目(猫科动物和犬科动物)、偶蹄目(牛科动物和猪科动物)、奇蹄目(马科动物)，或为灵长目和猿猴亚目(人或猴)。所述哺乳动物优选为人或小鼠或大鼠。

本发明提供的调节哺乳动物心肌细胞钙离子内流的方法可用于体外方法，包括对离体的细胞或组织进行调节。

本发明还提供了修饰l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列的第2061-2064位的esse中一个氨基酸残基或任意多个氨基酸残基的组合的试剂在用于制备调节哺乳动物心肌细胞钙离子内流的药物中的用途。在本发明的其中一个方面，所述试剂是修饰其中第2062位和/或第2063位的丝氨酸的试剂。

在本发明的其中一个方面，上述方法和用途中，用于修饰l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列的第2061-2064位的esse，特别是修饰其中第2062位和/或第2063位的丝氨酸的试剂为特异性修饰所述位点的试剂。特异性修饰试剂是指只对所述位点进行修饰的试剂，或是对其它位点的氨基酸残基特别是其它位点的丝氨酸残基没有所述修饰活性或修饰活性显著小于所述第2062位和/或第2063位的丝氨酸的修饰活性的试剂。例如，其为特异性影响第2062位和/或第2063位的丝氨酸的磷酸化或去磷酸化或其水平的酶。又例如，其为用于对第2062位的丝氨酸进行点突变使用的反应物(如用于获得含有突变核酸片段的引物、含有突变核酸片段的质粒等)。

在本发明的其中又一个方面，上述用途中的试剂是改变所述2061-2064位的esse的氨基酸残基带电性质的试剂，例如氨基酸残基进行包括酸基化等化学修饰的试剂。

在本发明的其中又一个方面，上述用途中的试剂是磷酸化修饰试剂，特别是指对所述第2062位和/或第2063位的丝氨酸进行磷酸化修饰的试剂，例如蛋白激酶(kinase)或磷酸酶(phosphatase)。在本发明的其中又一个方面，所述试剂是对所述2061-2064位的esse进行磷酸化修饰，特别是对所述第2062位和/或第2063位的丝氨酸的磷酸化的oxikinase(氧化应激蛋白激酶)。在本发明的其中又一个方面，所述试剂是对所述2061-2064位的esse进行去磷酸化修饰的oxiphatase(氧化应激磷酸酶)。在本发明的其中又一个方面，所述试剂是：

a.激酶或磷酸酶抑制剂，例如为干扰所述激酶或磷酸酶表达的干扰rna或其前体，或是所述激酶或磷酸酶的特异性抗体，或是导致活性下降的突变型激酶或磷酸酶蛋白或其编码序列；

b.激酶或磷酸酶激动剂；或

c.用于过表达所述激酶或磷酸酶的试剂。

在本发明的一个方面，提供了一种l型钙通道调节剂，其为特异性修饰l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列第2061-2064位的esse中一个氨基酸残基或任意多个氨基酸残基的组合的试剂。在本发明的其中又一个方面，所述l型钙通道调节剂为特异性修饰l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列中第2062位和/或第2063的丝氨酸的试剂。

在本发明的其中又一个方面，上述l型钙通道调节剂是特异性磷酸化修饰试剂，特别是指对所述第2062位和/或第2063位的丝氨酸进行特异性磷酸化修饰的试剂，例如oxikinase(氧化应激蛋白激酶)或oxiphatase(氧化应激磷酸酶)。在本发明的其中又一个方面，所述试剂是：

a.激酶或磷酸酶抑制剂，例如为干扰所述激酶或磷酸酶表达的干扰rna或其前体，或是所述激酶或磷酸酶的特异性抗体，或是导致活性下降的突变型激酶或磷酸酶蛋白或其编码序列；

b.激酶或磷酸酶激动剂；或

c.过表达的所述激酶或磷酸酶。

在本发明的其中又一个方面，上述l型钙通道调节剂是一种哺乳动物l型钙通道蛋白，其在对应序列为seqidno.1的氨基酸序列(人源)的第2062位和第2063位的丝氨酸中的任意一个或两个突变为非极性氨基酸。在本发明的其中一个方面，其中所述在对应序列为seqidno.1的氨基酸序列的第2062位和第2063位的丝氨酸突变为非极性氨基酸或碱性氨基酸，优选的，突变为异亮氨酸或丙氨酸。

因此，在本发明的其中一个方面，提供了一种哺乳动物l型钙通道蛋白，其在对应序列为seqidno.1的氨基酸序列(人源)的第2062位和第2063位的丝氨酸中的任意一个或两个突变为非极性氨基酸。在本发明的其中一个方面，其中所述在对应序列为seqidno.1的氨基酸序列的第2062位和第2063位的丝氨酸突变为非极性氨基酸或碱性氨基酸，优选的，突变为异亮氨酸或丙氨酸。

本发明还提供了通过修饰哺乳动物的l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列第2061-2064位的esse中一个氨基酸残基或任意多个氨基酸残基的组合来治疗心血管疾病的方法。本发明还提供了修饰哺乳动物的l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列第2061-2064位的esse中一个氨基酸残基或任意多个氨基酸残基的组合的试剂在用于制备治疗心血管疾病的药物中的用途。

本发明还提供了用于治疗心血管疾病的药物组合物。本发明提供新的治疗心血管的药物组合物，其包含治疗有效量的修饰哺乳动物的l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列第2061-2064位的esse中一个氨基酸残基或任意多个氨基酸残基的组合的试剂。

上述本发明的治疗心血管疾病的方法和药物组合物中所述修饰改变哺乳动物的l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列第2061-2064位的esse的性质的试剂，包括修饰l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列中第2062位和/或第2063的丝氨酸的试剂，特别是特异性修饰的试剂，如前文所定义。

在本发明中，所述心血管疾病选自：房性和室性心律失常，心力衰竭(包括充血性心力衰竭、舒张性心力衰竭、收缩性心力衰竭、急性心力衰竭)、普林兹迈托(变体)心绞痛、稳定型和不稳定型心绞痛、运动诱发的心绞痛、充血性心脏病、局部缺血、复发性缺血、再灌注损伤、心肌梗塞、急性冠脉综合征、外周动脉疾病、肺动脉高压。

本发明还提供了筛选治疗心血管疾病的潜在物质的方法，包括步骤：

(1)获得表达l型钙通道蛋白的哺乳动物细胞，施用待筛选的测试物；和

(2)检测所述哺乳动物细胞的l型钙通道蛋白对应序列为seqidno.1的氨基酸序列的第2062位和/或第2063位的丝氨酸是否发生磷酸化修饰。

在所述筛选治疗心血管疾病的潜在物质的方法中，如果在所述方法中发现哺乳动物细胞的所述第2062位和/或第2063位的丝氨酸发生磷酸化修饰，则表示该测试物是可用于治疗心血管疾病的潜在物质。

在本发明的其中一个方面，所述方法还包括步骤：(3)检测所述哺乳动物细胞的钙离子流。

在所述筛选治疗心血管疾病的潜在物质的方法中，如果在所述方法中发现哺乳动物细胞的所述第2062位和/或第2063位的丝氨酸发生磷酸化修饰，并且所述哺乳动物细胞的钙离子流发生变化，则表示该测试物是可用于治疗心血管疾病的潜在物质。

本发明还提供了筛选哺乳动物的oxikiase或oxiphotase的方法，包括步骤：

(1)获得表达l型钙通道蛋白和待测激酶或磷酸酶的哺乳动物细胞；和

(2)检测在缺氧的条件下，所述激酶或磷酸酶的表达是否发生变化，以及所述l型钙通道蛋白的对应序列为seqidno.1的氨基酸序列的第2062位和/或第2063位的丝氨酸是否发生磷酸化修饰。

在所述筛选哺乳动物的oxikiase或oxiphotase的方法中，如果在所述方法中发现哺乳动物细胞的所述第2062位和/或第2063位的丝氨酸发生磷酸化修饰，则表示待测激酶或磷酸酶是潜在的缺氧应激的oxikiase或oxiphotase。

在本发明的其中一个方面，所述方法还包括步骤：(3)检测所述哺乳动物细胞的钙离子流。

在所述筛选oxikiase或oxiphotase的方法中，如果在所述方法中发现哺乳动物细胞的所述第2062位和/或第2063位的丝氨酸发生磷酸化修饰，并且所述哺乳动物细胞的钙离子流发生变化，则表示待测激酶或磷酸酶是潜在的缺氧应激的oxikiase或oxiphotase。

本发明的贡献：

发明人经过深入研究，首次发现l型钙通道蛋白羧基端第2007-2010位负电荷氨基酸簇(2007esse2010)核心区对l型钙通道蛋白的活性具有重要意义。l型钙通道蛋白羧基端是调控其功能的重要结构域，其上广泛分布着磷酸激酶、磷酸酶及调控蛋白相互作用位点。发明人通过对l型钙通道蛋白羧基端的蛋白序列分析发现，对应人l型钙通道蛋白2061-2064位的esse氨基酸簇在物种间保守性很高。所述2061-2064位氨基酸在生理条件下为带有负电荷的氨基酸。具体的，2007及2010位谷氨酸(e)为酸性氨基酸，即在生理条件下谷氨酸侧链羧基解离带有负电荷。2008及2009位丝氨酸(s)为重要的磷酸化修饰位点，磷酸化修饰后的丝氨酸在生理条件下侧链也带负电荷。因此所述2007-2010位为保守的、带有四个连续的负电性质的氨基酸簇。这一保守序列的存在对l型钙通道蛋白活性调控存在重要的作用。

在上述研究的基础上，发明人进一步发现针对该序列中第2009位丝氨酸的性质进行调整，特别是对其进行突变而影响磷酸化修饰改变负电荷氨基酸簇的带电性质，会大大影响l型钙通道蛋白介导的钙离子内流。具体的，将2009位丝氨酸突变为异亮氨酸，由于异亮氨酸为不带电荷的非极性氨酸(疏水氨基酸)，该突变不仅剥夺了该位置原本发生磷酸化丝氨酸的负电侧链，同时也改变了整个2007-2010位置四个连续负电荷的分布，即改变了保守负电荷氨基酸簇的带电性质。该负电簇带电性质改变后，l型钙通道蛋白通道不易激活，活性受到抑制。本发明人由此提供了通过改变l型钙通道蛋白羧基端第2007到2010位负电荷氨基酸簇本身带电荷性质，及改变其中丝氨酸的磷酸化水平来调节l型钙通道蛋白，影响钙离子通道的活性的方法，进而提供了治疗心血管疾病的方法和药物。

l型钙通道广泛分布在心血管系统细胞表面，使其成为优良的心血管疾病药物靶标。目前临床所广泛使用治疗高血压、冠心病的药物，如地平类药物，其有效成分为l型钙通道的抑制剂，作用机制为结合l型钙通道的孔道区，直接减弱钙离子内流，抑制剂并不影响通道的激活及失活活性，即不改变通道的电压敏感性。然而钙离子抑制剂对l型钙通道的广泛抑制作用，也引发一系列问题。由于钙离子药物抑制剂直接减少细胞钙离子内流，因此在药物初始给予和剂量降低时需要逐步进行，以防引发细胞内钙离子浓度骤然变化，从而引发血压急剧变化而带来的心肌梗塞或中风等重症。

而本发明中提出针对l型钙通道的激活性质改变，从而提供的治疗方案则有别于传统钙离子抑制剂类药物治疗，提高了胞内钙离子浓度的可调控性。由于多数病理状态，如高血压、冠心病、心肌缺血等，均使心肌细胞处于氧化胁迫状态，此时l型钙离子通道被显著激活，即在静息状态下，通道的开放概率更高，细胞钙泄漏增大，使得细胞本底钙离子浓度升高，引发病症。因此，如果可以在这时通过调控l型钙通道的通道敏感性，而非单纯降低通道内流钙离子大小，则可以更为有效、安全的调控胞内钙离子浓度，从而达到治疗效果。

由于目前针对l型钙离子通道的调控研究，均集中在对其通道电流(经通道内流进入细胞内的钙离子数目)大小调控上，因此，本发明中发现的通过l型钙离子通道羧基端负电性氨基酸簇的调控，从而影响通道激活性质的改变，提供了全新的、可控的、更为有效、更具安全性的心血管疾病治疗机理和方向。

附图说明

图1为l型钙通道蛋白结构和物种间一级序列分析比对图。来自于人类、大鼠及小鼠的l型钙离子通道α亚基的蛋白序列均来自于uniprot数据库。蛋白二级结构标示来自于uniprot数据库。

图2l型钙通道氨基酸簇esse一级序列磷酸化分析图。

图3显示hek239t细胞过表达野生型及突变体l型钙通道激活曲线比较。不同电压(v)下的电导(g)由钙电流-电压数据计算，电导与其对应的最大电导(gmax)进行归一化，并对所有点拟合摩尔兹曼方程g/gmax＝1/(1+exp((vhalf-v)/k)),，计算得到半数激活电压(vhalf)，即曲线中g/gmax等于0.5时，所对应的电压值。野生型(白圈表示)l型钙通道半数激活电压为-10mv，对应seqidno.2的氨基酸序列中第2009位丝氨酸突变成异亮氨酸(s2009i)的突变体l型钙通道半数激活电压为-4mv，即与野生型相比，突变体通道激活曲线向右(向去极化方向)移动。这表明，在相同电压下，野生型通道相较突变体通道更容易激活，通道更易开放，相同时间下经由该通道进入细胞的钙离子更多。

具体实施方式

下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1材料和方法

动物材料

spraguedawley大鼠购自维通利华北京维通利华实验动物技术有限公司，实验用鼠均为体重200-250克成年雄性鼠。所有动物实验均已获得北京大学实验动物福利与使用委员会批准。

基因克隆及载体构建

大鼠l型钙通道蛋白α亚基(图1所示亚基)，β亚基(表达辅助亚基)的编码区核酸序列采用链式扩增反应(pcr)从大鼠心肌细胞的cdna文库中扩增得到。α亚基核酸序列通过nhei/xhoi酶切位点，连入pires-egfp载体。β亚基核酸序列通过内切酶nhei/xhoi(newenglandbiolabs,uk)酶切位点，连入pires-tdtomato载体。

过表达载体pires-egfp由ires核酸序列ecori/bamhi插入pegfp-c1(clontech,usa)中获得，将pires-egfp载体中，egfp核酸序列部分nhei/bsrgi双酶切替换成tdtomato核酸序列，得到pires-tdtomato载体。

大鼠l型钙通道蛋白α亚基对应seqidno.2的氨基酸序列中第2009位丝氨酸突变为异亮氨酸通过重叠pcr完成，将编码2009位的丝氨酸密码子tct用att代替并通过合成引物，引入点突变。

上述克隆涉及的引物序列如下：

l型钙通道α亚基正(f)反向(r)引物：

f：ctagctagcatgattcgggccttcgctcag

r：ccgctcgagctacaggttgctgacataggacctgc

用于点突变的引物序列：

s2009i_f：cggagtccattgagaaactcaacagcag

s2009i_r：agtttctcaatggactccgccccctc

l型钙通道β亚基正(f)反向(r)引物：

f：ctagctagcatgcttgacaggcagttggtgtcttc

r：acgcgtcgactcattggcggatgtatacatccctg

细胞培养及蛋白过表达

hek293t细胞在含有10％胎牛血清的dmem(thermofisherscientific,usa)中培养，培养环境中含有5％二氧化碳。转染前1h时，细胞转移到无血清培养基opti-mem(gibcobrl,usa)，转染试剂为lipo2000(thermofisherscientificusa)，含有α亚基的pires-egfp与含有β亚基的pires-tdtomato质粒共转，每种质粒转染量为2μg。转染后8小时，细胞换到含血清培养基继续培养24小时，用于后续实验。共转染的细胞利用倒置共聚焦激光显微镜lsm710(carlzeiss,germany)系统观察并筛选。

电生理

本实验采用axon200b膜片钳放大器，digidata1440a数模转换器和clampex6软件实现电生理刺激和信号的采集和记录。环境温度为25℃。实验采用的玻璃电极入液电阻为2-4mω。在蔡司lsm710共聚焦显微镜下选择均表达lccɑ亚基(含egfp)和β亚基(含td-tomato)的细胞进行记录。细胞记录内液配方为(mm)：120cscl，20tea-cl，5egta，10hepes，1mgcl2·6h2o，5mgatp，csoh调节ph值为7.2。外液配方为(mm)：137nacl，5.4kcl，1.2mgcl2·6h2o，20hepes，1.2nah2po4·2h2o，10bacl2，10glucose，naoh调ph值为7.3-7.4。电极入液后通过负压贴附方式使电极与细胞达成高阻(>gω)封接。之后向电极管内施加微弱的正压力破膜。破膜后将细胞膜电位钳制在-70mv，刺激从-70mv到70mv，以10mv为阶跃。电流信号的采集频率为2khz。数据使用pclamp10.2软件进行分析。

实施例2l型钙通道蛋白序列分析

对人、大鼠和小鼠的l型钙通道蛋白的蛋白结构和一级序列进行分析。如图1所示，l型钙通道的四个亚基由i-iv表示，每个亚基包含六个穿细胞膜螺旋，由1-6表示，第五到第六螺旋间的卷曲(loop)部分为电压感受部分。羧基端部分处于细胞内，该结构域简称dct。对应人的seqidno.1的氨基酸序列中第2061-2064位(对应大鼠seqidno.2的氨基酸序列中第2007-2010位)的氨基酸簇esse处于通道羧基端上。经一级序列分析发现，该氨基酸簇esse在人、大鼠及小鼠间保守。

实施例3l型钙通道氨基酸簇esse一级序列磷酸化分析。

对大鼠l型钙通道羧基端结构域(1506-2169位氨基酸)蛋白质一级序列来自于uniprot，该序列利用“基于序列及结构的蛋白磷酸化分析”算法进行分析(netphos2.0)。

如图2所示，一级序列分析显示，2008位及2009位(对应seqidno.2的氨基酸序列)丝氨酸磷酸化存在较高程度的磷酸化，得分为0.722和0.784。得分值在0.2以上即表明生理状态下已具备较低水平的磷酸化。

实施例4细胞模型显示大鼠对应seqidno.2的氨基酸序列中第2009位丝氨酸突变为异亮氨酸对l型钙通道活性的影响

将大鼠l型钙通道的基因插入表达载体中，并在hek209t细胞中过表达，利用全细胞膜片钳技术，检测l型钙通道的激活曲线。随电压升高，通道开放细胞外钙离子经过通道流入胞浆中，通道激活。电压门控型通道在不同电压下，所激活的通道数目不同。

如图3所示。图3为l型钙通道随电压变化的电导曲线，即通道激活曲线。随电压升高，细胞膜上处于开放状态的通道逐渐增多，电导增加。s2009i(2009位丝氨酸突变成异亮氨酸)突变体通道激活曲线向右移动。

这表明，当2009位丝氨酸突变成异亮氨酸时，通道需要更高的电压才能使通道激活，也就是说，在相同电压下，突变体通道开放概率比野生型小，通道活性受到抑制。

实施例5细胞模型显示大鼠对应seqidno.2的氨基酸序列中第2009位丝氨酸突变为丙氨酸对l型钙通道活性的影响

采用实施例5中相同方法，经测试发现，s2009a(2009位丝氨酸突变成丙氨酸)突变体通道激活曲线与s2009i突变体的激活曲线类似，去向向右移动。这表明，当2009位丝氨酸突变成丙氨酸时，在相同电压下，突变体通道开放概率比野生型小，通道活性受到抑制。

因此，2007-2010位负电性氨基酸簇，磷酸化的丝氨酸突变为侧链较小的非极性氨基酸丙氨酸，改变了氨基酸簇负电性的性质，通道活性得以抑制。

结论

本发明人经过深入研究，首次发现大鼠2007-2010位(对应人l型钙通道蛋白2061-2064位)为保守的、带有四个连续的负电性质的氨基酸簇。这一保守序列的存在对l型钙通道蛋白活性调控存在重要的作用。

在上述研究的基础上，发明人进一步发现和证明针对2009位丝氨酸的性质进行调整，特别是对其进行突变而影响磷酸化修饰改变负电荷氨基酸簇的带电性质，会大大影响钙离子内流。本发明人由此提供了通过改变l型钙通道蛋白羧基端负电荷氨基酸簇本身带电荷性质，及改变其中丝氨酸的磷酸化水平来调节l型钙通道蛋白，影响钙离子通道的活性，进而治疗心血管疾病的方法和药物。

本发明中提出针对l型钙通道的激活性质改变，从而提供的治疗方案则有别于传统钙离子抑制剂类药物治疗，提高了胞内钙离子浓度的可调控性。由于多数病理状态，如高血压、冠心病、心肌缺血等，均使心肌细胞处于氧化胁迫状态，此时l型钙离子通道被显著激活，即在静息状态下，通道的开放概率更高，细胞钙泄漏增大，使得细胞本底钙离子浓度升高，引发病症。因此，如果可以在这时通过调控l型钙通道的通道敏感性，而非单纯降低通道内流钙离子大小，则可以更为有效、安全的调控胞内钙离子浓度，从而达到治疗效果。

由于目前针对l型钙离子通道的调控研究，均集中在对其通道电流(经通道内流进入细胞内的钙离子数目)大小调控上，因此，本发明中发现的通过l型钙离子通道羧基端负电性氨基酸簇的调控，从而影响通道激活性质的改变，提供了全新的、可控的、更为有效、更具安全性的疾病治疗机理和方向。

上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。

如无特别表示，本文中出现的温度的单位“度”是指摄氏度，即℃。

序列表

<110>北京大学

<120>调节钙离子通道活性的方法及其用途

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

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