一种小鼠造影剂肾病模型及其构建方法

1.本发明涉及造影剂肾病动物模型构建技术领域，尤其涉及一种小鼠造影剂肾病模型及其构建方法。


背景技术：

2.造影剂肾病（contrast-induced nephropathy，cin）是指排除其他疾病影响的前提下，在造影剂注射后短时间内出现的急性肾功能不全。冠脉介入手术的不断进步和影像学硬件设施的快速升级，为心脑血管系统疾病的诊治提供了强有力的支撑，同时造影剂的大量使用及合并的基础疾病增多使得cin成为了心导管术及冠脉介入治疗术后的常见并发症，cin目前已成为医院获得性肾功能受损的主要原因之一。
3.cin的诊断标准尚不完全统一，根据kdigo的最新推荐，cin的定义为：造影剂使用后48h内肌酐水平较基线水平上升≥0.3 mg/dl（26.5
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mol/l），或在7天内升高超过1.5倍基线值。
4.目前普遍认为，造影剂肾病的发病机制与其直接毒性作用、肾脏血流灌注改变、氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等关系密切。其中氧化应激被较多关注。造影剂由于自身独特的高粘滞性、高渗透性，相对于其他药物而言可延长其在肾脏的滞留时间，对细胞造成毒性作用，导致肾小管上皮细胞大量坏死，肾小球滤过率下降。同时可影响血管内皮细胞的正常生理功能，使具有扩张血管效应的物质生成减少，导致肾血管持续收缩，加重肾脏组织缺血、缺氧。上述每个阶段均可以产生过量的活性氧物质（reactive oxygen species，ros），ros可抑制一氧化氮合酶（nitric oxide synthetase，nos）和前列环素合酶的功能，导致一氧化氮（nitric oxide，no）和前列腺素（prostaglandin，pg）生成减少，进一步加重肾脏损伤。有研究发现，降低肾脏ros水平可减轻cin的损伤。还有研究表明，高血压、冠心病、糖尿病、心力衰竭等疾病常伴有内皮源性血管舒张功能障碍，肾脏组织中的pgs和no对局部血管舒缩调节具有重要作用。
5.cin的发病率因合并有慢性肾脏病（ckd）、糖尿病、高血压等的心血管患者人群数量增多而显著上升。对健康人群而言，由于肾脏的贮备能力和机体的代偿功能，使用造影剂后不容易对肾脏造成损害。
6.因此，既往关于造影剂肾病动物模型构建的实验中，大多采取各种措施预先对肾脏造成一定的损伤，以增加肾脏对造影剂损伤的易感性，也能更好的模拟临床实际。
7.目前关于构建实验用造影剂肾病动物模型的方法众多，从实验动物、造影剂种类、造模前干预药物的选择都不尽相同。常用的实验动物有sd大鼠、c57bl/6j小鼠，少数使用家兔、狗、猪等。造影剂根据其物理性质，分为高渗离子型（泛影葡胺）、等渗非离子型（碘克沙醇）、低渗非离子型（碘海醇、碘佛醇等）三类。目前动物模型构建常选用等渗性或低渗性造影剂，高渗造影剂少有使用。临床工作中，需要行冠脉检查的患者多数合并有一定的基础病，为更好地模拟临床实际，增加动物造模成功率，多会在造影剂给药前通过药物或手术方式提前干预。
8.动物造模前干预可大致分为：1.肾毒性药物运用。如庆大霉素、甘油等，此类药物毒性大，最终导致的肾脏功能损伤难以区别由于造影剂所致损伤还是单纯药物导致，此方法已较少使用。
9.2.脱水预处理。研究证实，脱水状态是造影剂肾病的危险因素，因此常采用禁水、呋塞米利尿联合处理的方式，但是脱水可能会影响实验动物进食，导致肌酐、尿素氮水平波动。同时过量利尿可能会带来电解质代谢紊乱，从而对实验结果产生混杂因素影响。
10.3.手术切除部分肾脏。有部分研究采用造模前通过手术切除单侧肾脏，同时结扎对侧肾脏部分肾血管，可模拟临床慢性肾功能不全患者肾脏的高灌注、高滤过状态，增加对造影剂损伤的敏感性。但此类方法对实验动物损伤较大，手术处理要求苛刻，过程繁琐，不便于推广。
11.4.预先建立糖尿病模型。通常采用高脂饮食饲养后，予以链脲佐菌素处理选择性破坏胰岛细胞，使得实验动物血糖长期处于较高水平，较好模拟了临床上合并后糖尿病病史的患者。但由于糖尿病模型构建的实验周期较长，单纯为构建造影剂肾病模型而采用此类方法预处理的并不多。


技术实现要素：

12.本技术为了解决上述技术问题提供一种小鼠造影剂肾病模型及其构建方法，运用前列腺素抑制剂吲哚美辛（indomethacin，以下简称indo）和一氧化氮合成酶抑制剂亚硝基左旋精氨酸甲酯（l-name）干预，使小鼠肾脏皮质血管收缩，增加肾脏对造影剂损伤的易感性，可较好的模拟临床上合并有基础疾病的患者，且不增加混杂因素对肾功能的影响，其次，小鼠饲养周期短且便于结合基因编辑等手段。
13.本技术通过下述技术方案实现：一种小鼠造影剂肾病模型的构建方法，包括以下步骤：s1，对小鼠禁水；s2，给步骤s1禁水后的小鼠注射肾血管收缩药物；s3，给步骤s2预处理后的小鼠注射造影剂，得到所述造影剂肾病模型。
14.进一步的，所述步骤s1中，禁水时间为24h。
15.进一步的，所述步骤s2中采用腹腔注射；所述步骤s2与步骤s3之间的间隔时间为15min。现有肾血管收缩药物的注射一般采用尾静脉注射，但由于小鼠的尾部一般较细小，因此采用尾静脉注射时往往要求操作者具有较高的专业基础。相对来说，腹腔注射比尾静脉注射的难度低很多，对操作者的要求也低很多。
16.优选地，所述肾血管收缩药物包括前列腺素抑制剂和一氧化氮合成酶抑制剂。
17.进一步的，所述前列腺素抑制剂包括吲哚美辛，所述一氧化氮合成酶抑制剂包括亚硝基左旋精氨酸甲酯。
18.进一步的，所述前列腺素抑制剂还包括dmso溶液、生理盐水，所述吲哚美辛的浓度为2.5 mg/ml；所述一氧化氮合成酶抑制剂还包括生理盐水，所述亚硝基左旋精氨酸甲酯的浓度为4 mg/ml。
19.进一步的，所述步骤s2中，注射前列腺素抑制剂和一氧化氮合成酶抑制剂的前后
间隔时间为15min。
20.优选地，所述前列腺素抑制剂的注射剂量为4 ml/kg体重，所述一氧化氮合成酶抑制剂的注射剂量为2.5 ml/kg体重。
21.进一步的，所述造影剂包括碘克沙醇；所述碘克沙醇的注射剂量为10 ml/kg体重。
22.本发明还提供一种小鼠造影剂肾病模型，所述小鼠造影剂肾病模型根据上述小鼠造影剂肾病模型的构建方法构建得到。
23.与现有技术相比，本技术具有以下有益效果：本发明采用肾血管收缩药物预处理以构建造影剂肾病模型，具有操作简便、动物损伤小、可重复性高等优点。本技术中，在动物模型评判指标上，采用肾脏功能学联合形态学评分双重标准作为判断和评价建模成功的指标。
24.通过观察各实验组肾小管损伤程度，进行量化评分，同时对比各实验组小鼠肾小管细胞凋亡比例及ros水平，发现吲哚美辛联合亚硝基左旋精氨酸甲酯干预后再予以碘克沙醇尾静脉注射，小鼠的肌酐和尿素氮明显升高水平达到了造影剂肾病的诊断标准，同时肾小管损伤程度、凋亡率和氧化应激水平均高于对照组，成功建立造影剂肾病小鼠模型。
附图说明
25.此处所说明的附图用来提供对本技术实施方式的进一步理解，构成本技术的一部分，并不构成对本发明实施方式的限定。
26.图1中a是空白对照组小鼠实验的药物干预流程示意图，b是造影剂组小鼠实验的药物干预流程示意图，c是药物组小鼠实验的药物干预流程示意图，d是模型组小鼠实验的药物干预流程示意图；图2中a是各实验组肌酐含量变化示意图，b是各实验组尿素氮含量变化示意图；图3中a是空白对照组小鼠肾小管组织h&e染色结果示意图，b是造影剂组小鼠肾小管组织h&e染色结果示意图，c是药物组小鼠肾小管组织h&e染色结果示意图，d是模型组小鼠肾小管组织h&e染色结果示意图，e是空白对照组小鼠肾小管组织h&e染色结果局部放大示意图，f是造影剂组小鼠肾小管组织h&e染色结果局部放大示意图，g是药物组小鼠肾小管组织h&e染色结果局部放大示意图，h是模型组小鼠肾小管组织h&e染色结果局部放大示意图；图4是各实验组肾小管组织损伤程度评分示意图；图5中a是空白对照组小鼠肾脏组织dhe染色结果示意图，b是造影剂组小鼠肾脏组织dhe染色结果示意图，c是药物组小鼠肾脏组织dhe染色结果示意图，d是模型组小鼠肾脏组织dhe染色结果示意图，e是空白对照组小鼠肾脏组织dapi染色结果示意图，f是造影剂组小鼠肾脏组织dapi染色结果示意图，g是药物组小鼠肾脏组织dapi染色结果示意图，h是模型组小鼠肾脏组织dapi染色结果示意图，i是空白对照组小鼠肾脏组织dhe和dapi混合染色结果示意图，j是造影剂组小鼠肾脏组织dhe和dapi混合染色结果示意图，k是药物组小鼠肾脏组织dhe和dapi混合染色结果示意图，l是模型组小鼠肾脏组织dhe和dapi混合染色结果示意图；图6是各实验组肾脏组织dhe荧光强度；图7中a是空白对照组小鼠肾脏组织tunel染色结果示意图，b是造影剂组小鼠肾脏
组织tunel染色结果示意图，c是药物组小鼠肾脏组织tunel染色结果示意图，d是模型组小鼠肾脏组织tunel染色结果示意图，e是空白对照组小鼠肾脏组织dapi染色结果示意图，f是造影剂组小鼠肾脏组织dapi染色结果示意图，g是药物组小鼠肾脏组织dapi染色结果示意图，h是模型组小鼠肾脏组织dapi染色结果示意图，i是空白对照组小鼠肾脏组织tunel和dapi染色结果示意图，j是造影剂组小鼠肾脏组织tunel和dapi混合染色结果示意图，k是药物组小鼠肾脏组织tunel和dapi混合染色结果示意图，l是模型组小鼠肾脏组织tunel和dapi混合染色结果示意图；图8是各实验组肾脏组织凋亡细胞比率。
具体实施方式
27.为使本技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将结合实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施方式的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
28.实施例一1.实验动物及分组6-8周龄遗传背景为c57bl/6j的雄性小鼠，共20只，体重20-25g，购自成都达硕实验动物有限公司，饲养于成都医学院科研实验中心spf级动物房内，温度控制在25℃。适应性喂养1周后，随机分为空白对照组（control）、造影剂组（cm）、药物组（indo+l-name）、模型组（indo+l-name+cm），每组5只。
29.2.主要实验试剂配制（1）吲哚美辛溶液配制：称取50 mg吲哚美辛固体粉末，加入1 ml dmso溶解制成预溶液，适当加入浓度为5%的nahco3溶液稀释，随后加入生理盐水定容至20 ml，配制成浓度为2.5 mg/ml溶液备用。
30.（2）亚硝基左旋精氨酸甲酯溶液配制：称取亚硝基左旋精氨酸甲酯粉末40 mg，加入生理盐水定容至10 ml，配制成浓度为4 mg/ml的溶液置于4℃避光保存备用。
31.3.实验方法（1）造影剂肾病小鼠模型构建上述4组小鼠实验的药物干预流程如图1所示：control组：不加任何干预，自由进食水，48h后收集血液及肾脏标本。
32.cm组：造影剂干预前禁水24h，不禁食。然后分别间隔15min从腹腔依次注射等量磷酸缓冲液（4 ml/kg）和生理盐水（2.5 ml/kg。15分钟后，将小鼠用固定器固定，充分暴露消毒尾部皮肤，一手固定小鼠尾尖，从一侧尾静脉注入碘克沙醇注射液（10 ml/kg，5min内缓慢推注）。此后，小鼠回笼，继续禁水。24h后小鼠眼眶采血离心获取血清并取下肾脏标本固定。
33.indo+l-name组：造影剂干预前禁水24h，不禁食。然后分别间隔15分钟从腹腔依次注射吲哚美辛（10 mg/kg，4 ml/kg）、亚硝基左旋精氨酸甲酯（10 mg/kg，2.5 ml/kg）。15min后，将小鼠用固定器固定，充分暴露消毒尾部皮肤，一手固定小鼠尾尖，从一侧尾静脉注入生理盐水（10 ml/kg）。此后，小鼠回笼，继续禁水。24 h后小鼠眼眶采血离心获取血清并取
下肾脏标本固定。
34.indo+l-name+cm组：造影剂干预前禁水24h，不禁食。然后分别间隔15分钟从腹腔依次注射吲哚美辛（10 mg/kg，4 ml/kg）、亚硝基左旋精氨酸甲酯（10 mg/kg，2.5 ml/kg）。15min后，将小鼠用固定器固定，充分暴露消毒尾部皮肤，一手固定小鼠尾尖，从一侧尾静脉注入碘克沙醇注射液（10 ml/kg，5 min内缓慢推注）。此后，小鼠回笼，继续禁水。24 h后小鼠眼眶采血离心获取血清并取下肾脏标本固定。
35.（2）血清肌酐、尿素氮测定药物干预24h后，予以少量异氟烷诱导麻醉各组小鼠，以10%水合氯醛腹腔注射全身麻醉，剪去小鼠双侧胡须，单手固定小鼠，食指拇指绷紧小鼠一侧眼周皮肤，充分暴露眼球，组织镊摘除小鼠眼球，采血约1 ml后采用颈椎脱臼法处死小鼠。
36.采取血液置于离心机离心20℃（3000r，15 min），离心后取血清于ep管中置于4℃保存备用。使用小鼠血清肌酐及尿素氮试剂盒测定血肌酐、尿素氮水平。
37.对照孔加入显色剂a、显色剂b和终止液；标准品孔，加标准品50
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l，后加入辣根过氧化物酶100
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l；样本孔加血清50
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l，辣根过氧化物酶100
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l，盖膜混匀，37℃孵育60 min。去封板膜，弃去液体，加洗涤液，静置1 min，重复5次。每孔先加入底物液a 50
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l，再加入底物液b 50
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l，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15 min。加终止液50
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l终止反应。置于酶标仪，波长450 nm，测各孔的吸光度（od值）。
38.（3）肾脏组织病理形态学观察i．肾脏病理切片的制作：
①
取材与固定：将眼眶采血完毕后的小鼠，颈椎脱臼处死，固定于自制的解剖板上，充分暴露小鼠腹部。剪去腹部毛发备皮，酒精消毒。镊子夹起下腹部皮肤，组织剪打开腹壁，暴露腹腔。找到肾脏，离断肾脏血管及周围组织，取出肾脏，pbs冲洗干净，手术镊小心分离肾脏表面包膜，再次用pbs冲洗，一侧肾脏按一定厚度纵行分割后置于4%多聚甲醛固定，一侧肾脏冷冻保存制作冰冻切片。
39.②
脱水：75%酒精4 h，85%酒精2h，95%酒精1 h，100%酒精0.5 h，100%酒精0.5 h，100%酒精0.5 h，100%酒精0.5 h。
40.③
透明：二甲苯10 min，二甲苯10 min。
41.④
浸蜡：石蜡1 h，石蜡2 h，石蜡3 h。
42.⑤
包埋：提前融化石蜡，备好模具，将浸润好的肾脏组织标本放入模具中，加入融化的石蜡，置于-20℃上冷却后将石蜡切割成单个蜡块。
43.⑥
切片：以5
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m厚度依次切片，烘片，编号备用。
44.ii．苏木素-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，h&e染色）：苏木精染色15 min；水洗3 min；分化液分化10s；水洗3 min；放入50℃的温水，直到蓝色显色；清水冲洗3 min；85%的酒精5 min；伊红染色5 min；水洗5s；依次梯度酒精脱水处理；二甲苯透明封片。
45.iii．于400倍光镜下随机观察每个切片样本的5个视野范围，根据paller法对肾小管间质损伤程度进行评分量化。
46.评分标准为：肾小管上皮细胞颗粒样变性记1分；空泡样变性记1分；小管上皮细胞出现核固缩记1分；肾小管明显扩张或肾小管上皮细胞扁平记1分；肾小管刷状缘损伤记1分，刷状缘脱落记2分；管腔内出现脱落或坏死的细胞，未形成管型记1分，若有管型记2分。
47.（4）肾脏组织tunel荧光染色
①
切片固定：取前期制作的冰冻切片，复温晾干，冷丙酮固定10min，待丙酮晾干后于pbs洗涤3次，每次5min。
48.②
修复：用免疫组化笔在切片上组织周围画圈，防止液体流失，滴加蛋白酶k工作液，37℃孵育25min。将玻片置于pbs中洗涤3次，每次5min。
49.③
破膜：切片甩干滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于pbs中洗涤3次，每次5min。
50.④
加试剂：按1：9的比例将试剂盒中试剂1（tdt）和试剂2（dutp）混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃孵育2h。
51.⑤
dapi复染：切片用pbs洗涤3次，每次5min。去除pbs滴加dapi染液，避光室温孵育10min。
52.⑥
封片：玻片置于pbs中洗涤3次，抗荧光淬灭剂封片。
53.⑦
镜检：荧光显微镜下观察并采集。
54.（5）肾脏组织dhe荧光染色i．试剂配制：
①
用纯水将dhe探针稀释100-200倍，配成染色液。
55.②
用纯水将清洗液稀释10倍。
56.ii．探针标记：
②
准备厚约5
µ
m的肾脏组织冰冻切片。
57.②
加上200
µ
l清洗液工作液，铺满切片表面，静置3-5min。
58.③
吸除清洗液，滴加100
µ
l染色液，37℃培养箱避光孵育40分钟。
59.④
去除染色液，pbs清洗切片，盖盖玻片。
60.⑤
荧光显微镜观察并采集。
61.4.统计学处理采用spss22.0进行实验数据处理与分析。实验所得计量数据用均数
±
标准差（x
±
s）表示，进行正态分布检验与方差齐性检验，两组间数据比较采用独立样本t检验，两组以上采用单因素方差分析（one-wayanova），以p《0.05为差异有统计学意义。
62.5.药物预处理联合碘克沙醇导致急性肾功能损伤如图2所示，control组肌酐和尿素氮水平分别为（43.6
±
6.5
µ
mol/l）、（5.8
±
1.92mmol/l），indo+l-name+cm组肌酐和尿素氮水平分别为（90.4
±
3.43
µ
mol/l）、（18.4
±
1.67mmol/l）。
63.与cm组相比，indo+l-name+cm组肌酐和尿素氮明显升高（p＜0.01），肌酐水平较基线值升高大于0.3mg/dl（26.5
µ
mol/l），达到cin诊断标准。而control组、cm组及indo+cm组组间肌酐及尿素氮水平无统计学差异（p＞0.05）。
64.综上所述，在脱水后直接予以造影剂干预、脱水后单纯予以缩血管药物干预未能导致小鼠肌酐和尿素氮水平发生显著改变。而预先药物干预后再给予造影剂，使小鼠血清肌酐水平升高超过0.3mg/dl（26.5μmol/l），达到造影剂肾病诊断标准。
65.6.药物预处理联合碘克沙醇导致肾脏形态学损伤control组：肾脏组织肾小管上皮细胞排列规整，细胞充盈饱满，未见明显损伤。
66.cm组：存在极个别肾小管上皮细胞出现类似空泡样变性，肾小管整体排列尚规整，损伤不明显。
67.indo+l-name组：肾小管上皮细胞排列整齐，未见明显损伤。
68.indo+l-name+cm组：肾组织改变明显，受损部位集中皮髓质交界区域，可见较大范围肾小管上皮细胞泡沫样变性，细胞扁平脱落，基底膜裸露，部分官腔扩张，未见明显纤维化改变（如图3所示，图中红色箭头所示肾小管上皮细胞空泡样变性）。
69.结合图4，按照评分标准，control组损伤评分为0.16
±
0.08；indo+l-name+cm组评分为3.92
±
0.22。
70.对各组损伤评分进行统计学分析发现，与cm组相比，indo+l-name+cm组肾脏组织损伤明显加重，差异有统计学意义（p＜0.01）。control组、cm组与indo+l-name组间肾脏损伤评分无显著差异（p＞0.05）。
71.综上所述，模型组（indo+l-name+cm）肾小管组织损伤程度明显高于空白对照组（control）。
72.7.药物预处理联合碘克沙醇导致肾脏ros水平升高结合图5-图6，肾脏组织dhe染色显示表明，cm组与control组相比，ros水平有一定程度升高，差异有统计学意义（p＜0.01）。indo+l-name组与control组相比无明显差异（p＞0.05）。与cm组相比，indo+l-name+cm组ros水平明显增加，差异有统计学意义（p＜0.01）。
73.综上所述，模型组（indo+l-name+cm）氧化应激水平明显高于空白对照组（control）。
74.8.药物预处理联合碘克沙醇导致肾小管上皮细胞凋亡增加如图7-8所示，肾脏组织tunel荧光染色显示表明，与control组相比，cm组及indo+l-name+cm组肾脏组织出现肾小管上皮细胞凋亡数增加，其中以indo+l-name+cm组凋亡细胞数增加最为明显。
75.通过对各实验组小鼠肾小管凋亡细胞比率进行统计学分析发现，相较于control组（0.30
±
0.33%），cm组（3.41
±
0.68%）凋亡细胞有所增加（p＜0.05），indo+l-name组（1.36
±
0.48%）与control组相比细胞凋亡率无统计学差异（p＞0.05），indo+l-name+cm组（27.88
±
2.69%）与cm组相比，细胞凋亡率明显增加（p＜0.01）综上所述，模型组（indo+l-name+cm）肾小管上皮细胞凋亡率明显高于空白对照组（control）。
76.本技术中，在动物模型评判指标上，采用肾脏功能学联合形态学评分双重标准作为判断和评价建模成功的指标。通过观察各实验组肾小管损伤程度，进行量化评分，同时对比各实验组小鼠肾小管细胞凋亡比例及ros水平，发现吲哚美辛联合亚硝基左旋精氨酸甲酯干预后再予以碘克沙醇尾静脉注射，小鼠的肌酐和尿素氮明显升高水平达到了造影剂肾病的诊断标准，同时肾小管损伤程度、凋亡率和氧化应激水平均高于对照组。
77.综上，造影剂干预前禁水24h，然后予以缩血管药物吲哚美辛和亚硝基左旋精氨酸甲酯预处理，再通过尾静脉注射碘克沙醇注射液，可使小鼠血清肌酐水平升高超过0.3 mg/dl（26.5 μmol/l），达到造影剂肾病诊断标准，本技术成功建立造影剂肾病小鼠模型。
78.以上的具体实施方式，对本技术的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范
围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。