Channel	Gene	Chromosome	TTxsensitivity	Main tissue distribution
Nav1.1	SCN1A	2q23-24	Yes	CNS
Nav1.2	SCN2A	2q23-24	Yes	CNS
Nav1.3	SCN3A	2q23-24	Yes	CNS(embryonic)
Nav1.4	SCN4A	17q23-25	Yes	skeletal muscle
Nav1.5	SCN5A	3q21-24	No	Heart muscle
Nav1.6	SCN8A	12q13	Yes	CNS (neuron,glia),PNS
Nav1.7	sCN9A	2q23-24	Yes	PNS (neuron, Schwan).endocrine cells
Nav1.8	sCN10A	3q21-24	No	PNS
Nav1.9	SCN11A	3q21-24	No	PNS

NaV匝道的命名及组织分布概述。(TTX= Tetrodotoxin，CNS - central nervous system, PNS = peripheral nervous system)

离子通道功能的异常会导致癫痫、疼痛综合征、阿兹海默症及心脏疾病等病症的发生。如编码Nav1.1离子通道的SCN1A基因发生突变会引起该离子通道失活或复活的异常改变，最终导致中枢神经系统兴奋性异常改变，也就是我们熟知的癫痫疾病。

为了治疗这种由基因突变引起的疾病，我们通常会用到基因治疗的相关手段。在医学和药学领域，基因治疗可以被认为是一次全新革命，随着越来越多的基因治疗产品的上市，基因治疗技术也即将迎来高速发展期。根据Global Data的数据可知，基因治疗的临床实验数量近6年来热度持续高涨。

 

2001年~2021年来，基因治疗在全部临床实验中占比
（数据来源：GlobalData数据库）△点击放大图片

病毒载体做为最常见的基因治疗手段，通过病毒（如逆转录病毒RV、腺相关病毒AAV、慢病毒LV）作为基因材料的载体，将治疗性基因导入人体细胞。如下图所示，将带有SCN1A基因的腺病毒载体注入患有癫痫症的小鼠脑中，可以有效增加Nav1.1通道上蛋白的表达量。
 

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除此之外，小核酸药物（如反义寡核苷酸ASO、siRNA、miRNA等）也是近期热点之一。小核酸药物通过与靶mRNA结合，抑制靶基因的表达，达到靶向精准调节目标蛋白水平。如下图所示，左图是未经过干扰的野生型小鼠体内正常的蛋白生成过程，真核细胞中会出现无意义介导的mRNA降解（NMD）的监督机制，帮助宿主细胞破坏含有早发性无义突变（PTCs）的mRNA。因此在基因剪接过程后，产生无法翻译成蛋白的non-productive mRNA。

右图则是给药之后的翻译过程，反义寡核苷酸会与pre-mRNA中含有PTCs的区域相结合，因此抑制该片段的表达，在剪接过程之后，生成正常的mRNA，从而增加目标蛋白的表达量。
 

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看到这里，你是不是对Na+通道疾病的基因治疗手段这个话题越来越感兴趣了呢？
 
接下来小编就基于两篇文献，为大家剖析一下以上两种不同的基因相关治疗手段，对于癫痫疾病治疗的研究思路。

PART ONE：反义寡核苷酸通过增加Scn1a基因的表达并降低癫痫的发作率与猝死率
 

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研究背景：
反义寡核苷酸（Antisense oligonucleotides, ASO）可以在人类细胞系及小鼠大脑中，靶向精准上调可正常翻译的Scn1a转录本并增加Nav1.1蛋白表达。该实验结果给癫痫疾病提供了一种gene-specific的治疗手段

图1.1展示了本文的底层研究逻辑，图A是未经给药的癫痫小鼠体内NaV1.1蛋白合成的模型，图B则是注射ASO后的模型。治疗性ASO加入后，通过排除NMD外显子，使得无法正常翻译成靶蛋白的NMD 外显子mRNA转化成可以正常翻译的mRNA（图C）
 
 

图1.1 该文献研究原理示意图

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研究思路：
作者通过in vivo和in vitro两个方面来验证反义寡核苷酸（ASO）对癫痫（DS）小鼠的治疗作用。

1.    ASO的筛选，EC50值的确定及特异性验证（in vivo）
由于ASO有不同的基因序列，因此作者选择了47种不同序列的ASOs来进行最佳活性筛选（图1.2）。这些ASOs会与人类SCN1A 20号外显子及基因内周边的序列相结合，使用RT-PCR进行扩增后（图1.2A），通过密度测定法检测出不同PCR产物的含量（图1.2B），接着通过绿色荧光定量PCR测定人类神经干细胞中正常Scn1a mRNA的表达量（图1.3C）。结果显示标有红色箭头的22号ASO（ASO-22）有着最佳的活性。 

 

图1.2-选定的ASOs抑制NMD剪接事件，并增加ReNcells中生成SCN1A mRNA的表达。
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接着，作者分别使用两种转染方式：直接转染，电转染试剂盒转染（Lonza），绘制出了ASO-22的浓度与基因表达量的曲线图，以确定其EC50值。可看出使用电转染试剂盒的EC50值比直接转染的低。
 

图1.3-神经干细胞中ASO-22剂量与基因表达量的关系。（直接转染EC50=3μM；电转试剂盒EC50=514nM）
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作者同时也针对ASO-22与SCN1A基因的特异性作用进行了研究，证明其不会干扰其他钠离子通道亚型相关基因（SCN2A、SCN3A、SCN8A、SCN9A）的表达。经直接转染不同浓度的ASO-22后，人类神经干细胞中SCN2A、SCN3A、SCN8A或SCN9A的表达均未见改变。

 

图1.4- SCN2A、SCN3A、SCN8A或SCN9A基因分别与不同浓度的ASO-22或不同浓度的对照组自由转染时，不存在差异。
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结论1：in vivo，ASO-22可以有效且特异性地增强SCN1A mRNA在人类神经祖细胞中的生成

2.    验证ASO-22是否可以促进小鼠大脑中Scn1a mRNA和NaV1.1蛋白表达量的增加 （in vitro）
作者从三个角度全方位验证这个假设（1）剂量依赖性（2）特异性（3）持续作用性：

2.1为了证明ASO-22的给药能否上调可正常翻译的mRNA及Nav1.1蛋白在小鼠体内的含量，且剂量大小是否对上调效果有影响，作者构建了以下实验方案：

 

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随着ASO-22剂量的增加，含有NMD外显子的Scn1a转录本含量降低，且可正常翻译蛋白的Scn1a转录本的含量增高，因此也得到对应的结果：Nav1.1蛋白的表达量在一定范围内随着ASO-22剂量的增加而增加（图1.6）。
WB是最常用的钠离子通道蛋白定量方法，但有时候传统WB方法可能无法满足高灵敏性、高准确性、低误差性的实验需求，而本文使用的电化学发光方法（ECL）（图1.6D）却可以很好的满足这些需求。我们有另一篇文章专门介绍到如何用MSD-ECL方法定量检测Nav1.1蛋白，里面包括详细步骤及分析数据的方法，请点击链接跳转查看。

 

图1.5-ASO-22剂量的多少可在一定范围内影响各转录本及Nav1.1蛋白在小鼠体内表达量的多少。
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2.2  ASO-22特异性作用的验证与2.1中的小鼠实验方案（图1.5）一致，可以发现：小鼠大脑中另外8个VGSC亚基基因及Scn7a基因并不会受到ASO-22注射的影响，这与in vivo的结果保持一致（图1.4）。
 

图1.6- 通过probe-based qPCR检测后，ASO-22与Scn1a转录本的特异性得到验证
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2.3 接着，为了研究ASO-22对于小鼠脑组织的持续性作用，作者又构建了另一个实验方案：
 

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分别使用qPCR和电化学发光法（MSD-ECL）绘制不同时期Scn1a 转录本和Nav1.1蛋白的表达量曲线，结果表明小鼠在出生后30天内，Scn1a 转录本和Nav1.1蛋白的表达量与阴性对照组相比均维持在较高的水平。

   

图1.7-ASO-22的效果在小鼠出生后的30天内均可维持。
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结论2：In vitro，ASO-22可以特异性、持续性地增强小鼠脑中SCN1A mRNA和Nav1.1蛋白的表达量，且表达量的多少会受到剂量的大小的影响。 

3.    ASO是否可以降低癫痫（DS）小鼠的癫痫发作频率和猝死率（in vitro）
在这部分实验中，作者使用患有DS的小鼠模型（Scn1a+/-）进行研究，自然情况下，这类小鼠有50%的癫痫猝死率。

3.1 首先作者利用以下研究方案，通过对（1）小鼠存活率，（2）脑组织中ASO-22的剩余量，（3）Scn1a基因的表达量，（4）Nav1.1的表达量四个指标的研究2，探究ASO-22对DS小鼠癫痫猝死率

 

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ASO-22使DS小鼠有高达97%的存活率，且能持续存活90天；而阴性对照（PBS）小鼠仅有23%的存活率（图1.8）。
 

图1.8-野生型及DS型小鼠在PBS和ASO-22作用下的Kaplan-Meier生存曲线
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在第7和第14周时，小鼠脑组织中仍能检测到很高的ASO残留量，说明ASO可以稳定持续作用；与注射pbs的Wild Type小鼠相比，注射ASO的Wild Type小鼠大脑中Scn1a的基因表达增加；在注射ASO的DS小鼠大脑中，NaV1.1蛋白的表达增加，且增加量与WT小鼠几乎没有区别（图1.9）。

 

图1.9-在ASO和pbs处理的DS小鼠大脑中比较ASO-22残留量、靶基因和NaV1.1蛋白表达量
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3.2 为了验证ASO-22在小鼠癫痫发作的行为上是否有积极作用，作者建立了另一个研究方案（如下图），在小鼠脑部植入了脑电图装置，并记录其癫痫发作次数及脑电波。
 

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总体上，注射ASO-22的DS小鼠发生癫痫反应的次数比阴性对照组显著性降低（B），且癫痫再次发作的周期显著拉长（C）。正常状态下，ASO-22处理的DS小鼠的脑电图与WT小鼠的正常脑电图相似；即使小鼠癫痫发作时，与pbs处理的DS小鼠相比，ASO-22处理过的DS小鼠的癫痫发作幅度、心电图的突刺含量和持续时间均有明显的降低。
 

图1.10-注射ASO-22后， DS小鼠的癫痫发作次数减少，且其再次癫痫发作的潜伏期拉长。
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结论3：ASO可以增加DS小鼠NaV1.1蛋白的表达量，并降低癫痫发作和癫痫猝死的发生率

PART TWO利用装载SCN1A基因的腺相关病毒载体，改善癫痫小鼠癫痫行为表现
 

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研究背景：
80%的癫痫是由SCN1A基因的单倍体剂量不足（haploinsufficiency）引起的。作者使用一种high capacity adenoviral vector（HC-AdVs）作为补充SCN1A基因的病毒载体，在DS小鼠体内增加Nav1.1的表达含量。结果证实了基因补充对癫痫病症治疗的可行性。

研究思路：
1.    对质粒进行密码子优化
为了获得最优的靶蛋白表达量，首先要对质粒的密码子进行优化。作者尝试了三种常见的调控序列：CMV-SCN1A, CAG-SCN1A和EF1α-SCN1A-eGFP（图2.1A)。接着通过在内源性Nav1.1水平较低的HEK-293细胞中对质粒进行转染，证实了质粒的密码子优化可以有效的提高SCN1A mRNA的生成量（图2.1B）。而通过WB和IF实验，也可发现经过密码子优化的实验组能达到更高的Nav1.1的表达水平（图2.1C-D）。

 

图2.1 - 通过qRT-PCR，WB及IF均可证实密码子的优化可以有效提高SCN1A mRNA的生成量。
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结论1：密码子的优化可以增强SCN1A cDNA的稳定性，并使得Nav1.1离子通道进行正常的功能性的表达

2.    验证HC-AdVs是否可以作为靶基因载体
CAG-SCN1A和EF1α-SCN1A-eGFP均可与HC-AdV成功整合，并生成装载后的病毒载体HCA-CAG-SCN1A和HCA-EF-SCN1A-GFP（图2.2A）。为了进一步验证该转基因产物的功能，使用HCA-EF-SCN1A-GFP载体感染HEK-293细胞后，测量其钠离子电流的通量。被感染的细胞中能检测到很明显的钠离子电流通量，且当使用Nav1.1通道激活剂时，钠离子电流显著增强。

 

图2.2 - 对SCN1A转基因产物的功能性进行验证。
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接着，作者还将两种病毒载体分别对SH-SY5Y细胞和从小鼠脑神经细胞感染，并发现载体剂量的大小会影响SCN1A mRNA和Nav1.1的表达量。并可进一步得到结论：装载着CAG启动子的病毒有着更高的表达量，因此使用病毒载体HCA-CAG-SCN1A将更有利于后期实验的进行。

 

Figure2.3 - Nav1.1的表达量
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结论2：HC-AdVs作为载体可以正常表达靶基因SCN1A，且HCA-CAG-SCN1A因其更高的蛋白表达量将被用作后续实验的载体。

3.    判断病毒载体在小鼠大脑中的最佳注射部位
作者对Wild Type小鼠进行了生物分布实验，以确定载体自给药部位进入小鼠体内后到达靶器官的最佳途径。通过含有Ad-CAG-GFPLuc的病毒载体，在小鼠体内表达带有GFP-Luciferase标签的融合蛋白。对不同部位（大脑皮质、海马体、基底神经节、小脑等）进行注射后，蛋白的分布情况如图2.4。

 

Figure2.4 – BLI及IF结果显示在基底神经节（BG）和小脑（Cb）进行注射时蛋白分布范围较大。
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结论3：基底神经节（BG）和小脑（Cb）是病毒载体的最佳注射位置。

4．Scn1A的补充对功能性Nav1.1蛋白的表达量及发作间期癫痫样放电波(IEDs)的的影响
用电生理记录仪对各实验组小鼠的IEDs进行测量，可以发现注射高剂量SCN1A实验组IEDs含量显著减少，而低剂量实验组减少效果并不明显（图2.5 A）。同时结合Nav1.1蛋白的IF实验结果，也可以得到相似的结论（图2.5B）。可以说明通过对DS小鼠注射含有SCN1A的病毒载体，Nav1.1通道的功能得到部分恢复。
接着，作者为了确定被感染细胞的类型，将Nav1.1分别与神经元marker和星型胶质marker进行协同染色。结果表明神经元细胞和星型胶质细胞的感染率分别为1.65%和9.71%，说明在神经元细胞比例相对较低的组织中（如BG）补充SCN1A可以更显著地降低致癫痫的可能性。

 

Figure2.5 –DS小鼠脑内注射HCA-CAG-SCN1A可提高功能性Nav1.1的表达。
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结论4：SCN1A的补充可以提高DS小鼠脑组织中功能性Nav1.1蛋白的表达量与并减少其发作间期癫痫样放电波(IEDs)

5．HCA-CAG-SCN1A载体对于癫痫症的治疗效果
    根据前期实验的结果，选择BG/Cb和BG/Cb/Pctx两种给药方法进行研究，可以发现这两种方法下的DS小鼠存活率的均显著提高，猝死率减少。在给药的一个月后，作者对小鼠进行了高温控制，以确定其癫痫发作温度阈值。只有同时获得BG/Cb/pCtx注射的小鼠对高温的耐受度显著增加，可见治疗热诱导性的癫痫发作，需要在小鼠体内进行更广泛的SCN1A基因表达。

 

Figure2.6 -脑内注射HCA-CAG-SCN1A可改善DS小鼠的存活率，并降低对热诱导性癫痫发作的敏感性  
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作者最后对癫痫的其他并发症，如运动行为、多动症及学习延迟等进行了研究。（A）长期空间视觉识别记忆；（B）任务学习能力；(C)过度活跃行为；(D)探索行为；(E)动物幸福感；(F)运动能力；(G)小脑协调性。

 

Figure2.7 - 脑内注射HCA-CAG-SCN1A可以改善青春期DS小鼠的运动技能和某些行为表现，但不能改善多动和学习表现。
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结论5：HCA-CAG-SCN1A的补充可以改善DS小鼠的运动技能和小脑协调性，但对于多动症和学习延迟的改善效果不显著。

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