dPCR，qPCR多通道问题解决方案

dPCR和qPCR技术平台在多基因检测领域被广泛使用，好的产品需要有好的性能参数，如优异的最低检测限、多仪器平台的通用性、前端客户操作便捷性、稳定的产品表现等。这些除了本身研发端技术实力外，好的原材料更是一大助力。

如下图多通道的qPCR实验中，Cy5通道的信号值比FAM要低很多，除了扩增曲线不好看之外，还经常发生其他的问题。比如基线期本底荧光信号值超过qPCR仪默认的阈值时会导致CT值计算和扩增曲线出现问题，从而降低了产品的仪器通用性。而追求稳定的最低检测限对△Rn的要求是越大越好。多通道qPCR还面临着荧光信号串道等问题。而在dPCR中本底和PCR后的荧光强度决定了最低检测限和在SNP分型中的分离效果。

无需优化序列和反应条件的情况下，百力格生物提供的超级淬灭探针可以直接帮助您解决实验中的这些问题。百力格自主开发的超级淬灭探针，3端标记独有的特殊淬灭基团，同时在序列中间增加一个淬灭基团，双重淬灭防护，阻止荧光泄露，保证更好的淬灭效果，同时开发特有的报告基团，解决荧光强度差异大的问题。

一、应用于qPCR

同一序列不同淬灭基团修饰荧光背景强度比较。试剂参考TaqMan™ Fast Advanced 预混液，以下实验数据使用实验仪器均为ABI 7500，实验反应体系20ul，实验扩增程序95°C3min；95°C 15s；60°C45s；共45 Cycles（注：探针使用1xTEBuffer溶解，探针溶解浓度为5uM）。

FAM 通道超级淬灭探针

非洲猪瘟AsFV-p72基因检测

绿色为FAM-SQ1；红色为FAM-BHQ1，FAM-SQ1荧光强度背景较低，荧光净值较高。

Cy5通道超级淬灭探针表现

新冠2019-nCOVO基因检测

蓝色为百力格生物BecuTM系列BF650-SQ2；红色为CY5-BHQ2。BF650-SQ2荧光强度背景较低，荧光净值较高，同时相同模板浓度下CT值更低。

百力格生物可以提供FAM、VIC、Cy5通道多种设备下的完美解决方案，可为客户优化多数多重qPCR检测体系。

二、应用于dPCR

百力格生物的超级淬灭探针在上海小海龟科技BioDigital•青数字PCR实测结果如下

图1 左5’FAM 3’BHQ1 右5’FAM 3’SQ1

图2，左5'VIC 3’BHQ1，右5VIC 3’SQ1

图3 ，左5’Cy5 3’BHQ2，右5’BF650 3’SQ2

普通Taqman探针与百力格超级淬灭探针数字PCR反应结果对比图（图1:为FAM通道对比结果，左侧为普通Taqman探针结果，右侧为超级淬灭探针结果；图2:为HEX通道对比结果，左侧为普通Taqman探针结果，右侧为超级淬灭探针结果；图3:为Cy5通道对比结果，左侧为普通Taqman探针结果，右侧为超级淬灭探针结果）

以上实验使用BioDigital•青数字PCR系统，结果显示：超级淬灭探针在FAM和Cy5通道，阴性信号均有显著降低，使数字PCR微液滴信号信噪比（S/N）较普通Taqman探针显著提高；超级淬灭探针在HEX通道，阴性信号强度没有影响，但阳性信号强度有所提升，使数字PCR微液滴信号信噪比（S/N）较普通Taqman探针也有显著提高。另外，三种超级淬灭探针荧光信号在数字PCR系统中无信号串扰和信号衰减。

三、产品特点

本底更低、性噪比更高、特异性更好、灵敏度更高、降低假阳性有效降低本底信号，且在探针序列由20nt 增加到40nt后，本底信号仅有微小增大。

• 高灵敏度qPCR检测：最低检测拷贝数下限至1拷贝
• 多重qPCR检测：有效的避免不同荧光通道的串道问题，减少假阳性
• AT-rich区域基因检测：设计更长的探针序列，以包含更多的基因信息，排除同源干扰
• 数字qPCR检测：更低的背景，提高检测灵敏度，检测下限至0.01%

大规格合成批次均一性检测

探针稳定性测试

关于百力格生物

百力格生物应用精益六西格玛（Lean-Six Sigma）管理方法，有着丰富管理与实践经验的黑带大师（Master Black Belt）亲自指导，通过ISO 9001及ISO 13485，严格执行ISO质控标准化体系，向全球分子诊断领域研究者提供高品质的产品与服务。

专注于分子诊断核心原料开发，致力生命科技，服务生命健康。

来源：百力格生物 | 供稿：Ryan

编辑：弋水 |校对：Miley | 责编：木霖森

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