「Protocol」小鼠肝脏巨噬细胞组成的精细分型

近年来，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的发病过程中，越来越多的研究发现肝脏存在巨噬细胞多样性明显增加。

在这里，Daemen S等人在STAR Protoc.为我们大家提供了一个详细的方案，用于分析非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和早期非酒精性脂肪性肝病(NASH)小鼠的肝巨噬细胞亚群。这些方法可以用来评估NASH过程中巨噬细胞亚群的组成和定位。整体流程如下：

其中的免疫荧光用于分析定位，我们这里只编译一下流式这一块的方法。

灌洗过之后的肝脏，血液冲洗干净了，局部的巨噬细胞会更纯粹。

这里只介绍肝组织处理和流式染色、分析步骤。

肝组织酶解离为单细胞悬浮液

本步骤描述了胶原酶A消化和差速离心肝组织制备单细胞悬液用于流式细胞术的过程。约需1.5小时。注：此步骤后得到的细胞悬液也可用于其他用途，例如流式分选、单RNA测序和/或体外功能分析。步骤可直接参考下图，很清楚：

流式抗体染色

约需2小时。这一步详细介绍了用流式细胞术对肝脏NPC（非实质细胞）进行染色以区分巨噬细胞各亚群(Kupffer细胞、单核细胞-KCs、肝脂相关巨噬细胞和单核细胞)的方法。关键标记包括CD45、CD11b、F4/80、TIM4、VSIG4、CLEC2、Ly6C和MHCII。

可选：根据实验需求，可以添加额外的标记，例如树突状细胞的CD11c、中性粒细胞的Ly6G和/或嗜酸性粒细胞的Siglec F。

注：该染色方案利用Zombie Aqua在表面标记染色之前评估细胞的存活/死亡状态，因此在步骤3中要求细胞悬液中不含BSA。也可以用DAPI区分死活细胞。对于DAPI染色，将染色细胞重新悬浮在1×DAPI溶液中的FACS缓冲液中。

1、用台式离心机在650×g、4℃离心3.5分钟。

2、如果细胞在含有BSA的缓冲液中，用不含BSA的PBS洗涤并重悬。

3、用100uLZombie Aqua溶液按1：250稀释度，在PBS中进行活/死细胞染色染色。置冰上避光孵育15分钟。

4、在细胞悬液中加入700uL FACS缓冲液洗涤细胞。650×g、4℃离心3.5分钟。去上清。

5、用10uL Fc阻断液将细胞重悬。在冰上避光孵育5分钟。

6、在细胞悬液中加入90微升抗体预混物。在冰上避光孵育至少45分钟(方案如下)。

7、在细胞悬液中加入700uL FACS缓冲液洗涤细胞。650×g、4℃离心3.5分钟。去上清。以300ul FACS缓冲液重悬，再次过滤。

8、上机获取。

设门步骤

(A)对CD45阳性细胞、活细胞和单细胞进行设门后，肝巨噬细胞可被鉴定为 F4/80 hi, CD11b int细胞(橙色门)。

(B)在标准饲料喂养的小鼠中，几乎所有的肝巨噬细胞都是常驻的TIM4 hi Kupffer细胞(绿色门)。相比之下，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠肝脏则有大量招募的TIM4 lo单核细胞来源的巨噬细胞(MDMs)(红框)。

(D)虽然大多数肝巨噬细胞是CLEC2 hi，但在TIM4lo、VSIG4lo MDMS中也可以鉴定出CLEC2lo亚群。这些CLEC2lo巨噬细胞表达高水平的CCR2/CX3CR1。

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