有害结局路径（AOP）：从毒性作用机制出发的化学品风险管理策略 以欧盟植物保护产品内分泌干扰评估为例

什么是AOP

有害结局路径（Adverse outcome pathway, AOP）对毒理学家和化学品监管员来说是一个时髦的新概念，此概念发展于2007年的21世纪毒理学愿景，并于2010年正式提出了AOP的概念框架。虽然这个框架本身的定义与结构是冗长而复杂的，可以简述为“用以描述已有的关于一个直接的分子起始事件（molecular initiating event, MIE）（如:外源化合物与特定生物大分子的相互作用）与在生物不同组织结构层次（如:细胞、器官、机体、群体）所出现的与危险度评定相关的"有害结局"之间的相互联系”，但是实际上，AOP的提出以来极大的简化了化学品的毒性评估流程，并使得从毒性作用机制出发的化学品风险管理策略成为了可能。

AOP最核心的内容在于规范化和模块化了从分子、细胞、组织、器官及至最终个体与群体水平的一系列毒性发生事件，并强调以逻辑推理性来确定这些毒性发生事件的前后关系。因为在AOP概念提出之前，毒理学研究的关注点是相对孤立的，例如离体（in vitro）研究主要关注于分子与细胞水平的毒性效应，而活体（in vivo）研究关注的重点则是在组织、器官及个体水平的有害损伤，造成这一现象的主要原因在于从分子至个体乃至群体水平的毒性发生的各个事件虽然相互交叉或前后关联，但整体来看则缺乏必要的统一性。而在AOP框架中，则要求采用证据权重（weight of evidence, WoE）的方式评估数据，确定毒性发生的各个事件，强调不同毒性过程（如致癌和内分泌干扰这两种不同的毒性过程）中类似的毒性事件（如细胞增殖）的一致性；另一方面也采用WoE的方式来关联不同毒性事件发生的前后顺序，强调从一个毒性事件推导至另一个毒性事件的逻辑性（如雌激素受体的激活导致的细胞增殖）。因此，AOP框架提出的即是以所谓的高内聚低耦合的模块化思想来完整拼出整个毒性发生过程。

AOP中关键概念

类似于作用机制（Mode of Action, MoA），一条典型的AOP也是基于系统综述研究数据后总结的，能够用于描述毒性通路和作用模式，但相比于MoA，AOP则更强调从分子至个体乃至种群水平的各个毒性事件的推演。其中，毒性事件可以具体分为分子起始事件（Molecular Initiating Event, MIE），关键事件（Key Events, KEs）和有害结局（Adverse Outcome, AO）这三大类，而各个过程则是通过关键事件关系（Key Event Relationships, KERs）进行连接。

AOP的概念可以类比于多米诺骨牌游戏，虽然MIE、KEs和AO都属于不同的事件，但它们之间发生的前后顺序是不同的，MIE强调的是分子层面的起始事件，如受体蛋白的激活、DNA损伤的发生等，因此MIE的发生是整个AOP的起点，类似于推倒第一张多米诺骨牌。而KE的发生则类似于其余骨牌接连倒下的连锁反应，随着MIE的激活后不同的KEs序贯进行，需要注意的是这些KEs的发生的层次是从分子水平至个体或群体水平依次递增的，如化合物暴露引起的某个MIE首先造成一系列的蛋白水平的级联反应、随后是细胞器的损伤、细胞的增殖或死亡、组织及器官损伤等，并最终关联至AOP的终点AO，如导致个体的损伤或死亡以及种群水平的改变等。而KERs则决定了不同毒性事件前后的发生顺序，以及由前一个毒性事件向下一个毒性事件发生的因果关系，而这种因果关系的判断则来源于生物学关联性、经验判断和定量分析三大方面。

整体而言，一条AOP的建立确定了毒性发生过程中各个独立的毒性事件（MIE、KEs和AO），以及毒性事件发生间的前后关系（KERs），从而将这些毒性事件模块化，能够应用或发展其他的AOP。正应如此，随着AOP概念的发展，AOPWiki网站（aopwiki.org）不仅收录了已建立的或正在发展的两百多条AOP，而且还模块化了众多KEs和KERs，从而能够基于这些KEs和KERs来进一步完善或构成其他AOP。

 AOP的收益与应用场景

不可否认的是AOP的概念及框架是复杂的，但实际上一条完整AOP的建立能够极大促进毒理学研究和简化化学品的风险评估流程。由于AOP的建立主要是通过WoE的方式总结研究数据而建立的，对于已建立和认可的AOP来说，这条AOP中各个毒性事件是经过验证后可识别或可检测的，同时它们之间的发生是具有可靠的因果关系。当对目标化合物进行毒理学研究或化学品风险评估中，我们仅需要对有限的已囊括于某条AOP的毒性事件展开试验即可推断出最终的毒性损伤效应，因而极大的减少了实验量。另一方面，由于AOP的建立层次是从分子水平乃至个体或群体水平依次递增的，且相互关联，因此我们可以根据以建立的AOP从低层次的（分子或细胞水平）毒性事件推断出高层次的（器官、个体或种群水平）毒性事件，而用于检测高层次的毒性事件的试验往往涉及动物实验，且费用高周期长，而低层次的毒性事则可以通过计算机模拟（in silico）和离体试验（in vitro）进行预测或检测，费用低且周期短，符合3R原则。所以AOP概念的建立在保证对化合物毒性评估的准确性和可靠性的基础上，减少了试验数量、周期和费用，并进一步保障了动物福利。

正因如此，AOP的概念当前已开始应用于化学品风险的监管评估、工业化学品的安全评估、新产品的发现与开发、医药卫生与环境质量检测等。而随着欧盟内分泌干扰物识别标准配套导则（Guidance for the identification of endocrine disruptor）在今年6月的发布，针对于欧盟植物保护产品（PPP）和欧盟消毒剂（BPR）的内分泌干扰评估已正式展开，而在此指南文件中也首次采用AOP的概念来对这些化学产品潜在的内分泌干扰效应进行评估。

基于AOP的欧盟植物保护产品（PPP）内分泌干扰评估

       欧盟的内分泌干扰识别导则中，针对于内分泌干扰的评估分为两个方面，首先是要根据广泛收集和系统评估的研究数据，来判断待评估的化合物是否同时具有内分泌干扰活性（endocrine activity）或与内分泌干扰相关有害损伤（adversity），然后再采用AOP的概念来判断由化合物引起的内分泌干扰活性与有害损伤的生物学关联性（biological plausibility）。而这种生物学关联性分析是整个欧盟植物保护产品（PPP）内分泌干扰评估的重点和难点，针对于当前已建立的一系列与内分泌干扰相关的AOP，导则中也已总结了相应的符合OECD GLP标准的不同层次的试验方法，从而在必要的情况下，可以根据有限的试验来完整的推断化合物潜在的内分泌干扰效应。而导则中也进一步推荐根据已建立的AOP，采用计算机模拟（in silico）或离体试验（in vitro）来获取用于内分泌干扰评估的数据。

       以在AOPwiki网站收录的一条与内分泌干扰相关的AOP为例：由拮抗雌激素受体导致的生殖功能紊乱（ID: AOP 30），该条AOP当前已基本建立完全，并已由EAGMST展开评估。此条AOP关联的是拮抗雌激素受体（ID: MIE 112）的内分泌干扰活性与引起鱼类种群水平的降低有害损伤（ID: AO 360），主要的关键事件依次包括降低肝中卵黄蛋白原的合成（ID: KE 285），降低血浆中卵黄蛋白原的浓度（ID: KE 221），降低了卵母细胞中卵黄蛋白原的积累并影响卵母细胞的生殖/发育（ID: KE 309）和降低鱼类的累积繁殖能力和产卵率（ID: KE 78），这些毒性事件如图所示也是通过KERs相互关联的。

依据此AOP，针对待测化合物的内分泌干扰展开评估，首先我们可以考虑计算机模拟或来源于高通量离体毒性数据库的试验结果来进行初步判断，导则中推荐的方法是方式ToxCast ER Bioactivity Model或者分子对接的QSAR方法，若不存在数据也可以通过离体实验（OECD TG 455）评估化合物是否具有对雌激素受体具有拮抗作用，这些试验结果都可以用来支持待评估化合物是否能够导致该条AOP中的MIE。而根据短期鱼类繁殖试验（OECD TG 229）可以进一步获取用于支持该条AOP关键事件（KEs），如卵黄蛋白的合成抑制、血浆中卵黄蛋白的浓度等。因此结合这两部分试验结果与已建立的AOP 30，我们可以在有限的试验基础上充分判断待评估的化合物是否具有潜在的内分泌干扰效应。

总结

随着农药等工业化学品在全球登记过程中的新趋势，AOP框架的发展提高了针对于化学品风险评估的准确性与可靠性，并进一步的提倡3R原则，保障动物福利，减少不必要的试验和降低试验周期与费用。针对这些新趋势，瑞欧农化和材料事业部技术团队，当前已积累了深厚的技术储备，已完成和进行了多项基于AOP的欧盟内分泌效应评估，如有任何疑问欢迎随时咨询。

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小知识试验动物的3R原则

1．Reduction（减少）指在科学研究中，使用较少量的动物获取同样多的试验数据或使用—定数量的地动物能获得更多实验数据的科学方法。

2．RepIacement（替代）指使用其他方法而不用动物所进行的试验或其他研究课题，以达到某—试验目的。或是使用没有知觉的试验材料代替以往使用神志清醒的活的脊椎动物进行试验的一种科学方法。

3．Refinement（优化）指在符合科学原则的基础上，通过改进条件，善待动物，提高动物福利：或完善实验程序和改进实验技术，避免或减轻给动物造成的与实验目的无关的疼痛和紧张不安的科学方法。

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