基因药物系列（四）——基因编辑（上）

作者：药链圈

基因药物通常由含工程化基因构建体的载体或递送系统组成,其活性成分可为DNA､RNA､基因改造的病毒､细菌或细胞,通过将外源基因导入靶细胞或组织,替代､补偿､阻断､修正特定基因,以达到治疗和预防疾病的目的。基因药物是当今最前沿的药物开发领域之一，在治疗遗传病、癌症、 糖尿病，预防传染病等方面正不断取得突破性进展，主要包括遗传病治疗病毒、溶瘤病毒、基因编辑、mRNA药物、小核酸药物等，本文将重点对基因编辑进行介绍。

图：主要基因药物类型

什么是基因编辑

基因编辑是一种新兴的能够较为精确的对生物体基因组特定目标基因进行修饰的基因工程技术。基因编辑工具是一个由序列特异性的DNA结合结构域和非特异性的DNA修饰结构域组合而成的序列特异性核酸内切酶，基因编辑的过程可以概括为一找、二剪、三修补，识别染色体上的DNA靶位点（找），进行切割并产生DNA双链断裂（剪），诱导DNA的损伤修复（修补），从而实现对指定基因组的定向编辑。简单来说，基因编辑就是利用一个经过改造的蛋白作为工具，对指定的基因进行定向改造。

基因编辑发展历史

在基因编辑诞生前，基因工程技术经历了四十余年的发展历程。从1953年，美国的沃森和英国的克里克提出了DNA双螺旋结构的分子模型开始，人类就已经踏上了破解生命奥秘旅程；上世纪六十年代，科学家通过射线轰击植物，引发了植物遗传基因的随机突变，培育出各种新表现型植物物种。到了七十年代，转基因技术开始蓬勃发展，1973年，科学家成功将抗生素基因片段插入到细菌当中，第一个基因工程生物由此诞生。1974年第一只转基因小鼠问世，为药物开发临床前研究做出了重要贡献。这十年间针对基因工程技术应用的监管体制也开始不断完善。到了八十年代和九十年，基因工程技术开始广泛应用于制药和农业领域。1982年，FDA批准第一个基因工程人类药合成胰岛素上市。1983年诺贝尔奖获得者Klug在非洲爪蟾体内发现了锌指蛋白——ZFP，13年后这种蛋白被用于第一代基因编辑技术。1987年，科学家在大肠杆菌中发现短规律性间隔重复序列（Short Regularly Spaced Repeats, SRSRs)，即后来的规律间隔成簇短回文重复序列——CRISPR，因其高度保守性，当时科学家猜测其一定具有重要的生物学功能。1994年Calgene推出第一个基因工程食物Flavr Savr番茄，这种番茄插入了防止腐烂的基因，使得番茄可以长久保持新鲜。1996年，孟山都公司开始推出一系列经过基因改造的农作物,并受到了市场欢迎。

九十年代末至今的二十余年间，基因编辑技术经历了三代发展。1996年，科学家开始探索第一代基因组定点编辑技术——锌指核酸酶（ZFNs）技术，但直到2002年，也仅在小鼠和果蝇等少数模式生物中实现了同源重组介导的基因组定点编辑，且因同源重组的效率很低，限制了其应用前景。 2007年科学家在发现了植物病原体-黄单胞菌中的转录激活因子效应物-TALEs，同年Horvath研究组首次验证CRISPR能在细菌的免疫功能中起作用。2010年第二代基因编辑技术——转录激活因子效应物核酸酶（TALENs）诞生。2012年，科学杂志将TALENs技术列入了年度十大科学突破列表，同年，维也纳的Emmanuelle Charpentier教授与加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna教授揭示了CRISPR-Cas9基因编辑系统的工作机制。随后第三代基因编辑技术CRISPR/Cas开始迅速发展，2013年张锋等人将CRISPR/Cas系统成功应用到哺乳动物细胞中，很快人们利用CRISPR/Cas系统实现了对斑马鱼、真菌及细菌的基因编辑。2016 年，四川大学华西医院肿瘤中心胸部肿瘤科主任卢铀教授团队使用 CRISPR 技术编辑非小细胞肺癌患者 T 细胞 PD-1 基因的首个人类 I 期临床试验开始。2017年，Sangamo开展了全球首例人体内基因编辑治疗。44岁的Brian Madeux患有先天新陈代谢异常疾病亨特综合症，成为第一个在体内进行基因编辑的人，通过静脉注射，将数十亿矫正基因及一个能精准位置并切断原有DNA的基因编辑工具注入他体。

图：Brian Madeux接受ZFNs基因编辑治疗

资料来源：根据公开资料整理

2019年，中科院的科学家利用CRISPR/Cas9技术制作的基因敲除猴。在CRISPR/Cas9技术发明以前，制作基因敲除的灵长类几乎是不可想象的事情。

图：全球首例基因敲除猴

资料来源：根据公开资料整理

2020年，Emmanuelle Charpentier教授和Jennifer Doudna教授因在CRISPR基因编辑技术中的卓越贡献获得诺贝尔化学奖。

图：2020诺贝尔化学奖得主

资料来源：根据公开资料整理

2020年3月4日，张锋创立的Editas Medicine公司宣布：CRISPR疗法AGN-151587（EDIT-101）治疗先天性黑蒙症10型（LCA10）的I/II期临床试验，已完成首例患者给药。这是全球首个人体内CRISPR基因编辑临床试验，此次也是全球首例CRISPR基因编辑的在体给药。

图：EDIT-101作用原理

资料来源：根据公开资料整理

主要基因编辑技术简介

第一代基因编辑技术——ZFNs技术

ZFNs（锌指核酸酶）技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白（ZFP）发展起来的。ZFNs由特异性识别序列的锌指蛋白(ZFP)和FokI核酸内切酶组成。其中，由ZFP构成的DNA识别域能识别DNA的特异位点并与之结合，而由FokI构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA断裂(DSB)。于是，细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复DNA。HR修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而NHEJ修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。

图：ZFNs作用原理

资料来源：根据公开资料整理

第二代基因编辑技术——TALENs技术

TALENs（转录激活因子效应物）是继ZFNs之后的另一种较为灵活和高效的靶向编辑技术，TALENs在结构上与ZFNs类似，是由特异性的DNA结合蛋白-TALE蛋白和FokⅠ核酸酶两部分组成。TALE蛋白是植物病原体-黄单胞菌分泌的一种转录激活因子效应物，是一类分泌蛋白，在植物细胞中能够特异性地识别并结合寄主靶基因的序列，从而调控寄主的基因表达。进行基因编辑时，两个TALE蛋白识别和结合DNA靶位点，FokⅠ核酸酶负责对靶DNA进行切割，从而造成DNA的DSBs，诱发细胞的DNA损伤修复机制，从而实现对基因组靶位点的编辑。

TALENs的合成与组装相对于ZFNs要简单和灵活，其关键是要合成TALE蛋白串联重复区的编码DNA序列，理论上将多个TALE重复单元编码的DNA序列通过多次连接即可实现，但是要合成这种高度重复序列也具有一定的困难和挑战。目前，已经开发出多种快速、简便合成和组装TALENs方法，如Golden gate (GG)组装法、快速高通量固相合成法等。

图：TALENs作用原理

资料来源：根据公开资料整理

第三代基因编辑技术——CRISPR-Cas技术

CRISPR-Cas技术是基于原核生物(细菌和古生菌)一种免疫系统而开发的，称之为Clustered regularly interspaced short palindro- mic repeats-CRISPR-associated proteins (规律成簇间隔短回文重复及其相关蛋白)，简称CRISPR-Cas系统。由于该技术合成简单、周期短、操作灵活、效率高等优点，目前备受人们关注。CRISPR-Cas工作原理如下1. sgRNA与Cas蛋白结合，形成核糖核蛋白（RNP）复合物2. RNP复合物在sgRNA的引导下，定位到基因组上的靶位点。3. Cas蛋白会识别原间隔基序(protospacer adjacent motif，简称 PAM)，对靶位点的DNA双链进行切割，产生双链断裂（DSB）。4. DSB引起细胞的紧急修复机制：非同源末端连接（NHEJ）修复或者同源重组修复（HDR）5. 绝大多数情况下（>80%），细胞采用NHEJ修复路径，使得靶位点位置随机产生个别碱基的删除或插入（Indel），得到基因敲除模型。6. 极少数情况下（<20%），且细胞内存在同源片段时，细胞采用HDR修复路径，使得靶位点产生精确修复。7. 在同源片段中引入外源基因片段或者突变碱基，可得到基因定点插入模型或者基因定点突变模型

图：CRISPR/Cas9作用原理

资料来源：根据公开资料整理

三种基因编辑技术的比较

作为革命性的基因编辑技术，CRISPR/Cas的优势非常明显，相较于ZFNs和TALENs，CRISPR/Cas的设计难度和构建难度都要小的多，成本更低，开发周期更短，靶向修饰效率更高，此外CRISPR/Cas还具有可以多靶点编辑和可以编辑RNA的优势，这是前两种技术所不具备的。但是CRISPR/Cas有一个明显的缺点，如果靶基因附近没有PAM则无法实现对靶基因的编辑。ZFNs技术作为开发时间最久的基因编辑技术，已经积累了大量临床试验数据，在应用于药物研发方面更为成熟。

图：三种基因编辑技术比较

资料来源：根据公开资料整理

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