多种肿瘤小鼠模型的特点汇总与应用示例

近日，国家癌症中心发布了最新的中国癌症报告。本次报告发布数据为全国肿瘤登记中心收集汇总全国肿瘤登记处2016年登记资料，覆盖人口达3.8亿。报告显示，2016年全年我国新增癌症病例约406.4万例，新增癌症死亡241.35万例；从癌种发病角度看，肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和女性乳腺癌是我国主要的5种恶性肿瘤，占新发病例总数的57.4%；肺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌和食道癌是死亡率排名前5的恶性肿瘤，占死亡总数的69.3%。值得注意的是，不论是发病还是死亡，肺癌均占首位[1]。

图1.最新中国癌症发病及死亡情况

虽然人类的科技水平日新月异，但恶性肿瘤的发生率与死亡率依然居高不下，可以毫不夸张的说，抗肿瘤是一场旷日持久没有硝烟的战争。从化疗到靶向治疗，再到免疫治疗，科学家们想尽一切办法来战胜肿瘤，而无论哪一种方法，都离不开一样秘密武器——小鼠肿瘤模型。

01 小鼠肿瘤模型的诞生

1915年一战期间，日本病理学家Katsusaburo Yamagiwa和他的助理Koichi Ichikawa正在努力研究一个致命武器，这个来自东京大学的二人组花了150多天把煤焦油涂在兔子的耳朵上，最后，他们发现兔子罹患了肿瘤。不管动机如何，Yamagiwa的兔子模型目前通常被认为是首例用于癌症研究的动物模型。不久后，美国加利福尼亚大学旧金山分校的肿瘤生物学家Melissa Reeves等人采用相似方法，在小鼠皮肤局部涂抹名为DMBA和TPA的已知致癌物，诱导小鼠发生了皮肤癌[2]。这是有记录的为人类抗癌事业牺牲的第一批小鼠！
 

现在距第一个动物肿瘤模型诞生已过去100多年，海量的小鼠肿瘤模型被开发出来，我们往往困扰于这样的问题，这些小鼠肿瘤模型到底是怎么构建的？每种模型的特点是什么？最优秀的模型又属哪一个？我该选什么模型？其实吧，每种模型都有其优劣，没有哪种模型能为我们解答所有问题， 因此，了解各类模型的特点，选择适合自己研究的模型，就变得尤为重要。以下，小编就几类使用比较普遍的小鼠肿瘤模型进行简单介绍。

02 小鼠肿瘤模型的选择

小鼠肿瘤模型大致可分为自发性肿瘤小鼠模型、诱发性肿瘤小鼠模型、基因修饰小鼠肿瘤模型、异种移植瘤模型（PDX或CDX）、同种移植型小鼠肿瘤模型（CDA或MDA)等。在选择合适的模型之前，首先考虑自己的实验目的是什么，不同的模型对应不同的试验目的。例如：

• 肿瘤发生发展机制研究：诱发性肿瘤小鼠模型、基因修饰小鼠肿瘤模型等
• 靶点在肿瘤上的抗肿瘤药物筛选和药效评价：PDX模型、CDX模型等
• 肿瘤免疫治疗研究：CDA模型、MDA模型或经过免疫重建的PDX/CDX模型等

 
 2.1   自发性肿瘤小鼠模型

正常的小鼠在大约一年半的生命周期里也有可能罹患癌症，不同品系的小鼠自发肿瘤的几率和类型不同，体现出遗传因素与癌症易感性的关联。

优点：肿瘤的发生、发展与人类相似
缺点：肿瘤的发生参差不齐，周期长，实验耗费大
应用：研究遗传因素与肿瘤发生的关系等

应用示例：分离小鼠自发肿瘤细胞系    
研究者从小鼠自发肿瘤建立起很多可在体外培养传代的肿瘤细胞系，如结肠癌细胞 CT26-WT、黑色素瘤细胞 B16，肝细胞癌细胞 H22，淋巴瘤细胞A20 等，这些肿瘤细胞系不仅为癌细胞的体外生物学研究提供了工具，而且可以移植到遗传背景相同、不会发生免疫排斥的其它小鼠体内，建立移植瘤小鼠模型。
 
2.2   诱发性肿瘤小鼠模型

诱发性小鼠肿瘤模型是指利用化学致癌物诱发的实验性小鼠肿瘤模型。实验室常用的诱导化合物包括MNU（甲基亚硝基脲）、DEN（二乙基亚硝胺）等，可诱导小鼠发生肝癌、胃癌等多种肿瘤，为研究癌症的发生机理及肿瘤预防等提供了有用模型。

优点：诱发因素和条件可人为控制，诱发率相对较高（指高于自然发病率）
缺点：诱导时间较长，动物死亡率比较高，肿瘤出现的时间、部位、病灶数等在个体之间表型不均一
应用：验证可疑致癌因素的作用以及肿瘤预防研究

模型示例：DEN诱导原发性肝癌模型

DEN（二乙基亚硝胺）对人体和动物都具有剧毒，小剂量注射或经口给药就会造成严重的肝损伤，幼鼠腹腔注射后约6个月可建立原发性肝癌模型，是研究肝癌发病机制和过程的理想模型之一。

 
2.3   基因修饰小鼠肿瘤模型

研究发现某基因的过表达，缺失或突变会导致小鼠易发肿瘤，因此可以利用基因工程手段，引入致癌基因或敲除抑癌基因建立自发肿瘤或诱导生成肿瘤的基因工程小鼠模型，再在模型小鼠的基础上进行相应的实验。

优点：适于研究基因和肿瘤的关系，在研究肿瘤发生发展的遗传原因，肿瘤免疫逃避的机理方面具有巨大的优势
缺点：模型建立过程较长，费用较高
应用：研究肿瘤的发病机制，例如环境因素与遗传背景是如何相互作用诱发肿瘤的；人为引入基因突变，为肿瘤标志物的确认，肿瘤的诊断以及治疗都提供了理想的模型
 
模型示例1：抑癌基因条件性敲除模型
人体重要的抑癌基因纯合敲除后往往胚胎致死，如P53、PTEN等，因此构建关键抑癌基因的条件性敲除小鼠，与组织器官特异性表达的Cre工具鼠交配可诱发不同肿瘤，详见下表：
 
模型示例2：癌基因点突变（或条件性点突变）肿瘤模型
某些关键基因虽然仅仅只有1个碱基发生了突变，但由于突变在关键位置，改变了蛋白的重要结构域，破坏了蛋白原有的功能，也会诱发癌症，如：

• Kras-LSL-G12D：野生型Kras激活/失活效应是受控的，而突变型Kras蛋白功能异常，持续处于激活状态，导致肿瘤细胞的持续增殖。目前国际上应用最广泛的肺癌动物模型就是Kras-LSL-G12D小鼠模型，可以通过与肺上皮细胞特异性的Cre转基因小鼠杂交来实现K-ras突变体的激活，从而导致肺癌的发生[3]。
• Apc-L850X：Apc基因是Wnt途径中重要的抑癌基因，对结直肠癌肿瘤的发生发展起到重要作用。Apc-L850X小鼠是通过ENU诱变筛选出来的一个小鼠品系，其Apc基因编码亮氨酸的第850号密码子(TTG)转变成终止密码子(TAG)，从而提前截断蛋白，Apc失去抑癌作用[4]。
• Braf-Flox-V600E：Braf是下游MARK信号通路最强的激活剂之一，Braf在毛细胞白血病中突变率达90%以上,另外还在多种肿瘤组织中发现BRAF V600E突变,如恶性黑色素瘤、甲状腺乳头状癌、结直肠癌等。

模型示例3：癌基因条件性过表达小鼠模型
在小鼠上条件性过表达癌基因（包括激活型突变的癌基因）可以诱发肿瘤，如果同时过表达EGFP、tdTomato等元件，还可以进行活体成像研究，南模生物自主构建了多种基因过表达肿瘤模型，详见下表：
 
除上述常见基因修饰肿瘤模型外，南模生物还自主构建了肺癌、肝癌、胃癌等多种不同肿瘤的敲除、条件性敲除、点突变模型，详情可在公众号咨询我们，或浏览往期推文：
疾病小鼠模型系列之肺癌篇
疾病小鼠模型系列之肝癌篇
疾病小鼠模型系列之胃癌篇
疾病小鼠模型系列之乳腺癌篇
疾病小鼠模型系列之结直肠癌篇

 2.4   病人来源异种移植肿瘤模型（PDX)

病人来源异种移植肿瘤模型（patient-derived xenograft model, PDX）是通过将病人新鲜的瘤组织直接移植到免疫缺陷小鼠体内而建立的肿瘤模型。
 
优点：保存了病人肿瘤组织的基因型和表型的多样性，比较真实的反映原始肿瘤的特性，更准确地反映病人肿瘤的发生发展机制；保存了肿瘤的基质细胞，保存了肿瘤的微环境，能更好地反映肿瘤病人的药物敏感性和耐受性。
缺点：原始肿瘤的主要来源是为手术切除，建模难度高且不能反复获取。此外其构建时间长且成功率不稳定，随着传代次数增加肿瘤微环境也会逐渐被小鼠细胞外基质取代，因此传代次数有一定限制。

应用：新药研发的临床前肿瘤学模型。

模型示例：肝癌PDX
PDX成功从各方面复制病人肿瘤的异质性，包括其分子层面，基因层面和组织层面上的复杂性，能够在不同的临床背景下为药物疗效及分析作出快速测试。
 
2.5   细胞系来源的异种移植肿瘤模型(CDX)

细胞系来源的异种移植肿瘤模型(Cell line-derived xenograft model, CDX)是将体外培养的人源肿瘤细胞系移植到免疫缺陷小鼠体内而构建的肿瘤模型。基于细胞系的肿瘤模型作为经典的体内实验方法，在肿瘤学研究和抗肿瘤药物研发过程中有着极大的需求。
 
优点：动物个体成瘤差异较小，成瘤率高，具有建模时间短，重复性好，成本低等特点。
缺点：接种的肿瘤通常来源于体外培养的同质性癌细胞，缺乏人源肿瘤生长的微环境。(使用重度免疫缺陷小鼠M-NSG等，可以避免上述缺点，让很多难以成瘤的细胞系在小鼠上顺利生长)
应用：研究肿瘤的发展以及对于药物治疗的反应。
 
模型示例1：肝癌模型-HepG2皮下接种
实验室中常用的移植型肝癌模型根据其移植瘤所在部位可以分为原位型和异位型。异位型常通过在实验动物的皮下注射肝癌细胞形成肿瘤。皮下成瘤实验操作简单，成功率高，且肿瘤体积变化易于测量，方便给予局部干预。
  HepG2皮下成瘤的组织学分析。正常的小鼠肝脏组织细胞（左）呈放射状排列，细胞轮廓清晰，胞核圆形居中，肝小叶结构清晰，组织结构形态正常；HepG2 皮下接种4周后形成的肿瘤组织中，细胞排列无序，胞核不清，可见空泡样变性结构，肝小叶结构消失组织结构呈不规则细胞团，符合肿瘤组织结构特征。

模型示例2：活体成像CDX肿瘤模型
带有Luciferase荧光标记的肿瘤细胞系可用于构建各类皮下，原位或转移型的CDX肿瘤模型。Luciferase报告基因系统以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的活性，其优点是可以在小鼠存活的情况下反复测量，分析不同时间点的荧光变化，以此来示踪肿瘤细胞的增殖与转移，数据结果更加真实可信。另外，活体成像技术对于肿瘤微小转移灶的检测灵敏度极高，不涉及放射性物质的使用，非常安全。
  基于人结肠癌细胞系的颅内转移瘤模型。向裸鼠颈动脉注射不同接种量的，带有Luciferase荧光标记的人结肠癌细胞，并选取多个时间点通过活体成像术检测Luciferase在颅内的表达水平。

2.6   同种移植型小鼠肿瘤模型

PDX和CDX模型统称为异种移植瘤模型，与之对应，自然就有同种移植型小鼠肿瘤模型。同种移植型小鼠肿瘤模型又可分为CDA模型（Cell line-derived allograft models，将小鼠来源的肿瘤细胞系接种至免疫健全的近交系小鼠）和MDA模型(Mouse-derived allograft models，将小鼠来源的肿瘤组织接种至免疫健全的近交系小鼠)两类。同种移植型小鼠模型免疫系统健全，可用于研究肿瘤的免疫治疗，常用于目标靶点在免疫系统上的研究中。
 
2.7   免疫检查点人源化模型
有的小伙伴就要问了，那我想要在免疫系统健全的小鼠上研究人源的靶点，例如PD-1、CTLA-4等近几年大火的免疫检查点怎么办？别急，这只需要在免疫系统健全的小鼠上对相应的免疫检查点进行人源化替换即可！南模生物目前拥有300多种人源化小鼠品系（包括双靶标、三靶标、四靶标人源化小鼠），模型资源库涵盖目前最新最热的免疫治疗靶点，成品人源化小鼠目录如下：
 

 

 

 

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03小鼠肿瘤模型优缺点比较

看完今天的介绍，相信大家对小鼠肿瘤模型已经有了一个整体的了解，我们在真正选择小鼠肿瘤模型时需要根据自己的实验设计，考虑各种模型的优缺点，这里小编也将各个模型按照类似性、重复性、可靠性作一个评价，详见下表。最后，祝大家都能找到合适的肿瘤模型，实验一帆风顺!
 

南模生物深耕基因编辑领域，提供全方位模式生物服务，包括基因修饰成品模型供应、个性化模型定制、饲养繁育、表型分析、药效评价等，满足不同实验室需求。

参考文献
1.Cancer incidence and mortality in China,2016; Journal of the National Cancer Center
2.Mike May. (2018) Cancer research with a human touch. Nature, 556: 259-261.
3. Jackson, E.L., Willis, N., Mercer, K., Bronson, R.T., Crowley, D.,Montoya, R., Jacks, T., Tuveson, D.A., 2001. Analysis oflung tumor initiation and progression using conditionalexpression of oncogenic K-ras. Genes Dev. 15, 3243e3248.
4.Su L K , Kinzler K W , Vogelstein B , etal. Corrections and Clarifications: Multiple Intestinal Neoplasia Caused By aMutation in the Murine Homolog of the APC Gene[J]. Science, 1992,256(5060):1114-1114.