English | 中文版 | 手机版 企业登录 | 个人登录 | 邮件订阅
当前位置 > 首页 > 技术文章 > PCR 核酸检测技术原理和案例分析
选型 | 市场 | 应用 | 使用 | 法规 | 技术 | 其他

PCR 核酸检测技术原理和案例分析

浏览次数:7326 发布日期:2021-9-24  来源:MedChemExpress
 
核酸检测是咋回事?
 

首先我们需要知道:就现有检测手段来说,检测的是样品中病毒核酸片段,而非完整的病毒核酸,更不是活病毒。新冠患者治愈后,活病毒被免疫系统清除,但是体内可能仍然存在病毒核酸碎片,因此核酸检测结果仍可能呈阳性。此时的阳性结果,不代表患者体内一定存在完整的病毒核酸或者活病毒!

 

目前核酸检测主要的操作是,采取咽拭子或鼻拭子,取样后,做病毒核酸的实验室检测:提取标本中的 RNA,并逆转成 cDNA,用病毒 cDNA 的特异性引物进行 PCR 扩增。如扩增的产物,出现病毒特异性的 DNA,则病毒核酸检测结果为阳性。

 

新型冠状病毒 (SARS-CoV-2) 是一种 RNA 病毒,新冠病毒患者样本含病毒的遗传物质 RNA,核酸检测大概率呈阳性。(核酸结果阴性也不能排除病毒感染,要结合症状、血常规及肺部 CT 等检查,逐一分析,综合判断。)

 

 
应用 PCR 技术进行核酸检测
 
 
PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应):基本原理类似于 DNA 的体内复制,特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。新型冠状病毒是一种 RNA 病毒,所以我们主要介绍一下 RT-PCR。
 
RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,逆转录聚合酶链式反应) 提取组织或细胞中的总 RNA,以其中的 mRNA 为模板,采用 Oligo(dT) 或随机引物,利用逆转录酶反转录成 cDNA。再以 cDNA 为模板进行 PCR 扩增,而获得目的基因或检测基因表达。
 

基于 RT-PCR 进行的核酸检测[1]

 

RT-PCR 可以定性,但不能定量。所以这里我们需要介绍一下它的升级版——实时荧光定量 PCR (Real-time RT-PCR),就是结合了荧光定量技术的反转录 PCR:先从 RNA 反转录得到 cDNA,然后再用 Real-time PCR 进行定量分析。在反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号累积实时监测整个 PCR 进程。最后通过标准曲线对未知模板进行总量分析或通过 Ct 值对模板进行相对定量分析。
 
 
案例分析
 
 

 

实验设计:

分别以 SYBR Green qPCR Master Mix、Primer 和 ddH2O 点样跑电泳。

 

问题:

为什么单独用 Mix 跑核酸电泳会有一个小条带?

 

萌 Cece 解答:

此款 qPCR Mix 所用的酶为配体法修饰的热启动 DNA 聚合酶,该配体为核酸。因此直接用酶跑电泳时,会存在一个小条带。


收!说了这么多,讲重点!针对核酸检测中的假阴性问题,有没有完美的解决方案呢?

额~目前还没有新冠检测筛查金标准。所以联合检测手段是目前比较可靠的方式,即同时应用 2 种或 2 种以上诊断方式来检测。目前的检测手段有鼻拭子和咽拭子、肺泡灌洗液检验、血液抗体检测、粪便和肛拭子,及胸片/CT 等影像学等手段,还可以结合环境样本和阴性对照做验证排除。

 

多种新冠病毒检测手段阳性率的对比[2]

 

做 PCR 时出现假阴性是什么原因呢,又该怎么应对?别担心,萌 Cece 有妙招!
 
问题 1:模板问题

萌 Cece 分析解答:模板可能包含杂蛋白。建议配制稳定有效的消化处理液。同时,模板的溶解液固定不变 (比如:Tris-HCl 缓冲液)。

 

问题 2:引物问题

萌 Cece 分析解答:引物可能质量不太好,或者浓度设计不合适,及引物设计不合理,如长度不够,引物本身或两条引物之间形成二聚体等。建议更换引物。引物应高浓度小量分装保存,以防止反复冻融或长期冷冻保存,导致引物的变质降解失效。

 

问题 3:Mg2+ 浓度

萌 Cece 分析解答:Mg2+ 浓度对 PCR 扩增效果影响极大,浓度过高可降低 PCR 扩增的特异性,过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败,出现假阴性。建议设置一组反应,每一反应中的其他离子浓度相同 (如 Tris、KCl 等),而 MgCl2 浓度不同,来摸索最佳浓度。

 

问题 4:设计因素

萌 Cece 分析解答:变性温度低,时间短;退火温度过高,影响引物与模板的结合而降低扩增效率;延伸时间过短。建议提高变性温度,延长变性时间,尤其首次循环。退火温度应根据 Tm 值来设定。延伸时间必要时适当延长。

 

除此之外,就是最讨厌的“出现非特异性扩增带


萌 Cece 分析解答:Mg2+ 浓度过高,退火温度过低,PCR 循环次数过多;酶的质量不过关;引物与靶序列不完全互补,或引物聚合形成二聚体,都有可能出现非特异性扩增带。建议适当提高退火温度;更换新酶;降低引物量,适当增加模板量,减小循环次数。必要时重新设计合成引物。

 

说这么多就不得不提一下我们 MCE 众多的 Pre-Mix 即用型预混液,操作 so easy!

 

相关产品

SYBR Green qPCR Master Mix

2× 浓度的即用型预混液,含有 qPCR 的所有组分, 只需加入样品 DNA,引物和水即可快速高效完成 qPCR 反应。

RT Master Mix for qPCR

高效、快速的即用型预混液,含有反转录反应所需的所有组分,只需加入 RNA 和 RNase-free H2O 即可快速高效完成反转录反应。

RT Master Mix for qPCR (gDNA digester plus)

高效、快速的反转录试剂,含有反转录反应所需的所有组分,只需加入 RNA 模板和 RNase-free H2O 即可快速高效完成反转录反应,并同时有终止 gDNA digester 的作用,保证 cDNA 的完整性。

SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX)

2× 浓度的即用型预混液,含有 qPCR 的所有组分, 只需加入样品 DNA,引物和水即可快速高效完成 qPCR 反应。本品内含 High ROX Reference Dye,适用于需要校正孔间荧光信号误差的仪器。

SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX)

2× 浓度的即用型预混液,含有 qPCR 的所有组分,只需加入样品 DNA,引物和水即可快速高效完成 qPCR 反应。本品内含 Low ROX Reference Dye,适用于需要校正孔间荧光信号误差的仪器。

SYBR Green qPCR Master Mix (No ROX)

2× 浓度的即用型预混液,含有 qPCR 的所有组分, 只需加入样品 DNA,引物和水即可快速高效完成 qPCR 反应。本品不含 ROX Reference Dye,适用于无需校正孔间荧光信号误差的仪器。

2× PCR Master Mix (with Dye)

高效、快速的 2× 浓度的即用型预混液 (含溴酚蓝),含有常规 PCR 反应所需的所有组分 (样品 DNA,引物和水除外)。

2× Fast PCR Master Mix (with Dye)

用于快速 PCR 扩增的 2× 浓度的即用型预混液 (含溴酚蓝),含有除样品 DNA、引物和水外的所有 PCR 成分。

2× High-Fidelity PCR Master Mix

新型高保真高效率的即用型 PCR 扩增预混液,适用于高难度长片段的 PCR 扩增实验。

MCE 的所有产品仅用作科学研究或药证申报,我们不为任何个人用途提供产品和服务

 

 

参考文献

1. Nidhi Verma, et al. Emerging diagnostic tools for detection of COVID-19 and perspective. Biomed Microdevices. 2020 Nov 24;22(4):83.

2. Wenling Wang, et al. Detection of SARS-CoV-2 in Different Types of Clinical Specimens. JAMA. 2020 May 12; 323(18): 1843-1844.

索取资料
来源: 上海皓元生物医药科技有限公司
联系电话:021-58955995
E-mail: sales@medchemexpress.cn
【 点击可查看 上海皓元生物医药科技有限公司 相关产品】

标签: 核酸检测 PCR
分享到: QQ空间 新浪微博 腾讯微博 微信
用户名: 密码: 匿名 快速注册 忘记密码
评论只代表网友观点,不代表本站观点。 请输入验证码: 8795
更多 本类文章
  •   活性氧 ROS 的检测方法及在癌症研究中的应用
  •   抑制剂JSH-23助力开发可酸化的肿瘤疫苗纳米佐剂
  •   线粒体移植技术综述及其在体外、体内和临床的应用前景
  •   探究人类步行速度与端粒长度的关系以及对健康长寿的影响
  •   重组胰蛋白酶(冻干粉/液体)-药典级说明书
  •   COFs材料在吸附分离、生物医药、催化、环境等领域应用文献盘点
  •   治疗自身免疫疾病关键性靶点TNF-α的分类及市场规模
  •   人抑制素B(INH-B)试剂盒说明书
更多 本类新闻
  •   MCE中国端午活动:玩游戏选化合物周边赢多种好礼
  •   MCE中国六月参展预告, 邀您现场抽奖好礼带回家
  •   科德角上线美国FDA认证ISO双重质量标准灭菌指示剂
  •   MCE夏日嘉年华:活性化合物重组蛋白染料等享折扣
  •   赛默飞化学品全新官网来袭,新注册就送定制冰箱贴
  •   西美杰成功参加第二十三届中国生物制品大会
  •   MCE诚聘商务助理、产品专员/主管、平面设计师等
  •   MCE直播:深度解析外泌体课题研究思路与研究方法
    相关推荐
  • BRAND助吸器、分液器等移液产品促销来袭,买就送耗材
  • 能量代谢产品面向全国寻找合作伙伴,快来一起开拓市场吧
  • AMPure XP 核酸纯化试用装申请
  • VACUUBRAND隔膜泵促销活动来啦,赠好礼,享三年质保!
  • 当现有的液相色谱检测器无法满足要求怎么办?
  • 立刻来Medtec China 与千家企业共探实验室仪器&质量管理千亿容量市场!
  • “以旧换新”--普兰德助力实验室设备仪器更新,效率升级!
  • 通量和功能的提升-酷搏q900高通量384孔荧光定量PCR仪
  • 贝克曼库尔特生命科学首款国产化Allegra C-34R台式高速冷冻离心机震撼上市
  • 丹家智选商城正式上线:开启全新整合式多品牌原厂直销云采购新体验

Copyright(C) 1998-2024 生物器材网 电话:021-64166852;13621656896 E-mail: info@bio-equip.com

深圳SEO优化公司酒泉营销网站石家庄网站优化软件推荐宜昌网站推广工具黄石网站改版哪家好镇江网站搜索优化公司阿坝百度关键词包年推广价格广元网站优化排名价格阿坝网站改版哪家好衢州网站推广工具价格朔州网站优化多少钱崇左网站推广工具推荐坪山网站推广报价河源关键词按天计费兴安盟百度竞价推荐金华SEO按天收费公司南昌seo优化哪家好营口网站建设设计蚌埠高端网站设计价格果洛百度网站优化排名公司海南网站优化排名哪家好杭州品牌网站设计哪家好果洛网站排名优化公司重庆品牌网站设计公司云浮外贸网站制作报价滨州外贸网站设计多少钱桐城关键词按天扣费公司成都模板推广公司和县seo网站优化公司大连百搜标王大鹏外贸网站设计公司歼20紧急升空逼退外机英媒称团队夜以继日筹划王妃复出草木蔓发 春山在望成都发生巨响 当地回应60岁老人炒菠菜未焯水致肾病恶化男子涉嫌走私被判11年却一天牢没坐劳斯莱斯右转逼停直行车网传落水者说“没让你救”系谣言广东通报13岁男孩性侵女童不予立案贵州小伙回应在美国卖三蹦子火了淀粉肠小王子日销售额涨超10倍有个姐真把千机伞做出来了近3万元金手镯仅含足金十克呼北高速交通事故已致14人死亡杨洋拄拐现身医院国产伟哥去年销售近13亿男子给前妻转账 现任妻子起诉要回新基金只募集到26元还是员工自购男孩疑遭霸凌 家长讨说法被踢出群充个话费竟沦为间接洗钱工具新的一天从800个哈欠开始单亲妈妈陷入热恋 14岁儿子报警#春分立蛋大挑战#中国投资客涌入日本东京买房两大学生合买彩票中奖一人不认账新加坡主帅:唯一目标击败中国队月嫂回应掌掴婴儿是在赶虫子19岁小伙救下5人后溺亡 多方发声清明节放假3天调休1天张家界的山上“长”满了韩国人?开封王婆为何火了主播靠辱骂母亲走红被批捕封号代拍被何赛飞拿着魔杖追着打阿根廷将发行1万与2万面值的纸币库克现身上海为江西彩礼“减负”的“试婚人”因自嘲式简历走红的教授更新简介殡仪馆花卉高于市场价3倍还重复用网友称在豆瓣酱里吃出老鼠头315晚会后胖东来又人满为患了网友建议重庆地铁不准乘客携带菜筐特朗普谈“凯特王妃P图照”罗斯否认插足凯特王妃婚姻青海通报栏杆断裂小学生跌落住进ICU恒大被罚41.75亿到底怎么缴湖南一县政协主席疑涉刑案被控制茶百道就改标签日期致歉王树国3次鞠躬告别西交大师生张立群任西安交通大学校长杨倩无缘巴黎奥运

深圳SEO优化公司 XML地图 TXT地图 虚拟主机 SEO 网站制作 网站优化