为了获知这两个转录因子在D型运动神经元中的所有靶基因，该实验室首先利用CRISPR-Cas9技术将GFP分别插入到unc-30和unc-55基因的末端，得到表达UNC-30::GFP和UNC-55::GFP融合蛋白的秀丽线虫，再对利用所获秀丽线虫进行ChIP（染色质免疫共沉淀）实验。通过对原有ChIP实验方法进行改进和优化，克服了两个转录因子秀丽线虫中表达量小、表达时间窗口短、表达的D型神经元细胞占秀丽线虫细胞比例少（约占2%）等瓶颈，成功地完成了ChIP实验，拿到了可供高通量测序（ChIP-seq）的DNA样品。这也是第一次实现了在多细胞动物中原位表达水平转录因子的ChIP-seq实验。转录因子是调控细胞中从DNA上读取信息转录产生RNA的一大类蛋白质因子，针对特定转录因子的ChIP-seq实验，可以在全基因组水平获知受其调控的所有靶基因。

该研究揭示这两个转录因子各自均调控2000多个基因（秀丽线虫约有2万个基因）的表达，而且非常有意思的是，它们共同调控1300多个编码和非编码基因的表达。这些靶基因在对神经元发育和可塑性具有重要调控作用的多个信号通路中行使功能。其中一个通路是决定环腺苷酸（cAMP）浓度的cAMP代谢通路。为了直接观测活体秀丽线虫细胞中的cAMP浓度变化，作者开创性地将用于哺乳动物细胞中检测cAMP水平的探针改造为在活体秀丽线虫中也可以使用工具。进一步的研究揭示，这两个在动物界高度保守的转录因子通过调节神经元中的基因表达，调控了细胞中cAMP的浓度，进而在时间上影响D型运动神经元发育和可塑性的进程。另外，UNC-30和UNC-55是从秀丽线虫到人均具有的高度保守的转录因子，从全基因组水平上获得了UNC-30和UNC-55调控的靶基因，为进一步探索动物细胞中转录因子调控网络提供了重要的基础。

文章的第一作者是博士生余斌。研究得到了科技部、中科院、国家基金委以及中国科大非编码RNA功能及功能机理创新团队的经费支持。

(生命科学学院、科研部）

论文链接： http://www.cell.com/developmental-cell/fulltext/S1534-5807(17)30765-7