锰元素的免疫激活研究与应用

锰（Manganese，Mn）是过渡金属元素，原子序数为25。锰在地壳中含量丰富，是排名第5的金属。锰容易被氧化，因此常以氧化物、碳酸盐和硅酸盐的形式存在。锰元素有多种化合价，包括+2、+3、+4、+6和+7，在机体中常常是以+2或+3价存在，+2价是最稳定的价态，+3价易被歧化成+2价和+4价。锰是一种机体必须的微量元素，对于机体免疫系统、生殖系统、血糖水平、骨骼生长、凝血反应、机体活性氧水平的调控都十分重要。锰发挥功能是通过与蛋白结合调控其活性，包括氧化还原酶、水解酶、连接酶、裂解酶、转移酶、异构酶、精氨酸酶、谷氨酰胺合成酶、磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶和锰超氧化物歧化酶。哺乳动物中锰元素的含量大约是0.3-2.9 μg/g湿组织，是动物中含量最高的几种元素之一。锰在不同组织、不同细胞及不同细胞器中的分布差异很大，而锰的检测又很不方便，没有特异性的探针或者螯合剂，因此锰的生理学功能知之甚少。近些年，锰离子在免疫方面的功能逐渐被揭示，锰离子作为一种可能的第二信使对于机体内的信号转导和免疫调控都有着重要作用。

锰元素在体内的转运受到严格调控，美国FDA推荐成年人每天的锰摄入量大约2 mg，但只有3~5%的锰会被生物吸收利用，其吸收取决于胃液酸度和锰化合物的溶解度。大约97%的食入锰通过肝脏和胆汁代谢并由粪便排出。机体内有多种锰元素转运通道调控锰的转运，转入通道有：ZIP8、ZIP14、NRAMP2、Transferrin等；转出通道有：ZnT10、FPN1、TMEM165、SPCA1、ATP13A2等。

1983年，Rogers等报道了锰离子能激活自然杀伤性细胞（NK细胞），给小鼠注射氯化锰溶液能增强 NK 细胞的杀伤能力，同时能检测到I-型干扰素的上调⁽²⁾。Smialowicz等发现给小鼠注射氯化锰溶液能增强腹腔巨噬细胞的吞噬能力，增强脾脏细胞的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用，且增强效果与氯化锰诱导的I-型干扰素相关，暗示锰离子也能增强适应性免疫反应⁽³⁾。Srisuchart等给小鼠每天腹腔注射氯化锰溶液，4 周后小鼠脾脏淋巴细胞的增殖能力增强，再用抗原刺激淋巴细胞增殖时有很强的协同作用，10 mg/kg 的氯化锰处理能增强混合淋巴反应⁽⁴⁾。

最近随着人们对胞内识别DNA的cGAS-STING通路研究的深入，锰离子在天然免疫信号通路中的作用逐渐被揭示。cGAS负责识别细胞质中游离的双链DNA（dsDNA）并合成第二信使2’3’-cGAMP，后者结合并激活下游的接头蛋白STING，STING招募激酶TBK1和转录因子IRF3/7激活下游I-型干扰素及炎症因子的表达。高璞等发现cGAS合成2’3’-cGAMP需要dsDNA、GTP、ATP和金属离子的存在，金属离子可以是Mg²⁺或Mn^{2+ (5)}。北京大学生命科学学院的蒋争凡教授团队发现病毒感染细胞时，储存在线粒体和高尔基体中的锰会被释放到细胞质中，浓度可高达20 μM。而在体外培养的细胞中，2-5 μM的Mn²⁺处理THP1细胞可显著抑制病毒的感染和复制。通过基因敲除细胞和基因敲除小鼠实验，蒋争凡团队证实细胞器中释放出来的Mn²⁺能特异性激活cGAS-STING通路，诱导I-型干扰素和炎症因子产生；Mn²⁺可以使cGAS对DNA的敏感性提高上万倍⁽⁶⁾。随后，Hooy等报道锰离子可以不依赖dsDNA直接激活cGAS，并且提升cGAS的催化效率⁽⁷⁾。蒋争凡实验室与北大生科院苏晓东实验室的合作研究进一步证实了锰离子激活cGAS的dsDNA不依赖性，他们的晶体结构研究显示锰离子与cGAS结合导致的cGAS构象变化类似于cGAS-DNA结合。更重要的是，锰离子直接激活的cGAS催化cGAMP合成时，由于锰离子在cGAS催化口袋中位置不同，产生的二核苷酸线性中间体pppG(2’5’)pA不需经过翻转即可进行第二步催化，因此反应效率更高⁽⁸⁾。

近年的研究表明天然免疫对肿瘤的免疫监视至关重要，如自然杀伤细胞（NK）可以不依赖抗体和补体直接杀伤肿瘤细胞，巨噬细胞（Mφ）和树突状细胞（DC）负责发现肿瘤细胞并将肿瘤抗原递呈给并激活细胞毒性T细胞（CD8⁺ T细胞），后者特异性识别、杀灭肿瘤细胞。肿瘤细胞则进化出了一系列逃逸机制，以躲避宿主免疫系统的攻击。其中以上调免疫检查点分子的表达最为著名，如肿瘤细胞高表达PD-L1和/或CTLA-4抑制T细胞的活化。PD-1和CTLA-4抗体的临床应用是当今最令人激动的突破和国际公认最有前景的癌症治愈手段，获得了2018年的诺贝尔生理学或医学奖。然而，免疫检查点抑制剂只对大约20%的肿瘤患者有效，如何提高肿瘤患者对免疫治疗的反应性是最关键的问题。近期一系列的研究发现，肿瘤组织中（旁）Mφ和DC的cGAS-STING可被肿瘤细胞来源的DNA激活，促进这些抗原递呈细胞的成熟，进而将肿瘤特异性抗原递呈给T细胞，对于激活机体的抗肿瘤免疫反应起到至关重要的作用。目前全球许多科研机构和制药公司纷纷投入巨资，寻找cGAS-STING通路的激动剂。然而目前已知的这些激动剂大多制备复杂，成本高昂，而且无法有效进入细胞，因此治疗效果不理想。由于锰离子可以直接激活cGAS-STING通路，蒋争凡团队与解放军总医院生物治疗科韩为东教授团队合作研究发现锰在机体免疫监视肿瘤中也发挥必不可少的作用。缺锰小鼠体内的肿瘤细胞生长显著加快、肿瘤肺转移显著增多；外源添加Mn²⁺显著促进小鼠体内抗原递呈细胞对于肿瘤抗原的递呈能力，促进NK细胞和细胞毒性T细胞在肿瘤组织内的浸润和肿瘤特异性杀伤。他们提出Mn²⁺和PD-1抗体联合使用的“锰免疗法”在多种肿瘤模型中都可以显著增强PD-1抗体的肿瘤治疗效果，并减少PD-1抗体的使用量。如果把肿瘤的免疫治疗看成是一辆行驶的汽车，那么PD-1抗体的使用相当于解除了汽车的刹车（松刹车），而cGAS-STING激活剂（如Mn²⁺）的使用则像是给发动机加油（踩油门）。只有二者同时使用，才能使肿瘤免疫治疗这辆汽车全速行驶⁽⁹⁾。I 期临床试验初步证实了“锰免疗法”在复发难治及进展期肿瘤中的临床安全性和有效性，目前该方案在单病种中的 II 期临床正在有序推进。类似的锰离子通过激活cGAS-STING通路，进而促进CD8⁺ T细胞活化的肿瘤治疗方法也被国立新加坡大学的刘海燕实验室及郑州大学张振中实验室所证实^(10,11)。

基于锰离子能强烈激活cGAS-STING通路产生大量干扰素等细胞因子和趋化因子，而这些细胞因子和趋化因子对于免疫反应活化非常重要，蒋争凡团队开发出新型纳米锰合物佐剂(MnJ)，既是免疫激活剂，又是递送系统。动物实验表明MnJ佐剂能显著增强灭活病毒、重组蛋白、肽段、多糖类抗原的免疫效果，不仅可以激活体液免疫，也能激活细胞免疫及黏膜免疫，尤其是细胞毒性T细胞免疫反应⁽¹²⁾。目前人用疫苗中的铝佐剂在激活细胞免疫方面效率较低，因此无法发挥有效的抗病毒和抗肿瘤的效果，动物疫苗中常用的白油佐剂存在着生物兼容性差、毒副作用较强的问题。疫苗企业都在积极推动能同时激活细胞免疫和体液免疫的新佐剂研发。另一方面，上述这些佐剂绝大多数依赖进口，属于“卡脖子”产品。锰元素作为一种生物必需的微量元素，具有很好的生物安全性，且在机体内的平衡受到严格的调控，在免疫佐剂方面有着巨大的应用潜力，可用于抗体制备、疫苗研发和肿瘤治疗。动物实验的结果表明锰佐剂效果优于传统铝佐剂、白油佐剂和弗氏佐剂，有六大优势：

（1）激活细胞免疫，可用于抗病毒、抗肿瘤。

（2）激活体液免疫，抗体产生速度快、浓度高。

（3）可用于黏膜免疫吸入使用，非常方便。

（4）普适性高，肽、病毒、多糖，效果优异。

（5）无可见的毒副作用。

（6）无需乳化，直接使用，非常方便。

此外，含锰的纳米颗粒也被应用于肿瘤治疗和成像检测。肿瘤微环境（TME）的特点是低氧、酸性 pH、活性氧自由基（ROS）的升高， Xiao Yu Wu等用一种含有二氧化锰的多功能胶体颗粒（A-MnO₂ NPs） 来调节 TME，二氧化锰能与过氧化物反应，产生氧气和升高 pH，同时还能下调促进肿瘤生长和侵染的两个调控因子——低氧诱导因子 HIF1α和血管内皮生长因子 VEGF⁽¹³⁾。泰乐影（锰福地吡三钠注射液）是一种已上市的磁共振造影剂，用于疑有转移性或肝细胞癌等肝脏病变的检查。锰福地吡主要被肝脏摄取，其增强特性主要源于二价锰离子外层有5个不成对电子，不成对电子与水分子核之间的相互作用可以明显缩短组织的T₁弛豫时间，而对T₂弛豫时间没有影响。

综上所述，免疫佐剂增强机体对抗原的免疫应答，产生更强的免疫保护作用和更长时程的免疫记忆，对于提升疫苗作用效果及促进肿瘤的免疫治疗具有重要意义。另一方面，免疫佐剂的使用可减少抗原或者免疫检查点抑制剂（如PD-1抗体）的使用量，对老年、儿童及肿瘤患者等免疫力低下人群意义重大。在各种治疗性疫苗特别是肿瘤的个性化免疫疫苗之中，佐剂的使用也将极大地推动个性化疫苗的研发及使用。